반응표면분석법을 이용한 Thermotoga neapolitana β-glucosidase의 당전이 활성을 통한 glycosyl aesculin 합성 최적화

Optimization of Glycosyl Aesculin Synthesis by Thermotoga neapolitana β-Glucosidase Using Response-surface Methodology

강한 항 염증 활성을 갖는 glycosyl aesculin이 Thermotoga neapolitana ${\beta}-glucosidase$의 당전이 활성을 통하여 aesculin을 수용체로 이용하여 합성되었다. 약 $2{\mu}g$의 효소를 이용하여 반응표면분석법을 통한 주요 반응 매개변수들의 최적화가 시도되었다. 각 반응 변수들의 통계분석 결과 2차 다항식모델이 적용된 유의값(p<0.05)에 잘 맞았다. Aesculin과 다른 매개변수사이의 상호관계를 의미하는 반응표면곡선 그래프는 glycosyl aesculin의 수율이 주로 aesculin의 농도와 반응시간에 영향을 받음을 나타내었다. Glycosyl aesculin의 생산을 위한 반응최적조건은 aesculin의 농도 9.5 g/l, 온도 $84^{\circ}C$, 반응시간 81분, 그리고 pH 8.2로 나타났으며, 이러한 조건하에서 효소반응시 61.7%의 전환율로 5.86 g/l 의 수율이 예상되었다. 실험을 통한 실질적인 수율은 6.02 g/l으로 나타났다. 실질적인 수율과 가까운 값을 예측 가능하다는 것을 통하여 반응표면분석법이 효소반응의 전환율을 최적화하는데 타당하다는 것이 입증되었다. 본 연구에서는 반응표면분석법을 활용하여 최적화 이전에 비하여 약 1.6배의 glycosyl aesculin을 얻을 수 있었다. 이러한 결과들은 반응표면분석법이 미생물유래 당화효소를 이용한 생물학적 활성을 갖는 배당체 합성의 생산 최적화에 효과적으로 활용할 수 있다는 것을 보여준다.

Glycosyl aesculin, a potent anti-inflammatory agent, was synthesized by transglycosylation reaction, catalyzed by Thermotoga neapolitana ${\beta}-glucosidase$, with aesculin as an acceptor. The key reaction parameters were optimized using response-surface methodology (RSM) and $2{\mu}g$ of the enzyme. As shown by a statistical analysis, a second-order polynomial model fitted well to the data (p<0.05). The response surface curve for the interaction between aesculin and other parameters revealed that the aesculin concentration and reaction time were the primary factors that affected the yield of glycosyl aesculin. Among the tested factors, the optimum values for glycosyl aesculin production were as follows: aesculin concentration of 9.5 g/l, temperature of $84^{\circ}C$, reaction time of 81 min, and pH of 8.2. Under these conditions, 61.7% of glycosyl aesculin was obtained, with a predicted yield of 5.86 g/l. The maximum amount of glycosyl aesculin was 6.02 g/l. Good agreement between the predicted and experimental results confirmed the validity of the RSM. The optimization of reaction conditions by RSM resulted in a 1.6-fold increase in the production of glycosyl aesculin as compared to the yield before optimization. These results indicate that RSM can be effectively used for process optimization in the synthesis of a variety of biologically active glycosides using bacterial glycosidases.