Lactic acid bacteria를 이용한 마늘 고체 발효에 따른 생리활성

Biological Activities of Solid-fermentation Garlic with Lactic Acid Bacteria

Abstract

마늘(Allium sativum L.)은 많은 아시아 지역의 나라에서 민간요법 및 추출물을 이용하여 다양하게 사용하고 있다. 국내 전통채소류들은 다양한 기능성과 강한 생리학적 활성을 가지고 있으며, 기능성 식품재료로 사용이 가능하다. 본 연구는 유산균을 이용하여 고체마늘 발효에 따른 생리활성을 조사하고자 하였다. 마늘 고체 발효를 위해 유산균을 한국전통 발효식품인 젓갈로부터 분리 및 KCTC로 부터 분양 받아 사용하였다. 발효유산균 선별은 MRS 고체배지에 디스크법을 이용하여 마늘 착즙액에 저항을 보이며 증식하는 유산균을 선택하였다. 선별된 유산균을 이용한 마늘 고체발효 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 농도가 731.0-845.2 ug/g과 92.68-413.58 ug/g로 각각 조사되었다. 그리고 DPPH 라디컬 활성과 SOD 유사활성은 양성대조구인 비타민 C 50 ppm 보다 높은 활성을 보였다. 또한, 항당뇨 활성인 α-glucosidase 저해활성은 유산균 발효마늘에서 양성대조구인 acarbose 50 ppm 보다 높은 저해활성을 보이는 것으로 조사되었다. 본 연구결과 유산균 발효 마늘의 생리학적 활성을 증대를 통해 향후 항산화 활성과 항당뇨 활성을 갖는 유산균 발효 마늘의 개발을 위해 유산균을 활용이 가능하며, 발효물을 이용하여 기능성 식·음료 소재로의 개발 가능성을 보일 것으로 사료된다.

Garlic (Allium sativum L.) and its extracts have been used in a wide range of applications, including as folk medicines in many Asian countries. This traditional herb has several functional properties and strong biological activities, making it useful as a functional food material. This study investigated the biological activities of solid-garlic after fermentation by lactic acid bacteria. Several solid-garlic fermentation strains of lactic acid bacteria were isolated from Korean traditional fermented food or obtained from the Korean Collection for Type Cultures. Lactic acid bacteria showed selective growth in garlic extracts on MRS media. Fermentation of solid garlic (heated 121℃, 15 min or not heated) by lactic acid bacteria gave total polyphenol and flavonoid contents of 731.0-845.2 g/g and 92.68-413.58 g/g, respectively. The DPPH scavenging activities and SOD like activities were measured as 7,584% and 9499%, respectively. These activities were relatively higher than a positive control, vitamin C. Measurement of antidiabetic activity using α-glucosidase inhibition assay showed that solid garlic fermented with lactic acid bacteria gave a higher activity than the control, acarbose. Fermentation of solid garlic with lactic acid bacteria may therefore help to alleviate adverse biological activities, as well as provide functional food materials.

서 론

현대 과학의 발전으로 인간 수명이 늘어나고, 풍요로운 삶 속에서 일상생활을 살아가고 있으나, 다양한 스트레스요인과 서구화된 식습관의 변화로 인해 인체의 대사과정 균형이 깨지고, 생활습관성 질환이 증가하고 있다. 특히 인체의 생명을 유지하기 위한 대사과정에서 산소를 요구하게 되는데, 세포에서 1-4%는 전자전달계를 거치면서 환원되고, 그렇지 못한 산소는 자유기로 전이되어 각종대사 과정에서 super oxide anion (·O2− ), hydroxyl radical (·OH), peroxy radical (ROO·), alkoxyl radical (RO·) 등의 활성산소(reactive oxygen species, ROS)가 지속적으로 생성되게 된다[9, 21]. 여기에 산화적 스트레스가 가속화되면 각종 질환 및 노화의 원인으로 작용하기 때문에 이러한 활성산소 라디컬들을 제거하기 위해 항산화 효과가 풍부한 한약재나 천연물을 일상적 섭취를 통해 산화적 스트레스로부터 인체를 보호할 수 있는 방법들이 연구되고 있다[14, 18, 19]. 또한 최근 건강에 대한 관심이 높아지면서, 안전성이 확보된 약용작물 및 여러 과채류 등의 식품소재로부터 생리활성물질 섭취를 통해 활성산소로부터 신체를 방어하고자 노력하고 있다.

