흰민들레 발효추출물의 남성 갱년기 개선에 대한 효과

Effects of Fermented Dandelion (Taraxacum coreanum) Extract on Male Climacteric Syndrome

Abstract

본 연구에서는 민들레 추출물(DE) 및 민들레 발효추출물(FDE)이 남성갱년기 증상의 개선에 영향을 미치는 지를 알아보기 위해 22주령된 고령 흰쥐에 추출물을 4주간 투여한 후, testosterone, SHBG, PSA, 체지방, 혈중지방, 근육량, 운동수행능력, 정자 수 및 정자 활동성 등에 미치는 영향을 조사하였고 세포 실험을 통해 그 기작을 알아보았다. DE 및 FDE 투여 후 남성갱년기의 지표로 사용되는 남성호르몬인 testosterone의 혈중 농도가 증가하였고, testosterone 과 결합하여 생체 내 활성을 저하시키는 SHBG의 농도는 감소하였다. 또한 남성호르몬 보충요법에서 문제가 될 수 있는 전립선에 대한 부작용을 알아보기 위해 전립선특이항원(PSA)을 측정하였으나, 대조군과 별다른 차이를 나타내지는 않았다. 지방조직과 근육에 대한 영향을 측정한 결과, 지방조직량은 줄이고 근육량은 늘리는 것으로 나타나 남성갱년기에서 흔히 나타나는 근육량 감소 및 체지방 증가에 긍정적인 효과를 갖는 것으로 생각된다. 또한 testosterone의 감소에 흔히 동반되는 혈중지질대사 이상에 있어서도 민들레 추출물 및 민들레 발효추출물 투여군이 총 콜레스테롤과 중성지방은 감소시킨 것에 반해 고밀도 콜레스테롤은 증가시켰음을 관찰하였다. 강제수영을 통한 운동수행능력 측정 결과에서는 민들레 추출물 및 민들레 발효추출물 투여군이 대조군에 비하여 수영시간이 증가하였고, 이는 민들레 추출물 및 민들레 발효추출물의 투여가 운동수행능력 향상에 기여한 것으로 사료된다. 총 정자 수와 활동성 정자 수를 측정한 결과에서도 민들레 추출물 및 민들레 발효추출물 투여군에서 증가한 것으로 나타났고, 이는 정자 형성과 활동성에 영향을 주는 testosterone 농도의 증가와 관련이 있는 것으로 여겨진다. 마지막으로 이러한 동물실험 결과의 기작을 알아보기 위해 세포실험을 통해 testosterone 생합성 과정에 관여하는 유전자의 변화를 측정한 결과 투여군에서 모두 증가함을 나타냄으로써, 추출물이 testosterone 합성을 직접적으로 촉진 시킬 수 있음을 알 수 있었다. 전반적인 결과로 민들레 추출물 보다는 발효추출물이 더 좋은 효과를 나타내었고, 이는 발효 과정을 통해 민들레 유효 성분의 생체 이용률이 증가한 것으로 사료된다. 따라서, 추후 연구에서 발효에 의해서 증가하는 활성 성분에 대한 분석이 필요할 것으로 생각된다. 결론적으로 본 연구에서는 민들레 추출물 및 발효추출물이 남성갱년기에 긍정적인 개선 효과를 나타냄을 보였고, 이를 활용하여 남성갱년기 개선에 도움 줄 수 있는 소재로 개발 할 수 있는 가능성을 제시하였다.

Male climacteric syndrome, andropause, or testosterone deficiency syndrome (TDS) is one of the new health issues in elderly men. It is a natural phenomenon that happens with age in men, which is clinically characterized by a decline in levels of serum testosterone resulting in a significantly decreasing of physical and mental activities. The aim of this study was to investigate the putative alleviative effects of dandelion extract on the symptoms of TDS by increasing serum testosterone levels and compare the efficacy between dandelion extract (DE) and fermented dandelion extract (FDE). After daily intake of DE and FDE for 4 weeks, serum testosterone levels, muscles of vastus lateralis, forced swimming time, total sperm counts, and motile sperm counts were significantly increased in older rats (22 weeks). Additionally, SHBG, epididymal fat pad, total serum cholesterol and triglyceride were significantly decreased in DE and FDE fed groups. However, PSA levels were not different among all groups. Furthermore, DE and FDE enhanced the expression of genes related to testosterone biosynthesis in TM3 Leydig cells. Overall, these positive effects on andropause were greater in FDE compared to DE. These results suggest the potential of FDE as a safe and efficacious natural material for recovering testosterone levels and reducing andropause symptoms.

