β-galactosidse 함유하는 재조합 대장균 세포를 이용한 1,2-hexanediol galactoside의 합성

Enzymatic Synthesis of 1, 2-Hexanediol Galactoside by Whole Cells of β-Galactosidase-containing Recombinant Escherichia coli

Abstract

최근 화장품에 쓰이는 방부제에 대한 피부 부작용이 보고되고 있다. 그 중에서 1,2-hexanediol (HD)는 방부기능과 보습기능을 가지고 있는 물질로 알려져 있는데, 본 연구에서는 보다 안전한 화장품용 소재를 개발하기 위하여 β-galactosidase (β-gal)을 함유하고 있는 대장균 세포를 이용한 transgalactosylation 반응을 통하여 1,2-hexanediol galactoside (HD-G)을 합성하는 연구를 수행하였다. 이 반응은 높은 농도의 lactose (300 g/l) 조건에서 24시간 동안 수행되었으며, 반응 시간이 12시간 지난 후부터 새로운 spot이 TLC 분석으로 확인되었다. 이 spot을 잠정적으로 HD-G로 추정한 후, 이 물질을 silica gel chromatography로 정제한 후, mass spectrometry 분석을 통하여, 이 물질이 HD-G의 sodium adduct ion ([M+Na]⁺, m/z=303.1423)임을 확인하였다. 추가적으로 정제된 HD-G를 시판되는 β-gal을 이용하여 가수분해하고, 유리된 단당류를 TLC로 분석하여 보았다. 이 때, galactose 한 분자가 HD-G로부터 유리 되는 것을 확인하였다. 결론적으로, 재조합 대장균 β-gal을 이용하여 HD로부터 HD-G이 합성되었음을 확인할 수 있었으며, 앞으로 추가연구를 통하여 항균력의 변화와 피부세포에 대한 세포독성 변화를 조사할 예정이며, 기능성에 변화가 없는 보다 안전한 화장품용 방부제가 개발되기를 기대하고 있다.

Recently, it has been reported that some preservatives used in cosmetics lead to skin problems. Among the many cosmetic ingredients, 1, 2-hexanediol (HD) is used as both a preservative and humectant. In order to develop safer ingredients, we studied the synthesis of 1, 2-hexanediol galactoside (HD-G) by a transgalactosylation reaction using β-galactosidase (β-gal)-containing recombinant Escherichia coli cells. The transgalactosylation reaction was carried out under high-lactose conditions for 24 hr. After 12 hr had elapsed, a new spot was identified by thin-layer chromatography (TLC) analysis, and we presumptively designated this new spot as HD-G. Then, we carried out the purification of the presumptive HD-G spot from the reaction mixture by using silica gel chromatography, and its mass was measured by electrospray ionization-mass spectrometry. The purified new spot on the chromatograph was identified a sodium adduct ion ([M+Na]⁺, m/z = 303.1423) of HD-G. In addition, when purified HD-G was hydrolyzed using commercially available E. coli β-gal, it was observed that a galactose molecule was released from HD-G. That is, it was demonstrated that HD-G is a galactoside derivative of HD. Finally, we confirmed that HD-G was enzymatically synthesized by E. coli β -gal as a new molecular entity. In the future, we plan to determine the minimum inhibitory concentrations of HD-G against different bacterial species. The cytotoxicity of HD-G against human skin cells will also be examined. It is expected hopefully that the galactosylation of HD would improve the functionality of HD-G.

서 론

최근 화장품 산업에서 첨가물 중의 하나인 방부제(살균/보존제) 에 대한 부작용 문제가 대두 되고 있으며[14, 15], 그러한 이유로 방부제가 첨가되지 않은 화장품들에 대한 관심이 높아지고 있고, 방부제에 대한 대체물 연구도 활발히 이루어지고 있다[3,10]. 본 연구팀에서도 화장품에 사용하는 방부제인 chlorphenesin (CPN) [11]과 phenoxyethanol (PE) [7]의 부작용을 감소 시킬 목적으로 galactoside 유도체 합성과 기능성 변화에 대한 연구를 수행하여왔다. 피부세포에 대한 독성을 감소시키기 위한 방법으로 CPN과 PE에 한 분자의 galactose를 결합시킨 유도체를 합성하는 방법을 사용하였으며, 이 합성 반응은 효소 β-galactosidase (β-gal)에 의해서 고농도의 lactose가 녹아있는 수용액상에서 일어나는 transgalactosylation 반응으로 알려져있다.

