Anti-inflammatory Effects of Aurantio-obtusin isolated from Cassia tora L. in RAW264.7 Cells

결명자로부터 분리된 Aurantio-obtusin의 항염증 활성

Abstract

Cassia tora L. have been used as a folk medicine in Korea. This study investigated anti-inflammatory effect of aurantio-obtusin isolated from C. tora. We isolated aurantio-obtusin from 50% ethanol extracts of C. tora L. We investigated the anti-inflammatory effects of aurantio-obtusin on the lipopolysaccharide (LPS)-stimulated inflammatory response in murine macrophage cell line (Raw 264.7). To investigate the cytotoxicity of aurantio-obtusin on RAW 264.7 cells, MTS assay was performed. RAW 264.7 cells were treated with aurantio-obtusin at different concentrations (12.5, 25, 50, $100{\mu}M$) for 30 h. The result showed that aurantio-obtusin had no cytotoxic effect in a concentration range of $12.5-100{\mu}M$. To determine the effect of aurantio-obtusin on LPS-induced NO production, the NO concentration measurement was performed. RAW 264.7 cells were treated with aurantio-obtusin at 12.5, 25, 50 and $100{\mu}M$ for 24 h, and the results showed that the NO production of aurantio-obtusin-treated cells compared to LPS alone treated group was significantly decreased in a dose-dependent manner. Pretreatment of aurantio-obtusin inhibited LPS-induced NO production in a dose-dependent manner. To find out inhibitory mechanisms of aurantio-obtusin on inflammatory mediators, we examined the $PGE_2$ pathways. As a result, $PGE_2$ were decreased in a dose-dependent manner by aurantio-obtusin. The release of interleukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$) and IL-6 were also reduced. Moreover, aurantio-obtusin suppressed LPL-induced $I{\kappa}B-{\alpha}$ degradation. These results suggest that the down regulation of NO, $PGE_2$, IL-$1{\beta}$ and IL-6 expression by aurantio-obtusin are achieved by the downregulation of NF-${\kappa}B$ activity.

염증(inflammation)이란 생체방어기작으로 물리적인 충격이나 화학물질, 세균 감염 등의 자극에 대항하는 것을 말한다. 이 과정에서 다양한 세포와 사이토카인들이 관여하게 되는데, 외부자극원으로 그람 음성균의 구성물질인 lipopolysaccharide(LPS), 내부자극원으로 arachidonic acid 대사체 등을 주요 매개로 하여 세포대세포 상호작용, 염증성 세포의 염증부위로의 이동 및 표적항원의 붕괴 등 여러 면역반응을 일으키게 된다.¹⁾

대식세포(macrophage)는 선천면역과 적응면역 등 다양한 면역반응에 관여하는 세포로 알려져 있다. 대식세포는 직접적으로 항원들을 제거해 면역반응에 관여 하는 M1과 항상성, 조직손상복구 대사작용 등에 관여해 광범위한 생리학적 역할을 하는 M2의 두 종류로 나뉜다. 항원에 의해 활성화된 대식세포는 일산화질소(NO)와 interferon gamma(IFNγ), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6(IL-6) 및 interleukin-1β(IL-1β)와 같은 염증매개성 사이토카인 분비를 촉진시켜 감염초기 생체방어에 중요한 역할을 한다.²⁾

결명자(決明子)는 콩과(Leguminosae) 식물인 결명자(Cassia tora L.), 결명(C. obtusifolia L.: 決明)의 종자를 말린 것으로 예로부터 차로 이용해 왔으며, 한방에서는 결명자가 청간명목(淸肝明目), 윤장통변(潤腸通便) 등 눈의 피로와 간열을 내리고, 습관성 변비 등의 치료에 이용 되어 왔다.^3,4) 결명자를 이루는 주요 성분은 anthraquinones, anthroquinone glycoside, naphtahlene 유도체, emondin과 포도당으로 변하는 배당체가 함유되어 있으며,^3,4) 장의 연동 촉진,⁵⁾ 간 보호, 면역 증강의 약리 효과가 보고되었다.^6-8)

최근 연구에서는 결명자의 성분인 aurantio-obtusin이 전신 동맥을 안정화 시켜 고혈압 예방에 도움을 주고,⁹⁾ IgE 매개 비만세포 및 아나필락시스반응 등 알러지 작용 억제 효능이 보고 되었으나,¹⁰⁾ 항염증에 관한 연구는 미비하였다. 따라서 본 연구에서는 aurantio-obtusin을 이용해 대식세포주인 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도시킨 염증반응을 관찰하여 결명자의 염증치료가능성을 보고자 한다.