서 론

현대 사회의 급속한 경제 성장과 의학 발달은 인간의 평균 수명을 증가 시키는데 큰 도움을 주었고, 인구의 고령화에 따라 노인건강에 많은 관심을 가지게 되었다. 그에 따라 최근 건강을 위협하는 질병에 대한 치료뿐만 아니라 삶의 가치를 높이는 것은 중요한 의미를 가지고 있다. ‘삶의 가치를 높여준다’ 라고 하는 것은 노후에 활력 있는 건강상태를 유지 혹은 노화를 지연시키는 것인데, 고령화 사회가 됨에 따라 젊은 세대의 사람들도 이러한 문제에 많은 관심을 가지고 있다. 그 중 노화로 인하여 대부분의 남녀들이 공통적으로 겪게 되는 대표적인 증상 중에 갱년기를 들 수 있다[2, 7, 42]. 일반적으로 사람들은 갱년기를 여성들이 폐경기가 오면 여성호르몬이 감소하여 발생하는 여성만의 증상이라고 생각하는데 남성들도 남성호르몬의 감소로 인해 나타나는 여성갱년기와 유사한 여러 임상적 증상들이 있으며, 천천히 진행되는 특징으로 인해 이를 인식하지 못하는 경우가 많다. 대부분 남성들은 갱년기 증상을 스트레스나 잠깐의 통증이라 생각하고 넘어가는 사람들이 많지만 갱년기 이후에는 몸이 급격히 쇠약해지고 노화가 촉진되는 단계이기 때문에 중요한 의미를 가진다[20]. 테스토스테론 결핍 증후군(testosterone deficiency syndrome, TDS)이라고도 불리는 남성갱년기의 주된 증상으로는 피로를 쉽게 느끼게 되고, 기억력 저하, 우울증 같은 증상이 흔하게 나타나며, 근력 저하와 체지방 증가, 뼈가 약해지는 등 여러 문제가 생긴다. 또한 발기부전이 일어나고, 성욕 또한 저하되는 등 여러 가지 신체적 변화와 정신적 증상과 함께 뇌와 고환이 노화되어 남성호르몬인 testosterone의 농도 저하 또한 나타난다[10, 43]. 그렇기에 본 실험에서는 일반 사람들이 잘 알지 못 하는 남성갱년기를 중요히 다루어 인체에 해가 되지 않는 천연추출물을 사용하여 남성갱년기의 증상완화에 도움을 주고자 하였다.

민들레는 이른 봄부터 늦가을까지 우리나라 곳곳에서 피어나 흔히 볼 수 있는 식물 중 하나로 국화과의 풀이며 세계적으로 분포되어 있고, 국내의 한방 쪽에서는 포공영이라고 불리며 한약재로 많이 사용되고 알려져 있기도 하다. 민들레의 뿌리, 잎, 꽃, 꽃줄기 등 포공영의 전체를 동양 쪽에서는 오랫동안 약으로 사용하여 왔는데, 지상부를 건조한 것은 완하제, 강장제 등의 약제로 사용되었고, 뿌리 부위를 건조한 것은 해열, 이뇨, 해독제로 사용되고 있다. 열로 인한 종창, 인후염, 맹장염, 유방염, 황달, 급성간염, 복막염 등에 효과가 있으며, 열로 인해서 소변을 못 누는 증세에도 사용한다[21]. 현재 우리나라에 있는 민들레는 서양민들레(Taraxacum officinale), 좀민들레(Taraxacum hallaisnese), 산민들레(Taraxacum ohwianum), 토종민들레(Taraxacum mongolicum), 흰민들레(Taraxacum coreanum)로 구별된다. 많은 민들레 중 국내에서 대표적인 민들레 종으로는 서양민들레와 흰민들레가 있다. 서양민들레는 유럽이 원산지로 국내에서 거의 다수 차지하는데 혹한기를 제외하고 연중 14회 개화하고 번식능력이 매우 뛰어난 식물이다. 흰민들레는 토종민들레와 유사하지만 꽃이 흰색이고 연중 1회 개화하고 타가수정으로만 종자를 번식하고 증식률이 낮다[1, 24]. 민들레의 성분은 이전의 다른 연구에 의하면 고미 물질인 taraxacin과 inulin이 풍부하고 taraxanthin, carotenoids, taraxaol, taraxasterol 등의 phytosterol 및 caffeic acid 등 페놀 화합물을 함유하고 있다. 또한 chlorogenic acid, chicoric acid 등의 폴리페놀과 luteolin과 quercetin 등의 플라보노이드 유도체가 함유되어 있다[27, 31, 50]. 민들레는 식용으로도 많이 사용되어 오고 있는데, 서양에서는 이미 다양한 가공식품과 건강보조식품을 제조 및 판매하고 있다[6, 24]. 우리나라에서는 일부 민들레를 생즙으로 먹거나 나물 또는 쌈으로도 섭취하여 점차 이용이 증가되고 있는 추세이나 상품화된 가공식품은 미비한 실정이다[23].

본 연구에서는 이미 여러 효능이 알려져 있지만 더욱 개발 할 가능성이 많은 민들레의 남성갱년기 개선 효과를 알아보기 위해, 민들레 추출물(dandelion extract, DE)과 이를 유산균으로 발효한 민들레 발효추출물(fermented dandelion extract, FDE)을 실험동물에게 투여하고 이를 통해 남성갱년기 증상 개선에 대한 효능의 여부와 그 수준을 비교 분석 하였다. 실험은 투여 후 실험동물의 혈중 testosterone, sex hormone binding globulin (SHBG), prostate specific antigen (PSA), 체지방 및 근육량, 운동수행능력, 정자 수, 혈중지질 등 체내에 미치는 변화를 확인하였고, testosterone 증가에 영향을 주는 기작을 알아보기 위해 mouse Leydig 세포주를 이용하여 testosterone 양과 testosterone 합성과정에 관여하는 효소들의 유전자 발현량을 측정하였다.

