Phylogenetic Diversity and Community Analysis of Marine Bacteria Associated with Ulva pertusa

구멍갈파래(Ulva pertusa)에 서식하는 해양세균의 계통학적 다양성 및 군집구조 분석

Abstract

The present study was done to assess the diversity of the bacterial community associated with Ulva pertusa collected from Jeju Island using Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) marker analysis. For RFLP analysis, a total of 145 bacterial strains associated with Ulva pertusa were screened and cultivated using Marine agar and R2A agar. The PCR amplicons of the 16S rRNA gene from all the isolated strains were digested with HaeIII and RsaI restriction enzymes and then classified into different groups according to their restriction patterns. Strains selected based on the RFLP patterns showed more than 91% 16S rRNA gene sequence similarity when compared with known bacterial species, which include 4 phyla - proteobacteria (alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria, gamma-proteobacteria - 63%), firmicutes (11%), actinobacteria (4%), bacteroidetes (22%)–as well as 7 classes (actinobacteria, flavobacteriia, cytophagia, bacilli, α-proteobacteria, γ-proteobacteria, β-proteobacteria), 13 orders, 18 families, and 27 genera. These results confirmed a wide diversity of bacterial communities as contrasted with other regions. The newly isolated 10 strains, which show 16S rRNA sequence similarity of <97% compared to previously identified bacteria, could be noble species. Further experiments, such as morphological, physiological, and biochemical classification, are necessary to confirm the novelty of the newly isolated 10 strains.

이 논문은 제주도에서 채집한 구멍갈파래(Ulva pertusa)를 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)를 이용하여 세균군집을 조사하였다. RFLP 분석을 위해 Marine agar배지와 R2A배지를 사용하여 145개의 균주가 분리되었으며, 제한효소 HaeⅢ와 RsaⅠ을 이용하여 서로 다른 RFLP 패턴을 구분하였다. RFLP 패턴 결과로부터 균주를 선별하여 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과, 알려진 균주의 염기서열과 91% 이상의 유사도를 보였다. 주요 계통군은 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria) (63%), Bacteroidetes (22%), Firmicutes (11%), Actinobacteria (4%)로 4개의 문이 관찰되었고, 7개의 강, 13개의 목, 18개의 과, 27개의 속으로 관찰되었다. 계통학적 분석 결과, 상동성이 97% 미만으로 나타난 10균주가 새로운 속이나 종으로 분류될 가능성이 높게 나타났으며, 신종 후보 균주에 대한 형태학적, 생리학적, 생화학적 등 분류·동정을 위한 추가적인 실험을 수행해야 할 것이다.

서 론

해조류는 연안지역 생태계에 중요한 역할을 하며, 표면은 미생물이 서식할 수 있는 장소가 되고[2, 3, 12, 14, 36], 표면에 서식하는 미생물은 해조류와 상호작용을 하여 긍정적인 효과를 가져온다[5].

갈파래과에 속하는 구멍갈파래는 단독 또는 2-3가닥씩 무리를 형성하고 10-30 cm 또는 그 이상 자라며 최근 제주도 해안에서 우점하여 대량 번식하는 종으로 해안경관을 망치고 있으며, 인력과 비용문제로 인해 처리에 문제가 되고 있다[11, 15, 17]. 이러한 문제로 구멍갈파래에 관심이 집중되고 있으며 구멍갈파래의 추출물로부터 생리활성물질 연구가 진행되고 있다[23-25]. 최근 제주해양수산자원연구소는 폐기물인 구멍갈파래를 전복사료로 사용하여 자원으로서 이용할 수 있는 방법을 연구 중이다[15].

미생물 종 다양성분석에 이용되는 분자생물학적 방법으로는 ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis), T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) 등이 있다[4, 6, 28, 31, 35]. RFLP는 제한효소를 이용하여 rRNA 단편을 잘라 패턴을 분석하는 방법이다. 실험방법이 간편하고 신속하며, 사용하는 제한효소 종류에 따라 패턴이 다르므로 미생물의 속과 종의 구분에 이용되고 있다[13, 26, 33].

본 연구에서는 현재 제주연안에 문제가 되고 있는 구멍갈파래(Ulva pertusa)에서 서식하는 세균을 탐색하기 위해 분리·배양하고 2종(HaeⅢ, RsaⅠ)의 제한효소를 이용한 RFLP 분석과 16S rRNA을 비교하여 세균의 다양성을 파악하고자 한다.

 

재료 및 방법

시료채집 및 세균분리

본 연구에서 사용한 구멍갈파래(Ulva pertusa)는 제주도 제주시 조천 신흥리에서 채집하였다. 채집한 구멍갈파래는 멸균된 핀셋을 이용하여 지퍼백에 담아 운반하여 실험에 사용하였다.