 

재료 및 방법

 

실험재료

본 실험에 이용한 결명자는 2015년 6월에 전남 장흥에서 구입 해 목포대학교 한약자원학과 김휘 교수의 동정 후 실험에 이용하였고, 표본(표본번호: TKMII-9)은 한약진흥재단 한약재연구팀에서 보관하였다.

시약 및 기기

결명자의 추출 및 성분 분리에 사용된 methanol, n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, n-butanol은 DAEJUNG(Korea)에서 구입하였다. 성분 확인을 위한 박층크로마토그래피(TLC, Thin layer chromatography)는 TLC plates(Silica gel 60 F254, Silica gel 60 RP-18 F254S)를 사용하였으며, 성분 분리를 위한 고정상은 silica gel(70-230 mesh, Merck, Darmstadt, Germany)과 ODS gel(50 μm, 1.2 Kg YMC, Koyto, Japan)을 구입해 사용하였다. HPLC(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용해 성분 스크리닝을 진행하였으며, LC-IT-TOF MS(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 통해 성분의 추적 및 분리 성분의 구조 동정을 위한 분자량과 분자식 측정이 이루어졌다. LC와 LC-MS 분석에는 Water, Acetonitrile(Phillipsburg, NJ, USA), Formic acid(DAEJUNG, Korea)를 구입해 사용하였다. 분리한 성분은 Sigma aldrich Inc.(UK)의 DMSO-d₆를 사용해 용해시켰으며,  Varian 600 spectrometer를 이용해 NMR(Nuclear magnetic resonance) spectrum을 측정하였다. Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)과 fetal bovine serum(FBS), Penicillin-Streptomycin는 Gibco/BRL(Eggenstein- Leopoldshafen, Germany)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfo–phenyl)-2H-tetrazolium(MTS), inner salt; phenazine ethosulfate(PES)가 포함된 The CellTiter 96^Ⓡ AQueous One Solution Cell Proliferation Assay와 Griess reagent system은 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. Lipopolysaccaride(LPS), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma Chemical Co.(St. Lousi, MO, USA)에서 구입하였고, PGE2 ELISA kit은 Enzo Life Sciences Co.(Farmingdale, NY, USA)에서 구입하였고, IL-1β, IL-6의 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) Kit는 R&D systems(DuoSet ELISA Development Systems, MN, USA)에서 구입하였다. IκB-α antibody, DAPI는 Cell Signaling Technology, Inc.(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.  Anti-rabbit FITC conjugate antibodies는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입하였다.

지표물질 분리

결명자 5 kg을 50% ethanol로 80℃에서 3시간, 3회 반복 환류 냉각 추출 하였으며, 이를 50℃ 이하의 중탕에서 감압농축해 358 g의 추출물을 얻었다. 추출물을 증류수에 현탁 시킨 후 ODS gel(50 μm, 1.2 Kg YMC)을 이용한 Open column chromatography를 진행하였다. 고정상인 ODS gel을 Glass Column(16 cm x 60 cm)에 충진하여 water와 acetonitrile을 이동상으로 전개하였으며, 19개의 소분획물을 얻었다(MJ90-1~19). 각각의 분획물은 LC IT-TOF MS(shimadzu, japan)를 이용해 스크리닝 하였으며, 분자량 측정을 통해 소분획물의 타겟성분을 추적하였다. 측정된 성분이 포함된 소분획물은 LC/MS 및 TLC를 이용해 분리 조건 설정 및 정제를 진행 하였다. 소분획물 16과 17을 Silica gel(70-230mesh, Merck, Germany)을 이용한 순상 컬럼크로마토그래피를 n-Hexane: EtOAc=2: 1 ~ 1: 1의 비율로 실시하여 MJ90-1617-1(Aurantio-obtusin )을 분리하였다.

Aurantio-obtusin (MJ90-1617-1) - Yellow powder; ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) 13.25 (1H, s, 8-OH), 7.76 (1H, s, H-4), 7.16 (1H, s, H-5), 3.83 (3H, s, 7-OCH₃), 3.80 (3H, s, 1-OCH₃), 2.28 (3H, s, 3-CH₃); ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆) 187.6 (C-9), 180.8 (C-10), 157.4 (C-8), 157.1 (C-6), 155.9 (C-2), 147.6 (C-1), 139.8 (C-7), 132.4 (C-3), 128.9 (C-11), 126.3 (C-4), 125.3 (C-14), 124.1 (C-13), 111.5 (C-12), 108.1 (C-5), 61.6 (7-OCH₃), 60.4 (1-OCH₃), 16.9 (3-CH₃); LC ESI-IT-TOF MS: m/z 331.0716[M+H]⁺.

