서 론
혈관신생이란 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로 기관의 성장과 상처 치유, 염증과 종양의 성장 및 전이에 필수적이다[7, 8, 31]. 주변조직으로의 종양의 침윤과 전이는 주변에 존재하는 세포외기질(ECM)의 분해를 포함한 다단계 과정을 거쳐 일어난다[24]. 종양세포의 침윤특성은 세포외기질을 분해하는 metallo- 및 세린계 단백질분해효소의 분비 및 활성화 능력에 의한다[10, 15]. 특히 matrix metalloproteinase-2 (MMP-2)와 MMP-9이 악성 종양의 침윤과 전이를 촉진한다고 알려져 있다[13, 18]. MMPs는 세포외기질의 구성성분을 선택적으로 분해하는 세포외 endopeptidase로 기저막의 분해 조절을 통해 종양세포의 침윤에 관여한다. MMP-2는 세포의 분열, 이동, 침윤 및 혈관신생을 촉진하는 많은 분자들을 활성화시키며 특히 신경교종 세포에서 높게 발현되어 종양의 전이과정에도 중요한 역할을 수행한다[2]. 또한 MMP-9 역시 종양세포의 성장, 이동, 침윤 및 전이 등 혈관신생을 증가시킨다고 알려져 있다[3].
인간의 악성신경교종 세포의 두드러진 특징은 침윤성 성장과 활발한 혈관신생 등을 들 수 있다. Wick 등[29]은 hepatocyte growth factor (HGF)에 의해 유도되는 신경교종 세포의 이동과 침윤은 TGF-β2 발현이 관여한다고 밝힌 바 있다. TGF-β2는 MMP-2의 발현을 유도하고 tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2)의 발현을 억제한다고 알려져 있다[29]. 종양 세포들의 이러한 침윤 특성은 세포외기질을 분해하는 단백질분해효소의 분비 때문으로 알려져 있다. 한편 Kesanakurt 등[16]은 MMP-2 knockdown에 의해 악성신경교종 세포의 침윤과 이동이 억제된다는 사실과 MMP-2/αvβ3 상호작용이 종양세포의 성장, 침윤과 혈관신생에 관여한다는 것을 밝혔다. 또한 엘라스틴-라민 수용체(67LR)가 여러 다양한 악성세포의 증식을 증가시켰으며 전이를 증가시키는데 관여한다는 보고가 있으며, 종양 주위 세포외기질의 재구성이 조직 주위의 침윤 및 먼 부위로의 확산과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다[9, 23]. 이 과정에서 핵심적인 역할을 수행하는 물질이 부착분자와 그 수용체 그리고 세포외기질을 분해하는 단백질분해효소 등이다.
Vascular endothelial growth factor (VEGF)와 HGF는 모두 혈관의 재생 능력을 증가시키고 세포사멸을 방지하는 특성을 가지고 있다[14, 25]. VEGF 신호전달 경로는 내피세포의 증식, 이동 및 모세혈관 형성 촉진 등 종양 혈관신생에 중요한 역할을 수행한다[11, 32]. HGF 역시 내피세포의 이동, 증식 및 관-형성에 중요한 역할을 수행하나 VEGF와 달리 내피세포에만 제한적이다. In vitro에서 VEGF와 HGF의 상호작용에 대한 연구 및 배양세포와 비-허혈성 동물모델을 이용한 혈관신생 연구를 통해 이들 두 혈관신생 유도인자의 병용처리 효과를 밝힌 연구도 있다[22, 28, 30, 33].
본 연구에서는 악성신경교종 세포로부터 유래한 U-373-MG 세포주를 이용하여 VEGF와 HGF에 의해 유도된 세포의 증식, 이동 및 침윤에 미치는 MMPs 억제제와 플라스민 억제제의 효과를 관찰하였다. 연구 결과, MMPs 억제제와 플라스민 억제제 처리에 의해 VEGF와 HGF에 의해 유도된 U-373-MG 세포의 증식, 이동 및 침윤이 유의할만하게 억제되었다.
재료 및 방법
시약
재조합 hVEGF와 hHGF는 R & D System (Minneapolis, MN, USA) 으로부터 구입하였다. MMP-2와 MMP-9 스탠다드는 Cal-Biochem (La Jolla, CA, USA)으로부터 구입하였으며 MMP- 2와 MMP-9 enzyme immunoassay 키트는 Fuji Chemical Industries (Toyama, Japan)로부터 구입하였다. BB-94 (batimastat)는 British Biotech Pharmaceuticals Ltd. (Oxford, UK)로부터, α2-antiplasmin (α2AP)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 배지 및 혈청은 Life Technology Inc. (Gaitherburg, MD, USA)로부터, 그 외 특별히 적시하지 않은 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
세포배양
U-373-MG 세포주는 한국세포주 은행에서 구입하여 10% FBS (v/v) 첨가 Dulbecco′s modified Eagle′s media (DMEM)에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다.