채집한 구멍갈파래는 인공해수로 1회 세척한 후, 잘게 잘라 멸균한 0.85% NaCl 30ml에 넣어 homogenizer로 약 3시간 동안 균질화 하였다. 균질화한 시료를 연속희석방법으로 희석한 후, Marine Agar (MA, Difco, USA)배지와 R2A Agar (Difco, USA)배지에 도말 하여 25℃에 일주일 동안 배양하였다. 각 배지에 자라난 Colony를 모양, 크기, 색깔 등 형태적 특징에 따라 선별하여 순수분리 하였다. 분리된 균주는 −80℃에 20%(v/v) Glycerol로 동결 보관하였다.

DNA 추출 및 PCR

순수분리한 균주는 2.5% Chelex (Chelex® 100 Molecular Biology Grade Resin, BIO-RAD, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 2.5% Chelex에 분리 균주를 넣고 95℃에 5분 동안 반응시킨 후 4℃에 보관하여 사용하였다.

PCR을 하기 위해 27 Forward (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) primer와 1522 Reverse (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′) primer를 사용하였다. AccuPower™ PCR Pre-Mix (Bioneer, USA)에 DNA 1 μl를 첨가한 후 최종부피 25 μl로 맞추어 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 Initial denaturation 5분, 94℃에서 Denaturation 1분, 55℃에서 Annealing 1분, 72℃에서 Extention 1분을 30 cycle 수행한 후 72℃ Final extention 10분간 PCR (Base for Gene Pro Thermal cycler, BIOER) 조건하에 실시하였다. 증폭된 PCR product는 1% agarose에서 전기영동(Mupid®-ex, ADVANCE) 하여 확인하였다.

RFLP 분석

RFLP을 위해 제한효소 HaeⅢ (Ezynomics, Korea)와 RsaⅠ (Ezynomics, Korea)를 사용하였다. 증폭된 PCR산물 10 μl, 제한효소 1 μl, EZ Buffer Ⅳ 2 μl, 멸균 증류수 7 μl를 넣은 후 최종부피 20 μl로 맞추어 37℃에서 2시간 30분 반응시켰다. 반응물 20 μl을 2.5% agarose에 loading하여 50 vol에 4시간 동안 전기영동 하였다. UV로 관찰하여 총 145 균주의 PCR-RFLP 패턴을 비교하였다. RFLP 패턴결과 균주를 선정하여 (주)제노텍(Daejeon, Korea)에 16S rRNA 염기서열을 분석하였다.

분리 균주의 계통학적 분석

분석한 염기서열을 EzTaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)[16]에서 유사한 염기서열과 비교하고, 가장 가까운 속 또는 종으로 나타나는 서열을 확인하였다. 본 연구에서 결정된 염기서열과 EzTaxon-e 에서 나타난 염기서열의 multiple alignment정렬은 Mega 6.0 software [29]에 포함된 Clustal X[30]프로그램을 이용하였다. Tree topology의 작성은 Jukes and Cantor (1969) 방법으로 계산하고 neighbor-joining 방법으로 작성하였다. Tree topology의 신뢰성 평가를 위해 1,000회의 replication을 적용한 bootstrap 분석[21]을 하였다.

 

결과 및 고찰

순수분리 및 RFLP 분석

형태적 특징에 따라 분리된 배양 가능한 세균은 MA배지에서 82개의 균주와 R2A배지에서 63개의 균주로 총 145개의 균주가 분리되었다. MA배지에서 분리한 82개의 균주를 두 종류의 제한효소를 이용한 결과, HaeⅢ에서는 39 type, RsaⅠ에서는 36 type이 관찰되었다. R2A배지에서 분리한 63개의 균주는 HaeⅢ에서는 32 type, RsaⅠ에서 33 type이 관찰되었다(Fig. 1).

Fig. 1.Representative agarose gel electrophoresis patterns of HaeⅢ (A) and RsaⅠ(B) digested amplified 16S rRNA genes of bacterial strains isolated from U. pertusa.

염기서열 분석 및 계통학적 분석

RFLP 분석에 의해 총 104개의 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 EzTaxon-e 를 이용하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하고, 계통수를 작성하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Phylogenetic tree based on comparison of the 16S rRNA gene sequences of bacteria isolated from Ulva pertusa and some other related taxa. GenBank accession numbers are given in parentheses. Boostrap values (>50%) based on 1,000 replications are shown. Bar 0.05 nucleotide substitutions per nucleotide position.

구멍갈파래에서 분리한 104개의 균주는 27속 50종으로 동정되었다. Proteobacteria 그룹은 기존에 보고된 염기서열과 95.60-100%의 상동성을 나타내었다. M64와 M80은 Alteromonas litorea TF-22T와 97.42%, 97.39%의 유사도를 나타내고. M117은 Octadecabacter temperatus SB1T와 97.81%의 상동성을 보여 주었다. M87은 Alteromonas mediterranea DET와 97.44%의 유사도를 나타내었고, M66, M84은 각각 Paracoccus homiensis DD-R11T, Leisingera daeponensis TF-218T와 97.49%와 97.15%의 상동성을 보여주었다. M102은 Paraglaciecola aquimarina GCW-M5T와 95.60%의 낮은 유사도를 나타내었다.