세포주 및 세포배양

본 실험에서 사용한 RAW 264.7 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Virginia, USA)에서 분양받았다. Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 μg/㎖ streptomycin, 100 units/㎖ penicillin 첨가하여 CO2배양기(MCO-17A1, Sanyo, Osaka, Japan)에서 온도 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

세포 독성 평가(MTS 분석)

Aurantio-obtusin의 세포 독성이 있는지 확인하기 위해 MTS assay를 실시하였다. 12 well plate에 1 × 10⁵ cells/㎖로 분주하여 24시간 배양하였고 FBS가 들어있지 않은 DMEM 조건에서 시료를 12.5 ~ 100 μM 처리하였다. 그 후 30시간 배양 후 MTS 용해액이 전체배양액의 1/10되게 첨가하였다. 37℃에서 4 시간 배양한 후 ELISA 흡광도측정기(Infinite 200 pro, TECAN, Grödig, Austria)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Nitric oxide(NO) 농도 측정

Aurantio-obtusin의 NO 생성 억제를 측정하기 위해 시료를 12.5 ~ 100 μM 농도로 전처리하고, 2시간 후에 시료자체의 NO생성에 영향이 있는지도 확인하기 위해 LPS를 처리(500 ng/㎖) 혹은 무처리한 다음 RAW 264.7 cell를 24시간 배양하였다. 그 후에 세포배양액 100 μl, griess 시약(A+B) 100 μl를 혼합하였다. 10분 동안 반응 시킨 후 ELISA 흡광도측정기(Infinite 200 pro, TECAN, Grödig, Austria)를 이용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

Prostaglandin E2(PGE₂) 분석

LPS 자극에 의하여 RAW 264.7 cell로부터 생성되는 prostaglandin E2(PGE₂)양이 aurantio-obtusin에 의해 얼마나 감소하는가를 측정하기 위해 Nitric oxide(NO) 측정방법과 동일한 조건에서 배양된 세포 배양액을 PGE₂ ELISA kit를 이용하여 분석하였다. 세포 배양액 내 존재하는 PGE₂의 농도(pg/㎖)는 표준용액의 농도를 기준으로 환산하였다. 구체적 실험방법은 kit에 있는 프로토콜대로 수행하였다.

Cytokines(IL-1β, IL-6) 측정

Aurantio-obtusin의 염증성 사이토카인 생성억제 효과를 측정하기 위해서 RAW 264.7 cell을 6 ㎝ 배양 용기에 5 × 10⁵ cells/㎖로 분주하여 24시간 배양하여 세포를 안정화 시킨 뒤에 시료를 12.5 ~ 100 μM 전처리 한 뒤 2시간 후에 LPS를 500 ng/㎖이 되도록 처리하였다. 24시간 배양한 후 상등액을 취하였다. 구체적 실험방법은 kit에 있는 프로토콜대로 수행하였다.

면역형광염색(immunofluorescence) 분석

Aurantio-obtusin이 염증 세포신호전달과 관련된 IκB-α의 degradation 정도를 확인하기 위하여 immunofluorescence실험방법을 이용하여 IκB-α와 핵을 염색하여 확인하였다. Cover slip에 세포를 분주하여 24시간 배양 후에 샘플을 2시간 처리 한 후 LPS를 500 ng/㎖ 처리하고 30분이 지난 후 그룹 별로 PBS로 세척을 3회하고, 3.7% formaldehyde로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 다시 PBS로 세척을 3회하고, 형광물질이 들어갈 수 있도록 0.5% triton X-100을 15분간 처리한 후, 3% BSA로 실온에서 1시간동안 blocking을 하였다. 1% BSA에 든 anti-IκB-α (1:100)처리하고 4℃에서 밤새 반응하였다. 그런 후에 2차 anti-rabbit FITC conjugated(1:200)와 DAPI를 처리하고 실온에서 4시간 반응하였다. 마지막으로 PBS로 3회 세척 후 cover slip을 fluorescence solution (DAKO cytomation, Carpinteria, CA)으로 고정 시킨 후 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.

통계처리

본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 SPSS Statistics 25 Standard for Public Service 프로그램으로 통계분석을 하였으며, 평균치 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 나타내었다. 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 일원 분류 분산분석(one way analysis of variance)을 통하여 검증하였고, 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 평가하였다.