세포증식 효과 조사
U-373-MG 세포를 well 당 1×04 세포 밀도로 96-well plate에 접종하였다. 이후 1~3일 동안 세포를 배양한 다음 CellTiter 96® aqueous 세포증식 정량 키트(Promega. Madison, WI, USA)를 이용하여 Emax® microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 490 nm에서 용액의 흡광도를 측정하여 세포증식 효과를 확인하였다.
Zymography
MMPs 및 플라스민의 기질 분해 활성은 젤라틴 및 피브린 zymography를 행하여 확인하였다[17]. 이를 위해 U-373-MG 세포를 24-well plate에 세포밀도가 5×104 cell/cm2이 되도록 접종한 다음, 10% FBS (v/v) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 이후, 새로운 배지로 세척한 다음 confluent한 U-373-MG 세포를 무-혈청 및 무-phenol red 배지에서 대조완충용액 혹은 VEGF (5 ng/ml)와 HGF (5 ng/ml)를 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 젤라틴 zymography는 MMP-2 및 MMP-9의 기질인 젤라틴을 SDS-PAGE의 running gel에 첨가한 후 환원 조건에서 전기영동한 다음 1% Triton X-100 완충용액에서 재변성시킨 후 배양 완충용액(0.05M Tris-HCl, pH 7.5, 0.02M NaCl, 5mM CaCl2와 0.02% Brij-35, 37℃)에서 16시간 반응시켰다. 이후 0.5% Coomassie brilliant blue R250으로 3시간 염색시킨 다음, 10% acetic acid, 30% 메탄올에서 투명한 밴드가 나타날 때까지 탈색시켰다. 플라스민 활성은 분해 기질로 피브린을 첨가하여 피브린 zymography를 행하여 확인하였다.
분비된 MMP-2, MMP-9 및 플라스민에 대한 Enzyme Immunoassay
U-373-MG 세포를 24-well plate에 세포밀도가 5×104 cell/cm2이 되도록 접종한 다음, 20% FBS (v/v) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후 confluent한 U-373-MG 세포를 무-혈청 및 무-phenol red 배지에서 12시간 배양하였다. 세포를 새로운 배지로 세척한 다음 대조완충용액 혹은 지시된 시약을 지정된 시간만큼 처리하였다. 분비된 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 실제양은 제조회사의 지시에 따라 enzyme immunoassay 키트(Fuji Chemical Industries, Toyama, Japan)로 측정하였다.
세포의 이동 및 침윤 효과 조사
세포의 이동은 U-373-MG 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 well 당 1×105 세포 밀도로 챔버의 위쪽 칸에 접종한 다음, QCM™ 24-well 발색 세포이동 정량 키트(Chemicon, Temecula, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 침윤 효과를 조사하기 위해서 8-μm 공극을 갖는 여과막이 부착된 Matrigel-coated 챔버(Beckton Dickinson, Bedford, MA, USA)의 상단에 1×105 세포를 접종하였다. 이후 여과막을 건조, 염색한 다음 200 μl의 추출 완충용액이 포함된 well로 옮긴 다음, Emax® microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
스크래치 상처 회복 분석
U-373-MG 세포를 24-well plate에 5×105 cells/well이 되도록 접종하여 10% FBS (v/v) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 이후 PBS로 세척한 다음 무-혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후 95% 이상 confluent하게 자란 세포를 팁으로 긁어 U-373-MG 세포의 단일 층에 스크래치 상처를 만들었다. 이후 2.5% FBS (v/v) 첨가 DMEM 배지에서 대조완충용액 또는 지시된 시약을 처리하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 배양한 다음 스크래치 상처의 간격을 측정하였다.
통계처리
자료는 means ± SD로 나타냈으며, 유의성은 Student-Newman-Keuls test에 의한 one-way ANOVA를 이용하여 검사하였다. 통계적 유의성은 p<0.05를 기준으로 하였다.