 

재료 및 방법

민들레 추출물 및 발효추출물 제조

본 실험에 사용된 흰민들레는 경북 청송에서 마른 건초를 구입하여 사용하였다. 건조 민들레의 열수 추출물은 물 1,000 ml와 파쇄된 민들레 100 g을 75~80℃의 가열 맨틀상에서 24시간 추출 한 후 filter paper (Whatman No. 1)로 여과하여 여과된 여액을 감압 농축한 다음 동결건조하여 얻어진 분말을 4℃ 냉장고에 보관하며 사용하였다. 민들레 발효추출물은 건조 민들레 100 g 당 유산균(Lactobacillus plantarium) 약 1×109개를 혼합하고 물 1,000 ml를 첨가하였다. 이 혼합물을 96시간 동안 30℃에서 발효한 다음, 이후에는 열수 추출물과 같은 과정을 거쳐 발효추출물을 얻었다. 실험에서는 이 추출물을 식용수에 용해하여 사용하였다.

실험동물의 사육

본 연구에서는 12주령된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 대한바이오링크(Eumseong, Korea)에서 구입하여 사용하였으며 본 실험은 중원대학교 동물실험 윤리위원회의 승인 하에 표준 작업 지침에 따라 수행되었다(JWU 2015-1210). 실험 시작 전 10주 동안 대한바이오링크사의 일반 고형사료로 적응시킨 뒤 22주령까지 사육하여 실험을 진행하였고 강제 유영운동이 다른 생화학적 지표에 영향을 줄 것을 고려하여 강제유영운동군과 혈액, 체지방, 근육 및 정자 수 측정군으로 분류하였으며 각각 40마리씩 총 80마리로 실험하였다. 실험쥐들은 몸무게가 약 420 g의 것을 군당 8마리씩 임의로 분류하였다. 실험쥐들은 온도 24℃, 상대습도 50±10%, 환기회수 10-20회/시간, 조명 시간 12시간(점등 08:00-소등 20:00)으로 설정된 환경에서 cage당 두 마리씩 배치하여 관리하였다. 실험군은 DE, FDE 두 군으로 나뉘어 oral zonde를 사용하여 4주간 매일 일정 시간에 규칙적으로 경구투여를 시행하였다.

채혈 및 혈장 채취

혈중 testosterone치를 측정하기 위해 매주 같은 요일 16:00-18:00시에 ether로 마취한 후 꼬리정맥에서 약 400-500 μl 정도 혈액을 채취하였다. 다른 실험항목을 측정하기 위해 실험 종료 날에는 심장에서 직접 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 얼음에 꽂아 신속하게 13,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리를 진행한 뒤 혈장만을 분리하여 사용하였다.

대퇴근 및 내장지방 적출

실험쥐들의 배를 열어 심장채혈을 한 후 대퇴부를 절개하여 대퇴사두근 중 많은 비율을 가지는 외측광근(vastus lateralis)을 분리하여 무게를 재었고, 내장지방 중 부고환 지방 조직(epididymal fat pad, EFP)의 무게를 재어 각각의 변화를 확인하였다.

혈중 testosterone측정

혈중 testosterone치를 측정하기 위해 testosterone 측정용 키트(Enzo life sciences, Plymouth Meeting, Montomery County, PA, USA)를 이용하여 실험하였다. Diethyl ether로 전처리한 샘플을goat anti-mouse IgG microtiter plate에 혈장과 표준희석액을 넣은 뒤 testosterone 항체를 혼합하여 plate shaker에서 500 rpm으로 1시간 동안 incubation한 후, 기질 용액을 넣어 37℃ 암조건 하에서 1시간 동안 incubation하였다. 이후 반응정지액을 넣고 혼합해 405 nm에서 즉시 흡광도를 측정하였다.

혈중 PSA 측정

혈중 PSA함량은 PSA 측정용 키트(CUSABIO, Wuhan, China)를 이용하여 pre-coated microplate 에 혈장시료와 표준용액을 넣어주고 밀봉하여 37℃에서 2시간 동안 incubation시켰다. 용액을 제거한 뒤 biotin 항체를 넣고 37℃에서 1시간 동안 incubation시킨 다음 wash buffer로 washing 하였다. 이후 용액을 제거한 뒤 HRP-avidin을 넣고 37℃에서 30분 동안 incubation시켰다. 이를 washing 한 후 용액을 제거하고 기질 용액을 넣어 37℃에서 20분간 암조건 하에서 incubation시킨 후, 반응정지액을 첨가하여 450 nm에서 흡광도를 즉시 측정하였다.

혈중 SHBG 측정

혈중 SHBG함량은 SHBG 측정용 키트(Cloud-clone Corp, Houston, TX, USA.)를 사용하여 측정하였다. 혈장시료와 표준용액을 pre-coated microplate에 넣은 뒤 밀봉하여 37℃에서 2시간 동안 incubation시켰다. 그 후 용액을 제거한 뒤 detection reagent A를 넣고 밀봉하여 37℃에서 1시간 동안 incubation한 뒤 wash buffer로 washing했다. 용액을 제거한 뒤 detection reagent B를 넣은 후 37℃에서 30분 동안 incubation시켰다. 이를 washing한 후 용액을 제거하고 기질 용액을 첨가하여 37℃에서 20분 동안 암조건 하에서 incubation시켰다. 이후 반응정지액을 넣어 450 nm에서 즉시 흡광도를 확인하였다.

혈장 지질분석

혈중 총 콜레스테롤, 중성지방, high-density lipoprotein (HDL) 콜레스테롤 함량은 각각의 측정용 키트(ASAN pharmaceutical Co. Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다.