 

결과 및 고찰

 

지표성분 구조 분석

MJ90-1617-1의 LC/MS 분석 결과 m/z 331.0743 [M+H]⁺, 329.0673 [M-H]-의 분자량 및 C17H14O7의 분자식을 확인하였다(Fig. 1). ¹H-NMR spectrum를 통해 δ 7.76(1H, s, H-4)과 7.16(1H, s, H-5)에서 aromatic proton peak를 확인하였으며, δ 3.83(3H, s, 7-OCH₃)과 3.80(3H, s, 1-OCH₃)에서 두 분자의 methoxy proton 을, δ 2.28(3H, s, 3-CH₃)에서 한 분자의methyl proton을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum을 통해 δ 187.6(C-9), 180.8(C-10)에서 두 분자의 ketone peak 를 확인하였으며, anthraquinone 계열의 화합물임을 예측하였고, 12개의 benzenring carbon을 추가로 확인하였다. 또한 δ 61.6(C-7), 60.4(C-1)에서 두 분자의 methoxy carbon과 δ 16.9(C-3)에서 한 분자의 methyl carbon을 확인 하였다. 이를 기존 문헌과 비교해 aurantio-obtusin으로 동정하였다(Fig. 2).^11,12)

 

Fig. 1. LC-MS chromatogram (A and B) and mass spectrum (C and D) of aurantio-obtusin from C. tora L. (A: LC chromatogram by UV at 286 nm, B: Total ion chromatogram by TOF-MS, C: Positive mode, D: Negative mode).

 

Fig. 2. The chemical structure of aurantio-obtusin

 

RAW 264.7 세포주에서 aurantio-obtusin의 세포 독성 확인

항염증효과를 알아보기 전에 aurantio-obtusin이 RAW 264.7 세포에서 MTS assay를 통해 독성이 없는 농도를 확인하였다. 앞의 실험방법대로 수행한 결과 모든 농도에서 세포독성이 없는 것을 확인하였고, 이 후 항염증 실험에서 12.5 ~ 100 μM 농도로 실험을 수행하였다(Fig. 3).

 

Fig. 3. Effect of aurantio-obtusin on cell viability in RAW 264.7 cells.

RAW 264.7 cells were incubated for 30 hours in the presence or absence of aurantio-obtusin at indicated dose. Cell viability was evaluated by MTS assay as described in materials and methods. Data represent the mean ± S.D. of triplicate determinations from three separate experiments. Different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s Multiple range test. NS : not significant.

 

RAW 264.7 세포주에서 aurantio-obtusin의 NO 생성 억제 효과

RAW 264.7 세포주에서 aurantio-obtusin이 NO생성을 저해하는지 확인하기 위해 aurantio-obtusin을 12.5 ~ 100 μM 농도로 전처리하고 2시간 후에 LPS(500 ng/㎖)를 처리 혹은 무처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 상층액을 취하여 griess 시약을 이용해 NO 생성량을 확인하였다. 그 결과 LPS를 처리하지 않고 aurantio-obtusin을 12.5 ~ 100 μM 처리한 군에서는 유의적인 차이가 없었다. 하지만 LPS를 처리한 군에서는 aurantio-obtusin 처리 농도가 증가함에 따라 NO 생성량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

 

Fig. 4. Effect of aurantio-obtusin on LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were pretreated with the indicated concentration of aurantio-obtusin for 2 hours before being incubated with LPS (500 ng/㎖) for 24 hours. The culture supernatant was subsequently isolated and analyzed for LPS treated group. Data represent the mean ± S.D. of triplicate determinations from three separate experiments. Different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s Multiple range test. CON : control, LPS : LPS treated.

 

염증 유도된 RAW 264.7 세포주에서 aurantio-obtusin의 prostaglandin E2 (PGE₂) 생성 억제 효과

RAW 264.7 세포주에서 aurantio-obtusin이 PGE₂ 생성을 저해하는지 확인하기 위해 aurantio-obtusin을 12.5 ~ 100 μM 농도로 처리하고 2시간후에 LPS(500 ng/㎖)를 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 세포 상등액만 취하여 PGE₂ 생성이 aurantio-obtusin의해 저해되는지 ELISA kit를 이용하여 분석하였다. LPS에 의해 Raw 264.7 세포에서 PGE₂ 생성이 약 33배 이상 증가되는 것을 확인하였고, aurantio-obtusin을 처리하였을 때 농도별로 유의성 있게 PGE₂ 생성이 감소되였고, 이는 aurantio-obtusin이 PGE₂ 생성 활성을 낮춤으로써 항염증효과가 있음을 시사한다 (Fig. 5).

 

Fig. 5. Effect of aurantio-obtusin on LPS-induced PGE₂ production in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were pretreated with the indicated concentration of aurantio-obtusin for 2 hours before being incubated with LPS (500 ng/㎖) for 24 hours. The culture supernatant was subsequently isolated and analyzed for LPS treated group. Data represent the mean ± S.D. of triplicate determinations from three separate experiments. Different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s Multiple range test. CON : control, LPS : LPS treated.