결과 및 고찰
세포증식에 미치는 단백질분해효소 억제제의 효과
VEGF와 HGF는 내피세포의 이동, 증식과 관-형성의 활성화 등을 통해 혈관신생, 종양성장 및 발생 등에 관여한다고 알려져 있다. 이전의 연구 결과 VEGF와 HGF를 동시에 처리했을 때 각각의 성장인자를 단독으로 처리한 그룹보다 훨씬 강력한 증식 및 주화성 반응을 유도하며, 3D 콜라겐 모델을 사용한 연구에서도 VEGF와 HGF의 병용처리에 의해 관-형성 및 세포생존이 유의할만하게 증가되었다는 보고가 있다[1, 14, 30].
혈관신생이 일어나기 위해서는 세포의 증식이 선행되어야 한다. 본 연구에서는 U-373-MG 세포에 VEGF와 HGF의 단독 또는 병용처리를 통하여 세포의 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과 VEGF 처리에 의해서 세포의 증식이 약 4.1배 증가되었고(3일째) HGF에 의해서는 약 3.7배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 4.7배 증가되었다(Fig. 1). 한편 VEGF와 HGF에 처리에 의한 U-373-MG 세포의 증식 효과가 MMPs와 플라스민의 분비 증가에 의한 것인지를 조사한 결과, 최대 증식 효과를 나타낸 VEGF와 HGF의 병용처리군보다 MMPs의 광범위 억제제인 BB-94 처리(3일째)에 의해 약 12%, 플라스민 억제제인 α2AP의 처리(3일째)에 의해 약 10% 증식이 억제되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 MMPs 및 플라스민이 종양 미세환경에서 성장신호 및 항-성장신호 사이의 균형을 파괴하여 성장을 조절하는 인자로 작용할 가능성을 시사해준다.
Fig. 1.Effect of inhibitors of MMPs and plasmin on the proliferation of U-373-MG cells. Cells were incubated in 10% FBS (v/v) DMEM for 20 hr. Then, the media was changed to serum-free DMEM that was amended with control buffer (Con), VEGF (5 ng/ml), HGF (5 ng/ml), BB-94 (4 nM), α2AP (200 nmol/L), VEGF plus HGF (V+H), 4 nM BB-94 for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (BB-94+V+H), and 200 nmol/L α2AP for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (α2AP+V+H). All experiments were performed in triplicate. Data are means ± SD from three independent experiments. *p<0.05 versus control buffer. #p<0.05 versus VEGF or HGF-treated cells. †p<0.05 versus VEGF plus HGF (V+H) treated cells.
MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비에 미치는 VEGF와 HGF의 효과
종양 혈관신생 과정에서 세포의 이동에 필수적으로 요구되는 과정은 인접한 세포외기질의 분해이다. 세포외기질을 분해하여 세포가 이동하고 침윤하기 위해서는 단백질분해효소의 발현 및 분비가 요구된다. 이 과정에 주된 역할을 하는 효소로 MMPs 및 세린계 단백질분해효소가 알려져 있다[4]. MMPs는 세포외기질을 분해하여 종양세포의 주변 부위로의 침투가 가능하게 하는 중요한 역할을 수행한다[12]. 특히 MMP-2와 MMP-9은 인간의 악성신경교종 세포의 발생과 전이에 연관되어 있다고 알려져 있다[22]. 본 연구에서는 세포외기질의 분해에 관련된 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 활성을 측정하기 위해 zymography를 이용하였다. 이를 위해 U-373-MG 세포에 VEGF 또는 HGF를 처리한 다음 zymography를 행한 결과, MMP-2의 경우 VEGF에 의해 약 1.6배, HGF에 의해 약 1.4배 분비가 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 3.8배 증가되었다(Fig. 2A). MMP-9의 경우 VEGF에 의해서 약 4.2배 분비가 증가되었고 HGF에 의해서는 약 3.5배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 5.6배 증가되었다(Fig. 2A).
Fig. 2.Effect of VEGF and HGF on the secretion of MMP-2 and MMP-9 of U-373-MG cells. Cells were incubated in serum- and phenol red-free DMEM for 12 hr. Then, the cells were incubated for 12 hr after addition of control buffer (Con), VEGF (5 ng/ml), HGF (5 ng/ml), and VEGF plus HGF (V+H). (A) Gelatin zymography. Equal amounts of proteins (10 μg/lane) from supernatant were loaded into each lane. M represents MMP-2 and MMP-9 standard. Results were similar in three independent experiments. (B) Media were quantitatively assayed by enzyme immunoassay. Data are means ± SD from three independent experiments. *p<0.05 versus control buffer. #p<0.05 versus VEGF or HGF-treated cells.