정자 수 및 운동성 측정

실험쥐의 부고환을 적출하여 수술용 가위로 잘게 자르고 이를 0.5% BSA를 포함하는 M199 media에 넣어 준 후 37℃로 10분간 incubation하여 정자를 채취하였다. 채취된 정자를 체내와 유사한 환경으로 유지하기 위해 32℃의 M199 media로 1차 희석하였다. 희석액에서 100 μl를 취하고 media 900 μl을 넣어 2차 희석을 해주었다. 이후 2차 희석액에서 10 μl를 취하여 hemocytometer에서 counting하였다. 정자의 운동성은 위에서처럼 counting한 것에서, 활동하는 정자 수의 비율을 측정하여 계산하였다.

강제유영운동

강제유영을 위해 플라스틱 통(50 W×40 D×60 H cm)에 약 40 cm 높이만큼 멸균수를 채우고 수중히터(Aquarium Heater, EIEIM GmbH&Co. KG., Deizisau, Germany)를 사용하여 수온을 25±2℃로 유지시켜 주었다. 각각의 군별로 8마리씩 최대유영능(exhaustive swimming)을 확인하기 위해 실험을 진행하였고, 유영 중 쥐들의 코가 물 아래로 2초 이상 빠지는 횟수가 5번 이상일 때를 탈진으로 간주하여 그때까지의 시간을 측정하였다.

간독성 측정

간기능의 지표인 혈중 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase)의 함량은 혈장 AST, ALT 측정용 kit (ASAN pharmaceutical co Ltd.)를 사용하여 분석한 후 파장 505 nm에서 흡광도를 측정하였다.

TM3 cell의 testosterone 농도 측정

TM3 cell의 testosterone 농도 측정은 testosterone 측정용 키트(Enzo life sciences)를 이용하여 실험하였다. 세포실험에 사용된 TM3 세포주는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank [KCLB], Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 60 mm culture dish (SPL life science, Gyeonggi-do, Korea)에 10% FBS가 첨가된 DMEM/F-12 medium (Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Grand island, NY, USA)과 1×106개의 세포를 넣어주어 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 동안 균일하게 배양하였다. 이후 PBS로 wash한 뒤 배지를 갈아주었고 민들레 추출물 및 발효추출물을 각 농도에 맞게 처리한 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 취하여 사용된 키트의 product manual에 따라 처리하고 측정하였다.

Real-time qPCR을 통한 mRNA 비교 분석

Testosterone 생합성에 관여하는 효소들의 유전자 발현량을 비교하기 위해 TM3 cell로부터 Trizol Reagent (Gibco BRL)를 이용해 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 ThermoScript RT-PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 이용해 cDNA를 합성한 뒤 real-time PCR (Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block, Bioneer, Daejeon, Korea)로 측정하였다. 사용된 primer로 17β-HSD3는 forward 5′-GTTCTCGCAGCACCTTTTTC-3′, reverse 5′-CAGCTTCCAGTGGTCCTCTC-3′, 3β-HSD4는 forward 5′-CTCCACAGCCAACCCAGTAT-3′, reverse 5′-ACAGTATGGGCACAGGAAGG-3′, 17, 20-Desmolase는 forward 5′-CCTGCTGGAAGGTGTAGCTC-3′, reverse 5′-CCTGCTGGAAGGTG TAGCTC-3′로 사용했고 대조유전자인 GAPDH의 경우 forward 5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′, reverse 5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′로 사용하였다.

통계처리

모든 분석 자료는 평균±표준오차(mean±SE)로 나타냈으며 실험결과 분석은 Graph pad Prism 5.0 프로그램(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 통해 진행하였다. 이번 실험에서 얻은 결과에 대해 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, 2-sample Student′s t-test를 이용하여 대조군과 실험군 간의 유의성을 p<0.05 수준에서 사후 확인하였다.

 