 

Aurantio-obtusin의 염증관련 cytokines의 생성 억제 효과

Aurantio-obtusin이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도 되는 각종 전염증성 및 염증성 cytokine들의 생성에 대한 영향을 조사하기 위하여 IL-6와 IL-1β의 생성을 조사하였다. 세포 상등액을 ELISA 방법으로 측정한 결과 aurantio-obtusin 12.5 ~ 100 μM 농도에서 IL-6, IL-1β를 농도 의존적으로 억제하는 걸 확인하였고, 25 μM 농도이상에서는 유의적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 6).

 

Fig. 6. Effect of aurantio-obtusin on LPS-induced IL-6 (A), IL-1β (B) production in RAW 264.7 cells. Cells were pretreated with the indicated concentrations of aurantio-obtusin for 2 hours before being incubated with LPS (500 ng/㎖) for 24 hours. Production of IL-6 and IL-1β were measured by ELISA. Data represent the mean ± S.D. of triplicate determinations from three separate experiments. Different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s Multiple range test.

 

Aurantio-obtusin의 염증관련 cytokines의 생성 억제 효과

본 실험에서는 IκB-α을 염색하여 염증반응에 의한 IκB-α degradation을 확인하여 NF-κB 핵내 유입을 간접적으로 관찰하였다. RAW 264.7 세포에 LPS 처리시 IκB-α  발현이 감소되었고, 100 μM aurantio-obtusin을 전처리 했을 때 LPS에 의해 감소된 IκB-α 발현량을 증가시켰다. 이는 aurantio-obtusin이 IκB-α 의 phosphorylation에 의한 degradation을 감소시키고 NF-κB의 Nuclear translocation을 차단하며, 이에 따라 염증반응을 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 7).

 

Fig. 7. Effect of aurantio-obtusin on IκB-α degradation in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were pretreated with 100 μM of aurantio-obtusin for 2 hours before being incubated with LPS (500 ng/㎖) for 30 min. IκB-α was visualized with immunofluorescence staining with anti-IκB-α antibody. Green : IκB-α Blue : DAPI (nuclei).

 

결론

 

이 연구는 결명자로부터 분리한 anthraquinone계열 화합물인 aurantio-obtusin을 colum chromatography법을 이용해 분리하였고, ¹H, ¹³C NMR과 TOF-ESI MS를 이용해 구조 동정하였으며, 분리한 성분의 항염증 효과의 가능성을 서술한 것이다. 염증반응은 유해한 자극원인 감염, 손상된 세포 등으로 일어나는 초기 생체반응 중 하나로 감염되거나 손상된 세포를 제거함과 동시에 원인이 되는 항원을 제거하는 후천적인 면역반응을 촉발시키는 것으로 알려져 있다.¹³⁾ 하지만 정상세포 등을 인식하지 못하게 되거나, 일부 적은 자극에도 큰 반응성을 나타내는 등 비정상적인 염증 반응에 의해 지속적인 통증을 겪게 된다.¹⁴⁾ 최근에는 여러 항염증 치료제들의 외부 미생물에 의한 감염 노출 위험성, 위장관의 소화장애, 과민반응 등 부작용이 보고되었으며, 이를 극복할 수 있는 항염증 활성성분을 찾는 연구가 활발히 진행되고 있다.^15,16) NO, PGE₂, cytokine, chemokine 등 다양한 염증 관련 물질을 분비하는 것으로 알려진 대식세포와,^17,18) 이를 자극하는 항원으로 잘 알려진 LPS는 그람 음성균의 외막에서 관찰되며, 대식세포의 표면에 있는 수용체인 TLR4와 결합을 통해 평소에는 세포질에 Iκ-B에 의해 억제되어 있던 NF-κB가 염증반응이 촉진되게 되면 Iκ-B가 붕괴(degradation)되고 NF-κB가 핵 안으로 전이(translocation)되어 전사인자로서 각종 염증 관련 매개 물질의 분비를 촉진시키게 된다.¹⁹⁾ 이러한 사실에 기초하여 결명자에서 추출 분리한 aurantio-obtusin의 항염증 연구를 한 결과 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 NO, PGE₂, 염증성 cytokine인 IL-6와 IL-1β를 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였지만, 추가 기전 연구에 대해서는 많은 연구들이 필요할 것으로 사료된다. 추가적인 결명자 함유 단일 성분의 분리 및 항염증 관련 효능을 규명함으로써 향후 기능성 소재로의 이용 가능성을 제시한다.