본 연구에서는 화장품 소재로서 보습력과 방부력을 가지고 있는 1, 2-hexanediol (HD)의 transgalactosylation 반응에 대하여 조사하였다. HD는 분자량이 118.17이고, 6개의 carbon chain의 1번, 2번 탄소에 hydroxyl group (-OH)를 갖고 있는 구조(Fig. 1A)로 물에 대한 용해도가 매우 높아서, 물 또는 알코올에 잘 섞이는 것으로 알려져 있다. HD는 현재 화장품의 방부제로 유아용품, 목욕용품, 모발, 피부 등에 사용되는 화장품과 개인 미용 및 위생용품 등에 1-2%의 농도로 사용되어지고 있다. 현재까지의 연구 보고에 따르면 1, 2-alkanediol의 alkyl chain의 길이가 길어질수록 세포막이 파괴 능력이 좋아져서 독성이 높아지는 것으로 알려져 있다. 또한, 몇 가지의 1, 2-alkanediol을 혼합하여 사용하였을 때, 피부에 대한 독성이 보고되어있다[5, 9].

Fig. 1TLC analyses for detecting HD-G spot. For the transgalactosylation reaction, (A) β-gal-containing E. coil cells and Lactozyme were used (the staining solution; #1) and (B) β-gal-containing E. coil cells were used (the staining solution; #2). Molecular structure of HD was shown in the upper left of panel A. Arrow indicates HD-G spots. Lac, Glu, Gal, and HD indicate 1% standards of lactose, glucose, glucose, and 1, 2-hexanediol, respectively.

본 연구에서 transgalactosylation 반응을 통하여 1, 2-hexanediol galactoside (HD-G)를 합성하였는데, 이 때, β-gal을 함유하는 재조합 Escherichia coli (E. coli)를 이용하여 transgalactosylation 반응을 수행하였다. 재조합 E. coli는 이미 본 연구팀의 CPN과 PE의 galactoside 합성연구에 사용하였으며[7, 11], arabinose에 의해서 induction 되는 araBAD promoter 뒤에 β-gal 유전자가 이어져 있고, 이러한 재조합 β-gal을 함유한 E. coli 세포 자체를 β-gal의 정제 없이 HD-G 합성반응에 사용하였다. 본 연구에서는 E. coli β-gal을 이용하여 HD에 transgalactosylation 반응으로 galactose 한 분자가 결합된 HD-G가 합성되는지에 대하여 조사하였고, 또한, HD-G를 정제하여 mass spectrometry로 질량을 분석하였고, 새롭게 galactose한 분자가 결합한 것을 확인 하는 실험을 수행하였다.

 

재료 및 방법

시약

1, 2-Hexanediol은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였고, TLC (thin-layer chromatography) plate는 Macherey–Nagel (Düren, Germany)의 DC-Fertigplatten SIL G-25 UV254를 사용하였다. Silica gel은 Zeochem의 ZEOprep 60 (60-200 μm)을 사용하였고, 가수분해용 β-gal은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다. 기타 본 연구에 사용한 시약들은 reagent-grade를 사용하였으며, 비교 실험용으로 사용한 효모 유래 β-gal인 Lactozym (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)은 EnzymTech (Yongin, Korea)에서 무상으로 공급하여 주었다.

β-Gal을 생산하는 재조합 대장균

대장균의 araBAD promoter 시스템에 의하여 발현이 조절되는 pBAD/Myc-His/lacZ vector (7.2 kb) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 E. coil MC 1061를 발현 숙주로 하여 β-gal을 발현하였다. β-gal 유전자는 pBAD/Myc-His expression kit 의 유전자를 사용하였다. 재조합 E. coil 제작과 재조합 β-gal을 함유한 E. coil의 배양방법 등에 대하여서는 선행연구에서 자세히 기록하였다[6, 8].

β-Gal 함유 대장균을 이용한 HD-G 합성

15 ml conical tube에 300 g/l lactose, 1.92 U/ml β-gal (재조합 β-gal을 함유한 E. coli 세포로 첨가), 50 mM HD를 50 mM phosphate buffer (pH 7.0)로 녹인 후, 전체 부피를 10 ml 되게 한다. 그리고 shaking incubator에서 37℃, 100 rpm으로 12 시간 동안 반응 시켰다. 한편, HD 농도에 대한 HD-G 합성 효과를 조사하기 위하여, HD 농도를 20에서 120 mM까지 변화 시키면서 HD-G 합성을 조사하였다. 비교 실험을 위하여 Lactozym을 이용하여 같은 반응을 실시하였다[1].