Firmicutes 그룹에 속해 있는 균주는 모두 기존에 보고된 염기서열과 99.21-99.73%의 상동성을 보여주며, Actinobacteria 그룹은 98.38-99.65%의 유사도를 나타내었다. Bacteroidetes 그룹에 속하는 균주는 91.09-99.93%의 상동성을 보여주며, 그 중 Flavobacterium 속은 낮은 유사도를 나타내었다. R11은 Flavobacterium jumunjinense HME 7102T와 95.94%의 상동성을 보이고 R39는 Flavobacterium omnivorum JCM 11313T와 97.10%의 유사도를 나타내었다. R54, R91, R92는 Flavobacterium pectinovorum DSM 6368T와 각각 97.19%, 97.12%, 97.25%의 상동성을 보여주었다. 이와 같이 16S rRNA 유전자 염기서열과 비교한 104개의 균주 중 10개의 균주는 표준균주와 유전자 염기서열이 97% 이하의 유사도를 보여 신종 후보 균주임을 알 수 있다. 따라서 앞으로 표준균주와 함께 신종 실험이 진행 되어야 할 것으로 판단된다.

16S rRNA gene 염기서열로 세균군집 다양성을 분석하고 계통수를 작성하였다. 그 결과, 구멍갈파래의 세균 군집구조는 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria), Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes로 4개의 문, 7개의 강, 13개의 목, 18개의 과, 27개의 속으로 구성되었다. 그 중 Proteobacteria 문의 Alpha-proteobacteria 강은 2개의 목, 2개의 과 6개의 속으로 Gamma-proteobacteria 강은 5개의 목, 9개의 과, 10개의 속으로 Bacteroidetes 문은 2개의 강, 2개의 목, 2개의 과, 6개의 속으로 구성된 분류군이 나타났다(Table 1).

Table 1.Bacterial diversity associated with Ulva pertusa

구멍갈파래의 분류군은 Flavobacterium 12%, Pseudoalteromonas, Alteromonas 각 각 10%, Pseudomonas 8%, Aeromonas, Microbacterium 각 각 6%, Vibrio, Bacillus, Exiguobacterium 각 각 4%, Hydrogenophaga, Cellulophaga, Nonlabens, Maribacter, Olleya, Lacihabitans, Streptococcus, Ruegeria, Loktanella, Paracoccus, Leisingera, Octadecabacter, Erythrobacter, Cobeta, Oceanospirillum, Paraglaciecola, Shewanella, Actinbacter 각 각 2%로 구성되었다(Fig. 3).

Fig. 3.Pie-diagram showing various genus of bacterial isolates from Ulva pertusa.

Proteobacteria 분류군은 Alpha-proteobacteria 22%, Betaproteobacteria 4%, Gamma-proteobacteria 37%에 속하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Ulva sp.에는 Gamma-proteobacteria가 우점한다는 결과와 일치한다[5, 7-9, 34]. 따라서 Ulva sp.에서는 Proteobacteria와 Bacteroidetes가 우점하여 나타난 것을 알 수 있었으며 이러한 결과는 대부분의 해양환경에서 Proteobacteria와 Bacteroidetes가 우점으로 존재한다는 결과와 일치한다[1, 10].

그리고 호주에서 채집한 Ulva sp.에서는 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria)와, Bacteroidetes로 2개의 문에 속하는 그룹이 보고되었으나[34], 본 연구에서는 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gammaproteobacteria), Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes로 4개의 문에 속하는 그룹이 확인되었다(Fig. 4). 이러한 결과와 비교하면 공통적으로 나타난 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria), Bacteroidetes의 2개의 문을 제외하고는 세균의 군집구조가 서로 다르며, U. pertusa에서 더 다양한 세균의 군집구조를 확인 할 수 있다. 이러한 결과는 배양조건과 환경 등에 따라 세균군집이 달라지는 연구와 일치한다고 볼 수 있다[19, 20].

Fig. 4.Pie-diagram showing structure and the diversity of bacterial community of Ulva pertusa.

그리고 Ulva sp.에서 분리한 균주의 항균효과에 대한 연구 결과로 볼 때[18], U. pertusa에서 분리한 균주도 가능성이 있다고 보며, 추후 분리된 균주로부터 항균실험이 진행되어야 된다고 생각되며, 우리나라에서 해조류에 대한 군집구조의 연구는 적기 때문에 이와 관련하여 많은 연구가 필요하다고 사료된다.