MMP-2와 MMP-9의 실제 분비량을 enzyme immunoassay를 통하여 확인한 결과, MMP-2는 VEGF 처리에 의해 분비량이 약 2.1배 증가되었으며, HGF에 의해서는 약 1.8배 증가되었고 VEGF와 HGF의 병용처리에 의해서는 약 4.6배 증가되었다 (Fig. 2B). MMP-9의 경우에는 VEGF 처리에 약 2.3배 분비가 증가되었으며 HGF에 의해서는 약 1.8배 증가되었고 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 3.5배 증가되었다(Fig. 2B). 이러한 결과는 VEGF와 HGF가 종양세포로부터 MMPs의 분비를 직접적으로 자극하거나 또는 MMPs 방출에 연관된 인자를 활성화시키는 방법으로 MMPs의 분비증가를 유도한다는 Belotti 등[4]의 결과와 유사하다.
한편, 혈관신생 유도인자의 자극에 반응하여 세포가 이동하기 위해서는 피브린 분해효소의 분비가 필수적이다[26]. U-373-MG 세포에서 플라스민의 분비에 미치는 VEGF와 HGF의 효과를 피브린 zymography를 행하여 확인한 결과, VEGF 처리에 의해 플라스민의 분비량이 약 4.6배 증가되었고 HGF 처리에 의해서는 약 3.5배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리에 의해서는 약 6.2배 증가되었다(Fig. 3A). 플라스민의 실제 분비량을 enzyme immunoassay를 통해 측정한 결과, VEGF 처리에 의해 플라스민의 분비량이 약 2.2배 증가되었고 HGF 처리에 의해서는 약 1.7배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용 처리 시 약 3.3배 증가되었다(Fig. 3B).
Fig. 3.Effect of VEGF and HGF on the secretion of plasmin of U-373-MG cells. Cells were incubated in serum- and phenol red-free DMEM for 12 hr. Then, the cells were incubated for 12 hr after addition of control buffer (Con), VEGF (5 ng/ml), HGF (5 ng/ml), and VEGF plus HGF (V+H). (A) Fibrin zymography. Equal amounts of proteins (10 μg/lane) from supernatant were loaded into each lane. Results were similar in three independent experiments. (B) Media were quantitatively assayed by enzyme immunoassay. Data are means ± SD from three independent experiments. *p<0.05 versus control buffer. #p<0.05 versus VEGF or HGF-treated cells.
세포의 이동 및 침윤에 미치는 단백질분해효소 억제제의 효과
혈관신생 과정의 초기단계에서 세포의 증식과 단백질분해 효소의 분비에 따라 생긴 통로를 통해 세포의 이동 및 침윤이 진행되어야 한다. 본 연구 결과, VEGF와 HGF 처리에 U-373-MG 세포의 증식 증가, MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비증가와 유사하게 세포의 이동이 증가되었다(Fig. 4). U-373-MG 세포에 VEGF를 처리한 결과 세포의 이동이 약 4.9배, HGF 처리에 의해서는 약 3.7배 증가되었으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 약 6.2배 증가되었다(Fig. 4). 즉 VEHG와 HGF에 의한 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비 증가(Fig. 2~Fig. 3)와 U-373- MG 세포의 이동은 비례적으로 증가하였다(Fig. 4). 이러한 결과는 인간의 악성신경교종 세포에 VEGF와 HGF를 포함한 다양한 수용체가 존재한다는 것을 의미한다[6]. VEGF와 HGF에 의한 U-373-MG 세포의 이동 증가가 단백질분해효소의 분비증가와 연관이 있는지를 확인하고자 광범위 MMPs 억제제인 BB-94를 처리(3일째)한 결과, 최대 이동 효과를 나타낸 HGF와 VEGF의 병용처리군 보다 세포의 이동이 약 32% 억제되었다(Fig. 4). 또한 플라스민 억제제인 α2AP에 의해서도 세포의 이동이 약 29% 억제되었다(Fig. 4). 이러한 결과는 VEGF와 HGF에 의한 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비증가가 직접적 또는 간접적으로 U-373-MG 세포의 이동을 촉진시킬 것이라 여겨진다. 즉 MMPs 억제제와 플라스민 억제제는 VEGF와 HGF의 up-regulation을 차단함으로써 U-373-MG 세포의 이동을 억제하는 것으로 사료된다.
Fig. 4.Effect of inhibitors of MMPs and plasmin on the migration of U-373-MG cells. Cells were incubated in 10% FBS (v/v) DMEM for 20 hr. Then, the media was changed to serum-free DMEM that was amended with control buffer (Con), VEGF (5 ng/ml), HGF (5 ng/ml), BB-94 (4 nM), α2AP (200 nmol/L), VEGF plus HGF (V+H), 4 nM BB-94 for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (BB-94+V+H), and 200 nmol/L α2AP for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (α2AP+V+H). All experiments were performed in triplicate. Data are means ± SD from three independent experiments. *p<0.05 versus control buffer. #p<0.05 versus VEGF or HGF-treated cells. †p<0.05 versus VEGF plus HGF (V+H) treated cells.