결과 및 고찰

민들레 추출물 및 발효추출물 투여 후 혈중 testosterone의 변화

Testosterone은 남성생식 기능을 조절하는 대표적인 스테로이드성 호르몬으로 유리된 형태로 존재하거나 성호르몬 결합글로불린, 혈중 단백질, 및 알부민과 결합하여 존재한다[40]. Testosterone은 시상하부-뇌하수체의 지배하에 고환의 Leydig cell에서 생성되고 사춘기 이후의 이차 성징과 남성화, 성기능 유지에 중요하며, 근육을 형성하는 작용을 하고, 인지기능, 혈관의 유연성, 지질대사 등에 폭넓게 관여하고 있다[48]. 남성호르몬의 감소는 집중력 및 의욕 저하, 기억력 감퇴, 근력 및 근육량 감소, 체지방 증가, 비뇨기능 및 남성기능 쇠약 등의 남성갱년기 증상과 연관성이 있다[19]. 그에 따라 임상에서는 이러한 남성갱년기의 치료를 위해 testosterone의 보충요법이 시행되고 있는 실정이다. 심혈관계 질환 증가, 전립선암 발생 및 악화, 폐쇄성 수면 무호흡증, 적혈구증가증 등의 부작용 발생 가능성도 알려져 있어 보다 안전한 남성갱년기 개선 치료법의 필요성이 요구된다[35]. 본 연구에서는 민들레 추출물의 처리가 testosterone의 분비에 어떤 영향을 주게 되는지를 확인하기 위해, 4주간 흰쥐에 투여한 후 혈중 testosterone level의 변화를 매주 측정하였다(Fig. 1). 투여 전(0주) testosterone level의 경우 대조군과 실험군을 비교하였을 때 각각 243±38.23 pg/ml과 255.15±27.69 pg/ml으로 비슷한 수준을 보였다. 4주동안 매주 DE 및 FDE 투여 후 testosterone의 혈중농도를 측정한 결과, 약 3주째부터 투여군의 혈중 testosterone 농도가 상승하기 시작하여 4주째에는 대조군의 경우 251.37±43.35 pg/ml로 투여전과 별다른 차이를 보이지 않았으나, 투여군들은 증가하여 DE 30과 DE 60의 경우 각각 282.54±47.34 pg/ml, 306.52±41.24로 투여전보다 약 13.7%, 25.1% 상승하였다. FDE 투여군은 통계적으로 유의하게 증가하여 FDE 30에서 331.46±45.18 pg/ml로 약 38.4%의 증가를 나타내었으며 FDE 60에서는 366.52±38.26 pg/ml로 약 50.8%의 증가를 보였다. 이는 testosterone 생성에 있어 FDE 투여가 DE 보다 더 효과적임을 의미하며 발효과정에서 민들레의 생리활성 물질이 증가한 결과로 사료된다. 이러한 결과는 4주간 진행된 민들레 추출물의 투여가 Leydig cell의 testosterone 생성 능력을 증가시킨 점에서 testosterone의 감소로 인해 나타날 수 있는 남성갱년기 증상에 있어 긍정적인 효과를 보여줄 수 있을 것으로 사료된다. 민들레는 sesquiterpenes, saponins, phenolic compounds, flavonoids 그리고 sugars 등을 여러 성분들을 함유하고 있는데[34], 이들 중 몇 가지 성분들은 testosterone과 연관되어 있다. saponin은 혈중 testosterone 농도를 증가시킨다는 연구 결과가 있고[49], flavonoid는 미성숙한 수컷 흰쥐의 정소, 부고환의 발달을 촉진하며, rat의 testosterone 및 LH 분비를 자극하여 생식과 내분비 기능에 활력을 준다는 보고도 있다[11]. 또한 phenolic compounds는 부고환의 정자 농도와 정자의 운동성 증가와 비정상적인 정자를 감소시켰다는 보고가 있다[15]. 다른 연구에 의하면 민들레 발효추출물은 민들레 추출물보다 유산균 발효를 통해 α-amylase, protease 그리고 혈전용해효소가 높게 활성화 되고, 이들이 민들레 조직에 화학적인 영향을 주어 생리활성 성분이 늘어남으로써 총 phenolic compounds가 더 많이 생성된다[26]. 따라서, 선행 연구 결과들에 근거하여 민들레도 testosterone에 효과가 있을 것이라고 여겨지며, 전반적인 결과가 민들레 추출물보다 민들레 발효추출물에서 더 좋은 효과를 나타낸 것으로 판단된다. 또한 추후 연구에서 민들레 추출물 성분에 대한 탐색이 더 필요할 것으로 여겨진다.

Fig. 1.The increase of serum testosterone levels after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student′s t-test. *p<0.05; **p<0.01.

민들레 추출물 및 발효추출물 투여에 따른 혈중 PSA의 변화

PSA는 전립선 이외의 조직에서는 거의 발현되지 않고 전립선의 상피세포에서만 합성되는 단백분해효소로 전립선암의 선별에 유용한 종양표지자로 사용되나, 전립선염, 전립선 비대증, 전립선 경색에서도 증가할 수 있다[5, 28]. Testosterone 보충요법에서 유의해야 할 부분은 전립선암 발생의 증가 또는 잠재적 전립선암의 악화에 대한 것이다[8]. 남성갱년기의 치료에 있어 남성호르몬 보충요법과 전립선암 또는 전립선 비대증의 발생 위험성에 대한 관계는 수십 년 동안 논란의 대상이 되고 있다. 하지만, 이 두 질환 모두 남성 호르몬 의존적이며 남성호르몬 박탈요법이 효과적임은 잘 알려진 사실임을 고려할 때 주의를 기울여야 하는 것은 사실이다. 전립선암이나 전립선 비대증과 같은 전립선 질환이 testosterone 보충요법으로 인해 발생하거나 악화되는지에 대한 구체적이고 명확한 연구 결과는 없으나, 일부 연구에서는 testosterone 보충요법이 PSA의 증가 및 전립선암 발생의 증가에 영향이 있는 것으로 보고하고 있으므로 임상에서 남성호르몬 보충요법 전후에 세밀한 추적관찰을 시행하고 있다[9]. 그러므로 본 실험에서는 민들레 추출물의 투여가 전립선에 부정적인 영향을 미치게 되는지 확인하기 위하여 4주간 추출물 투여 후 혈중 PSA의 변화를 측정하였다(Fig. 2). 실험 결과에서 대조군과 실험군 간의 유의적 차이는 보이지 않았다. 이러한 결과로 봤을 때, DE 및 FDE의 투여는 전립선에 있어 특별한 부작용을 나타내지는 않는 것으로 사료된다.

Fig. 2.No difference of serum PSA levels after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW).