TLC 분석

20×10 cm TLC plate에 1.0 μl 시료를 loading하고 acetonitrile : water = 85 : 15 (v/v)을 이동상으로 하여 15 분 전개하였다. 그리고 staining solution #1 (1.25 g KMnO4, 10 g K2CO3, 1.25 ml 10 % NaOH in 200 ml water) 혹은 staining solution #2 (0.5% α-naphtol, 5% H2SO4 in ethanol)를 TLC plate에 뿌린 후, 80℃ oven에서 15 분간 말려서 spot을 확인 하였다. 정량이 필요할 경우에는 TLC plate 스캔하여 이미지를 얻은 후, AlphaEase FC software (Alpha Innotech, San Leonardo, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

HD-G의 정제

Econo-column (ID: 5 cm, L: 10 cm, maximum vol.: 193 ml; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 20G 주사바늘을 연결하고, column 내에 silica gel을 7 cm 높이로 채우고, 이동상 (acetonitrilie : water = 85 : 15, v/v)으로 한번 세척한다. 그리고 이동상이 silica gel의 위로 0.5-1.0 cm 남았을 때, HD-G가 함유된 반응액 8 ml를 loading 한다. 그 후 이동상을 중력에 의하여 연속적으로 흘리면서 35 ml 씩 분획물을 받고, 그 분획물을 TLC로 분석한 후, 그 중 HD-G만 포함된 분획물을 rotary vacuum evaporator을 이용하여 농축하였다.

HD-G의 질량분석

ESI (electrospray ionization)-mass spectrometer (SYNAPT G2, Waters, U.K)를 이용하여 정제한 HD-G의 질량을 분석하였다.

β-Gal을 이용한 HD-G의 가수분해

정제된 약 1 M의 HD-G 100 μl와 2 U/ml의 β-gal (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 100 μl를 1.5 ml micro tube에서 섞은 후, 37℃에서 가수분해 반응을 실시한다. 그리고 TLC 분석을 통하여 HD-G에서 유리된 단당류를 분석하였다.

 

결과 및 고찰

화장품용 방부제로 쓰이고 있는 HD의 transgalactosylation 반응에 대한 연구는 아직까지 보고된 적이 없다. 그래서 이미 수행한 CPN과 PE의 transgalactosylation 반응 연구[7, 11]에서와 같이 고농도의 lactose (300 g/l) 존재 하에서 재조합 E. coli의 β-gal을 이용하여 transgalactosylation 반응이 일어날 수 있는지에 대하여 먼저 조사하여 보았다. 이 때, 동시에 상업적으로 판매되고 있는 β-gal인 Lactozyme을 이용하여 같은 반응을 실시하여 비교하여 보았다. Fig. 1A에서와 같이 24시간 동안 반응 시켰을 때, 새로운 spot이 12시간 이후부터 반응물에서 생성 되는 것을 TLC로 확인 할 수 있었다. 이러한 새롭게 생성된 spot은 E. coli의 β-gal을 사용한 반응물과 Lactozyme을 사용한 반응물에서 모두 확인 할 수 있었다. 또한, E. coli β-gal을 사용한 반응물을 TLC로 전개 한 후, 당류(sugar)와 반응하여 발색하는 시약으로 염색하여 본 결과 Fig. 1B와 같이 같은 위치에서 새로운 spot을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 E. coli의 β-gal을 이용한 transgalactosylation 반응으로 당류가 결합한 새로운 물질(HD-G)이 합성되었을 가능성을 추정하게 하는 결과라 할 수 있겠다. 그리고, HD-G라고 추정할 수 있는 물질의 합성이 HD의 농도 변화에 어떻게 변화하는지를 조사하여 보았다(Fig. 2). 이때, E. coli β-gal을 이용한 transgalactosylation 반응의 조건은 Fig. 1에서 같았으며, HD의 농도만을 20에서 120 mM 까지 증가시켰다. 그 결과 HD 증가에 따라서 HD-G로 추정되는 spot도 동시에 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 2.Effect of HD concentration on HD-G synthesis during 24 hr (HD concentration; 20 to 120 mM). HD-G and HD spots in TLC were indicated by arrows. TLC plate was stained using staining solution #1.

합성된 HD-G의 mass를 분석하기 위하여, E. coli β-gal을 이용한 transgalactosylation 반응으로 얻은 반응물에서 HD-G로 추정되는 물질을 silica gel chromatography로 정제하고, 이를 농축하였다. 이 정제/농축된 물질을 TLC로 확인 한 후(Fig. 3A), mass spectrometry 분석을 실시하여 그 mass를 구하였다(Fig. 3B). 분석 결과 303.1423(m/z)의 mass peak가 확인되었으며, 이는 HD-G의 sodium adduct ion ([M+Na]+) 형태로, 다음 괄호 안의 mass 계산식으로 확인할 수 있었다 [118.174(HD)+180.156(galactose)-18.015(water)+22.989(sodium)=303.301]. 이 때, 추정되는 HD-G의 분자 구조식을 Fig. 3B에 표시하였다.

Fig. 3.TLC analysis of purified HD-G and its mass spectrum data. (A) TLC data of standard HD (1%), reaction mixture of transgalactosylation of HD (lane 1), and purified HD-G (lane 2). Arrow indicates HD-G spots. TLC plate was stained using staining solution #1. (B) Mass spectrum data of purified HD-G. The arrowed mass peak indicates the sodium adduct ions of HD-G ([M+Na]+). Its molecular structure is shown in the box of panel B.