위에서 확인한 VEGF 및 HGF에 의한 U-373-MG 세포의 이동에 미치는 효과를 스크래치 상처회복 분석방법으로 확인하였다. 스크래치 상처를 만든 직후의 간격을 임의의 단위인 1로 설정하여 배양 24시간 및 48시간 후 스크래치 상처의 간격을 비교한 결과, 배양 24시간 후에 대조군의 간격이 14% 채워진 것과 비교하여 VEGF는 10%를 채워 세포의 이동증가를 확인하였다(Fig. 5). VEGF와 HGF를 병용처리한 군과 비교해 볼 때 MMPs 억제제인 BB-94와 플라스민 억제제인 α2AP에 의해서도 11%가 채워져 유의할만한 세포이동 억제효과를 나타냈다(Fig. 5).
Fig. 5.Evaluation of the migration of U-373-MG cells by scratch wound healing assay. Cells were seeded in 24-well plates and then incubated for 24 hr in serum-free DMEM prior to creating a wound across the cell monolayer with a tip. Then, the media was changed to serum-free DMEM that was amended with control buffer (Con), VEGF (5 ng/ml), HGF (5 ng/ml), BB-94 (4 nM), α2AP (200 nmol/L), VEGF plus HGF (V+H), 4 nM BB-94 for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (BB-94+V+H), and 200 nmol/L α2AP for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (α2AP+V+H). Cell migration into the wound surface was then monitored by microscopy (×100) after 24~48 hr.
U-373-MG 세포의 침윤에 미치는 VEGF와 HGF의 효과를 조사한 결과 대조군에 비해 VEGF는 약 3.6배, HGF는 약 2.8배 침윤을 증가시켰으며 VEGF와 HGF의 병용처리 시 침윤이 약 4.2배 증가되었다(Fig. 6). 한편 Lu 등[21]은 항-VEGF/VEGFR 제제 처리 후 증가된 침윤 표현형에 HGF/ MET가 관여한다고 보고하였다. 그들은 항-VEGF/VEGFR 제제 처리 시 VEGFR2가 MET와 이형이량체를 형성하고 이 상호작용 결과 MET로부터 단백질 타이로신 phosphatase 1B (PTP1B)의 해리를 일으켜 MET 활성을 증가시키고 악성신경교종 세포의 침윤이 증가된다는 것을 밝혔다. 그간의 연구 결과 MMP-2와 MMP-9은 종양세포의 증식, 이동, 침윤 및 혈관신생 등을 촉진함으로써 암의 진전을 촉진한다고 알려져 있다[19, 20]. 또한 Guo 등[15]은 Angiopoietin-2가 MMP-2의 활성화를 통해 U-38-MG 세포의 침윤을 증가시킨다고 보고하였으며 Choe 등 [10]도 악성신경교종 세포의 침윤 증가와 혈관신생을 유도하는 핵심 분자들을 활성화시키는데 MMP-2가 관여한다고 보고한 바 있다. 본 연구결과 MMPs 억제제인 BB-94와 플라스민 억제제인 α2AP 처리에 의해 U-373-MG 세포의 침윤이 유의할 만하게 억제되었다.
Fig. 6.Effect of inhibitors of MMPs and plasmin on the invasion of U-373-MG cells. Cells were incubated in 10% FBS (v/v) DMEM for 20 hr. Then, the media was changed to serum-free DMEM that was amended with control buffer (Con), VEGF (5 ng/ml), HGF (5 ng/ml), BB-94 (4 nM), α2AP (200 nmol/L), VEGF plus HGF (V+H), 4 nM BB-94 for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (BB-94+V+H), and 200 nmol/L α2AP for 1 hr and then stimulated with VEGF plus HGF (α2AP+V+H). All experiments were performed in triplicate. Data are means ± SD from three independent experiments. *p<0.05 versus control buffer. #p<0.05 versus VEGF or HGF-treated cells. †p<0.05 versus VEGF plus HGF (V+H) treated cells.
이상의 연구 결과를 요약하면, 인간의 악성신경교종 유래 U-373-MG 세포에서 VEGF와 HGF 처리에 의한 세포의 증식, 이동 및 침윤의 증가는 VEGF와 HGF의 직접적인 신호전달 경로와 함께 부분적으로는 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비증가에 의한 것이라 여겨진다.
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