민들레 추출물 및 발효추출물 투여에 따른 혈중 SHBG의 변화

SHBG는 간에서 생성되는 호르몬 특이적 결합 단백질로 testosterone의 경우 약 40-60%가 SHBG와 결합하여 체내에서 불활성화 상태로 존재하며, SHBG에 결합된 testosterone은 호르몬의 활성을 잃는 반면, 분리된 free testosterone은 호르몬으로서 생물학적 활성을 나타낸다[47]. 따라서 SHBG는 testosterone의 생체 내 작용을 조절하는 역할을 한다[39]. 남성이 나이가 들수록 SHBG의 농도가 증가하므로 free testosterone 농도를 낮추는 작용을 하며 이는 남성갱년기와 대사장애 등을 유발하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다[44]. 또한, 이전 연구들에서 남성의 나이가 증가할수록 SHBG가 증가하는 것으로 보고하였다[18, 25, 32]. DE와 FDE의 투여가 SHBG 수준의 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 4주간 추출물 투여를 진행한 투여군과 대조군 간의 혈장 내 SHBG값의 변화를 측정하였다(Fig. 3). 대조군(187.24±25.23 ng/ml)과 비교해 봤을 때, DE 30은 170.43±31.23 ng/ml로 약 10% 감소함을 보여 유의미한 차이는 나타나지 않았으나, DE 60은 146.26±24.78 ng/ml로 약 22% 감소함을 나타내었다. FDE의 경우 FDE 30에서 153.52±27.54 ng/ml로 약 18% 감소, FDE 60에서 119.75±32.51 ng/ml로 약 36% 감소한 것으로 나타났다. 따라서 이 결과에서도 같은 용량을 투여한 경우 FDE 투여가 DE 보다 SHBG 감소 효과가 더 높음을 보여주었고, 대조군과 비교하였을 때 체내에 활성화된 형태인 free testosterone의 농도를 더 높게 유지시킬 수 있을 것으로 사료된다. 아직 이러한 결과에 대한 기작은 알려지지 않았으며, 추후 FDE가 SHBG를 어떻게 감소시키는 지에 관한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Fig. 3.The decrease of serum SHBG levels after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student′s t-test. *p<0.05; **p<0.01.

민들레 추출물 및 발효추출물 투여에 의한 혈중지질의 변화

중년 이후 남성에서 흔히 나타나는 비만, 지질대사이상, 내 당능이상, 고혈압, 뇌심혈관계질환 등 대사증후군은 testosterone의 감소로 인해 나타날 수 있다[45]. 여러 조사결과들에서 건강한 남성의 비만증상과 혈청 testosterone의 감소는 밀접한 연관이 있다는 점이 알려졌으며, 2형 당뇨병과 대사증후군도 감소된 testosterone 수치와 연관성이 있다고 하였다[14, 37]. 혈중 지질의 이상은 심혈관 관련 질환의 위험성을 높게 만든다. 다른 여러 연구결과에서 testosterone의 저하상태에서 혈중 HDL 콜레스테롤의 감소와 중성지방의 증가가 보고된 바 있다[29, 41]. 본 실험에서는 민들레 추출물의 처리를 통해 혈중지질대사 이상이 개선될 수 있는지 확인하기 위해 4주간 추출물을 투여 후 혈중 총 콜레스테롤, 중성지방, HDL 콜레스테롤 등의 변화를 확인하였다. 혈중 총 콜레스테롤의 경우 대조군이 69.1±6.7mg/dl인 것에 반해, 투여군에서는 전체적인 감소를 보였다. 특히 DE 60과 FDE 60에서 각각 56.7±8.6 mg/dl, 48.9±10.4 mg/dl로 통계적으로 유의한 감소 효과를 나타내었다(Fig. 4A). 중성지방의 경우에도 투여군 모두에서 다소 감소하였으나 FDE 60에서 98.9±28.5 mg/dl로 대조군의 146.1± 30.2 mg/dl와 비교했을 때 약 48% 유의적으로 감소함을 보였다(Fig. 4B). HDL 콜레스테롤의 결과에서는 대조군의 값인 15.0±3.6 mg/dl과 비교하였을 때 DE 30에서 15.7±3.2 mg/dl로 특별한 차이를 보이지 않았다. DE 60과 FDE 30에서도 각각 18.2±2.9 mg/dl, 18.7±4.6 mg/dl로 다소 증가하였으나 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 반면, FDE 60 투여군에서는 23.7±5.0 mg/dl로 대조군에 비해 약 58% 유의적인 증가를 나타냈다(Fig. 4C). 이러한 민들레 추출물의 혈중지질 개선효과는 Liu 등의 연구와 Davaatserene 등의 연구에서 민들레 추출물이 지질대사에 관여하는 adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 증가시켜 지방연소 촉진, 콜레스테롤 및 중성지방 합성 저해, 조직 내 지방 축적 방지 등의 효과를 보였다는 결과[12, 33]와 일치한다. 따라서, 이러한 결과로 민들레 추출물의 투여가 남성갱년기에서 나타날 수 있는 혈중지질대사 이상의 개선에 긍정적인 효과를 줄 것으로 사료된다.

Fig. 4.The effect of dandelion extract on total cholesterol (A), triglyceride (B), and HDL cholesterol (C) after 4-week administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student′s t-test. *p<0.05.