Galactose 한 분자가 HD와 결합 했다는 또 다른 증거를 제시하기 위하여, 정제한 HD-G를 상업적으로 파는 E. coli β-gal을 이용하여 48 시간 동안 가수분해 시켜보았다. 그리고 그 가수분해물을 TLC로 분석 하였다(Fig. 4). TLC로 분석한 결과 단당류가 가수분해로 분리되는 것을 확인 하였으며, 보다 정확한 판단을 위하여, TLC 이미지를 스캔하여 다시 분석하였다. 그 결과 Fig. 4B와 같이 정제된 HD-G에서 분리된 단당류가 galactose (line #2 in Fig. 4B) 임을 확인 할 수 있었다. Fig. 3과 Fig. 4의 결과를 종합하여 보면, 재조합 E. coli β-gal을 이용한 HD의 transgalactosylation 반응물로 부터 정제된 HD-G 추정물이 HD에 galactose가 한 분자 결합된 HD의 galactoside (HD-G) 라고 확인되어진다.

Fig. 4.Time-course profile of the hydrolysis of purified HD-G by E. coli β-gal. (A) TLC data and (B) scanned TLC profile. Dashed lines #1 and #2 indicate glucose and galactose, respectively. TLC plate was stained using staining solution #1. HD, Glu, and Gal indicate 1% standards of 1, 2-hexanediol, glucose, and galactose, respectively.

현재 사용하고 있는 화장품용 방부제의 경우 피부에 대한 부작용 문제가 대두되고 있다. 그래서, 이러한 문제를 극복하기 위한 방법으로 본 연구팀에서는 방부제 분자에 galactose한 분자를 결합 시켜서 방부제 분자의 독성을 감소시키려는 연구를 수행하여왔다[7, 11]. 이 선행 연구에서 CPN-G의 cell viability는 5.0 mM에서 52.6% 증가하였고, PE-G의 cell viability는 40 mM에서 27.8% 증가하였다. 그리나 galactose 결합으로 인하여 향균력에는 큰 변화가 없었다. 이러한 전략은 이미 의약품 유효성분 분자의 독성과 기능성 향상을 위하여 galactose를 결합시키는 방법으로 잘 알려져 있다. 의약품 분자에 galactose를 결합시키면 독성이 감소하고, 물에 대한 용해도가 증가하고, 표적으로의 약물 전달능력이 향상된다는 연구보고는 많이 발표되었다[2, 4, 12, 16]. 본 연구에서도 이러한 근거를 바탕으로 HD에 재조합 E. coli β-gal를 이용한 transgalactosylation을 실시하였으며, transgalactosylation 반응과 생성된 HD-G을 확인하는 것이 본 연구의 주요 목적이었다. 이미 언급한 결과와 같이 HD-G의 합성을 확인하고, HD-G에 대한 정보를 좀더 확인하기 위하여 학술정보와 chemical substance의 database인 SciFinder®를 이용하여 검색하여 보았다. 그 결과 HD-G과 관련된 어떠한 정보도 얻을 수 없었다. 현재로서는 합성된 HD-G가 신규한 분자로 결론을 내렸으며, HD-G에 대한 추가적인 정보를 수집하고 있는 중에 있다.

일반적으로 β-gal에 의한 transgalactosylation 반응에서는 hydroxyl group (-OH)에 galactose 한 분자가 결합하는 것으로 알려져 있다. HD-G의 경우에도 두 개의 hydroxyl group 중에서 한 군데에 galactose가 결합한 것으로 추정된다. 본 연구 팀의 연구결과[7, 11]와 다른 선행연구 결과[1, 13]에 의하면 primary alcohol의 -OH에 galactose가 결합하는 것으로 알려져 있다. HD-G도 이와 마찬가지로 primary alcohol의 -OH에 결합했을 것으로 현재 추정하고 있다(Fig. 3B). 앞으로 NMR 분석을 통하여 galactose의 정확한 결합 위치를 조사할 예정이다. 또한, 본 연구팀의 선행 연구 결과에서와 같이 galactose한 분자의 결합은 방부제의 항균력의 변화를 가지고 올 수 있다[7, 11]. 그래서 후속 연구를 통하여서 항균력의 변화를 조사 할 예정이며, 피부세포에 대한 세포 독성의 변화를 조사할 예정으로 있다. 아마도 선행연구의 CPN galactoside [11]와 PE galactoside [7]의 경우와 같이 항균력은 유사하게 유지하면서, 피부세포에 대한 독성이 감소된 새로운 화장품용 방부제 확인을 기대하며, 추가 연구를 계속 수행할 예정이다.