민들레 추출물 및 발효추출물 투여에 따른 지방 및 근육의 변화

남성갱년기에서 나타나는 근육량 감소와 체지방 증가는 근력약화와 무력감을 동반한다[3]. 따라서 각 추출물의 투여가 체지방과 근육량에 미치는 영향을 알아보기 위해 대퇴부 근육량과 부고환 지방 조직을 측정하였다. DH 및 FDH를 4주 동안 투여 후 확인한 결과 부고환 지방 조직/몸무게의 비율은 대조군의 경우 0.018±0.004이었고, DE 30와 FDE 30에서 각각 0.017±0.002, 0.016±0.003으로 감소한 것을 확인했고 유의적 차이는 나타나지 않았다. 그에 반해 DE 60와 FDE 60에서는 각각 0.015±0.003와 0.012±0.004로 저용량 군에 비해 감소하였으며, 특히 FDE 60는 통계적으로 유의한 감소를 보였다(Fig. 5A). 또한 대퇴부 근육량/몸무게 비율은 대조군에서 0.020±0.005이었고, DE 30과 FDE 30에서는 각각 0.021±0.006과 0.022±0.007로 약간 증가하였으나 유의적인 차이를 보이진 않았다. 반면 상대적으로 고용량을 투여한 군들에서는 DE 60에서 0.024±0001, FDE 60에서 0.028±0.003로 각각 나타났으며 모두 통계적으로 유의하게 증가되었다(Fig. 5B). 이들 결과로 DE 및 FDE의 투여가 체지방을 감소시키며 근육량은 증가시키는데 도움을 준 것으로 사료된다. Liu 등의 연구에서 민들레 추출물은 지방대사에 관여하는 AMP-activated protein kinase 활성을 조절하여 지방의 축적을 감소시킨다고 보고하였고[33], González-Castejón 등은 민들레 추출물이 지방대사와 합성에 관여하는 유전자 발현을 조절하여 이를 방지하므로 비만 치료제로서의 가능성을 제시하였는데[17], 이는 본 연구의 결과와 일치하는 것이다. 또한, 근육량과 민들레 추출물과의 연관성은 아직 정확하게 밝혀진 바는 없지만 민들레 추출물 투여로 인한 testosterone의 증가가 근육량에 영향을 준 것으로 생각된다. 따라서 민들레 추출물이 남성갱년기에서 흔히 나타나는 체지방 증가와 근육량 감소를 지연시킬 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 5.The change of EFP (A) and vastus lateralis muscle (B) after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student′s t-test. * p<0.05; ** p<0.01.

민들레 추출물 및 발효추출물 투여에 따른 정자 수의 변화

고환의 Leydig 세포에서 분비되는 testosterone은 정자가 형성되는 세정관을 구성하는 Sertoli 세포에 작용하여 정원세포로부터 정자로 발달되는 과정에 깊이 관여하며, 정자의 생성 및 운동성에 중요한 영향을 미친다고 알려져 있다[38]. 따라서 민들레 추출물의 투여로 증가된 testosterone의 결과(Fig. 1)를 바탕으로 추출물의 투여가 정자 수와 운동성에 어떠한 영향을 미치는지 측정하였다. 총 정자 수에서 대조군은 5.55±0.36××107의 정자 수를 가졌고, DE 투여군인 DE 30과 DE 60에서는 각각 5.61±0.56×107과 5.75±0.21×107로 약간 증가하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 반면 FDE 투여군인 FDE 30에서 6.25±0.38×107로 다소 증가하였고, FDE 60에서는 6.95± 0.61×107의 총 정자 수를 가져 약 25%가 유의적으로 증가하는 양상을 보였다(Fig. 6A). 그 중 운동성을 지닌 정자 수에 대한 측정결과에서 대조군은 2.68±0.32×107, DE 30은 2.96±0.41×107, FDE 30은 3.33±0.49×107으로 유의한 변화는 나타나지 않았지만 다소 증가하는 모습을 보였다. 반면에, DE 60과 FDE 60에서는 각각 3.40±0.36×107, 4.33±0.54×107로 유의한 증가를 보였다(Fig. 6B). 이같은 결과는 민들레 추출물의 투여가 정자의 형성과 운동성을 향상시키는 것임을 보여주며, testosterone 분비가 촉진되고 SHBG는 감소하여 생체 내 활성화된 testosterone의 작용이 증가했기 때문으로 사료된다.

Fig. 6.The change of total sperm (A) and motile sperm (B) counts after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student′s t-test. * p<0.05; **p<0.01.

민들레 추출물 및 발효추출물 투여에 따른 운동수행능력의 변화

앞선 실험과 같은 근육량의 증가가 운동수행능력의 변화에 어떤 영향을 줄 수 있는지를 확인하기 위하여 4주간 DE 및 FDE를 투여하였으며, 매주 강제 수영능력을 평가하였다(Fig. 7). 약 3주차부터 대조군과 실험군과의 차이가 나타나기 시작하였다. 특히 4주차에서 비교한 결과 최대수영시간이 대조군은 74±22초에 그쳤으나, 민들레 추출물 투여군들은 모두 증가하여 DE 30은 100±37초, DE 60은 124±45초, FDE 30은 157±31초, FDE 60은 188±28초로 각각 측정되었다. DE 투여군에서는 대조군과 비교하였을 때 유의적으로 큰 차이를 보이지 않았으나 FDE 투여군과의 비교에서는 유의적 차이를 확인할 수 있었다. 이 결과는 민들레 추출물의 투여가 실험동물의 운동능력 향상에 도움을 주었음을 나타낸 것으로 특히 FDE 투여군에서 더 높은 효과를 볼 수 있었다. 이는 민들레 추출물의 투여가 육체적 피로도를 감소시켰다는 Jinchun 등과 Lee 등의 결과와 일치하는 결과이다[22, 30]. 또한 testosterone과 같은 남성 호르몬이 근력, 근육량 및 운동수행능력의 향상에 영향을 미친다는 연구[13, 16]와 노년 남성의 testosterone 보충이 운동능력을 향상시켰다는 보고[4]를 고려할 때, 민들레 추출물의 투여에 의해 증가한 testosterone이 운동수행능력의 향상에 영향을 준 것으로 사료된다.

Fig. 7.The effect of dandelion extract on endurance capacity for swimming after 4-week administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student′s t-test. * p<0.05; ** p<0.01

민들레 추출물 및 발효추출물의 간독성 평가

AST와 ALT는 생체 내 아미노기 전이반응을 촉매하는 효소로서 간에 많은 양이 존재하며, 간독성으로 인한 간세포의 괴사 또는 간조직이 파괴되었을 때 세포 밖으로 유출되고 혈중 농도가 증가하게 되어 임상에서 간손상의 지표로 많이 사용되는 효소이다[46]. 천연물 추출물 투여의 경우 예상치 않은 간기능 이상이 있는 경우가 있으므로, 본 실험에서는 민들레 추출물 및 발효추출물의 안전성 확보를 위해 사용된 민들레 추출물 및 발효추출물을 실험동물에 장기간 섭취시킬 때 간기능에 영향이 있는지 알아보고자 4주간 투여 후 혈중 AST, ALT 수치를 측정하였다(Fig. 8). 대조군과 투여군을 비교했을 때 AST, ALT 모두에서 별다른 차이를 보이지 않았으며, 이는 4주간의 추출물 투여가 간독성을 나타내지 않았고 간기능에 특별히 부정적인 변화를 일으키지 않은 것으로 생각된다.

Fig. 8.Serum levels of AST and ALT after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW).

민들레 추출물 및 발효추출물 투여가 TM3 cell의 testosterone 분비와 testosterone 합성 관련 유전자 발현에 미치는 영향

동물실험에서 나타난 DE의 testosterone 분비 증가와 그 기작을 알아보기 위해서 mouse Leydig cell인 TM3 세포주를 이용하여 그 효과를 조사하였다[36]. TM3 세포주에 DE 및 FDE를 각각 20 μg/ml과 40 μg/ml로 처리하고 48시간 후에 배양액의 testosterone 농도를 측정한 결과 대조군에서는 42.07±14.26 pg/ml이었고 DE 20, DE 40, FDE 20 군에서는 43.77±12.56~49.40±13.49 pg/ml 수준으로 다소 증가하였으나 통계적으로 유의하진 않았다. 반면에 FDE 40군에서는 60.53±18.37 pg/ml로 유의한 증가를 나타냈다(Fig. 9A). 또한 민들레 추출물이 TM3 세포에서 testosterone 합성을 어떻게 증가시키는지 알아보기 위해 testosterone 합성과정에 관여하는 효소의 유전자 발현량을 real-time qPCR로 측정하였다. Testosterone 생합성 과정에서 androstenedione을 testosterone으로 변환하는 17β-HSD3는 민들레 추출물을 처리 하였을 때 대조군에 비해 DE 20, DE 40, FDE 20 군에서 약 1.2~1.5배 증가하였으나 통계적으로 유의하진 않았다. FDE 40 군에서는 약 2.1배의 유의적인 증가를 나타냈다(Fig. 9B). Testosterone 생합성 과정 중에 pregnenolone과 androstenediol을 progesterone과 testosterone으로 변환시키는 3β-HSD4도 민들레 추출물 처리군에서 전반적으로 증가하였고, 특히 FDE 20에서 대조군에 비해 약 1.4배, FDE 40에서 약 1.7배의 증가를 보여 통계적으로 유의하였다(Fig. 9C). progesterone으로부터 생성된 17-OH progesterone을 dehydroepiandrosterone (DHEA)과 androstenedione로 변환시키는 17, 20-desmolase의 경우도 처리군 전체적으로 발현량이 증가하여 DE 20, DE 40, FDE 20 군에서 대조군과 비교하여 약 1.2~1.4배 증가하였고, FDE 40 군에서는 약 1.7배 증가하여 유의적인 차이를 나타냈다(Fig. 9D). 이러한 결과로 민들레 추출물은 testosterone을 분비하는 고환의 Leydig cell에 직접 작용하여 전사 단계에서 testosterone 합성에 관여하는 효소들의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 특히 FDE 40는 모두 통계적으로 유의한 값을 보여 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다. 추후에 적정 용량과 나타날 수 있는 부작용에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Fig. 9.The increase of testosterone secretion (A) and the gene expressions of 17β-HSD3 (B), 3β-HSD4 (C), and 17, 20-desmolase (D) in dandelion extract treated TM3 cell line. Control; no treatment of dandelion extract, DE 20; dandelion extract treated group (20 μg/ml), FDE 20; fermented dandelion extract treated group (20 μg/ml), DE 40; dandelion extract treated group (40 μg/ml), and FDE 40; fermented dandelion extract treated group (40 μg/ml). Asterisk indicates statistically significant difference by Student′s t-test. *p<0.05; **p<0.01.