식품소재 중 마늘(Allium sativum L.)은 다양한 생리활성을 지닌 대표적인 식품으로 백합과(Lilliaceae)에 속하는 다년생 구근식물로 독특한 향미와 더불어 항균작용, 항고혈압 작용, 항암 및 세포의 항돌연변이 효과, 항산화 작용, 피로회복 활성 등이 알려져 있어 한국뿐만 아니라 전 세계적으로 천연 조미료, 가공식품의 향신료 및 기능성식품과 의약품 소재로 널리 이용되고 있다[16, 28]. 이러한 마늘의 생리활성 기능은 플라보노이드를 포함한 폴리페놀 화합물과 황함유 화합물에 기인되므로, 기능성 물질을 얻기 위해 주로 생마늘이 이용되어 왔다. 생마늘은 강한 자극취와 매운맛, 저장에 따른 갈변 등의 이유로 다량 섭취 및 장기 저장이 불가능하여 마늘의 기능성을 유지시키면서 저장성을 증대시킨 다양한 가공품이 상업화되어 유통되고 있다. 생마늘 가공식품 중 일정한 온도와 습도에서 장시간 숙성시켜 제조되는 흑마늘은 숙성과정에서 생성되는 갈색화 반응 물질이 높은 항산화 활성을 지니며, 암 예방, 콜레스테롤 저하, 동맥경화 개선, 심장질환 예방, 산화스트레스와 관련된 효과 및 항염증 활성 등의 효과가 보고되고 있다[17, 32]. 그러나 10-40일 정도의 장시간 가공 기간에 따른 높은 가공비용으로 소비 계층이 한정되며 진한 흑색의 발현으로 타 식품에 대한 혼합 첨가에는 한계가 있으며, 또한 점도가 높아 2차 가공의 폭이 넓지 않은 단점이 있다[21].

이에 본 연구에서는 흑마늘의 단점을 보완하고 생마늘의 활용한 고부가가치 제품 개발의 일환으로 생마늘 발효가 가능한 probiotics인 유산균 이용한 마늘 발효물을 제조하여 항산화활성과 항당뇨활성 등을 조사하여, 유산균 발효 마늘의 활성을 평가하고 기능성 식음료소재 개발에 기초자료로 제공하고자 한다.

 

재료 및 방법

실험재료 및 시료의 제조

본 실험에 사용한 Folin-ciocalteau’s phenol reagent, DPPH, tannic acid, angiotensin converting enzyme, hippuril-L-histidine-L-leucine 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외의 시약은 특급 및 일급 시약을 사용하였다.

실험에 사용한 마늘은 구입하여 통마늘 형태 절편으로 절단하여 80℃에서 24시간 풍건(수분함량10%)하여 시료로 사용하였다. 발효 전 수분 조절을 하기 위해 수분함량은 30%로 조정하여, 열처리(121℃, 1.5기압, 15분)와 비열처리 후 발효를 하였다. 사용된 유산균은 전통발효식품인 젓갈로부터 분리한 GRAS급 유산균과 한국미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)로 분양 받은 Lactobacillus plantarum KCTC 13093을 이용하였다.

마늘 고상발효 제조를 위한 발효균주의 선발

마늘에 대한 발효능이 우수한 균주를 분리하기 위해, 마늘 추출물로부터 저항성을 보이는 유산균을 분리하고자 하였다. 분리균주 각각을 MRS (Difco, USA) 평판배지에 유산균을 도말 후 8 mm disc에 마늘 착즙액 100 ul를 점적하여 평판배지에 올려 37℃에서 24-48시간 배양한 후 항균활성에 저항성을 보이는 유산균을 선별하여 발효 균주로 사용하였다.

마늘 고상발효물의 제조

발효능이 우수한 유산균을 선발하여 이들 probiotics 각각을 MRS (Difco, USA) 평판배지에 도말하여 37℃에서 24-48시간 배양한 후 생성된 single colony를 다시 MRS 배지에 접종하고 48시간 배양하여 starter를 제조하였다. 각각의 starter는 37℃에서 24시간 MRS 액체배지에서 배양한 후, 건조마늘 20 g에 3% glucose를 첨가하여 멸균하고 유산균 배양액을 5% 접종하였다. 이를 37℃에서 72시간 배양한 다음 유산균 발효 마늘 10 g을 70% 에탄올 100 ml를 이용하여 70℃에서 24시간 추출하여 실험용 조추출물 시료로 사용하였다.

Total polyphenol 함량 측정

총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였다[31]. 각각의 시료 50 ul에 2% Na2CO3용액 1 ul를 넣고, 50% Folin시약 50 ul를 넣은 후 상온에서 30분간 방치하여 반응 시킨 후 UV-VIS spectrophotometer를 사용하여 760㎚에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이때 표준물질은 tannic acid를 사용하였으며, 적정농도로 만든 후 위와 같은 방법으로 실험하여 표준곡선을 구하였다.

Total flavonoid 함량 측정

총 플라보노이드 함량 측정은 Zhishen 등[34]의 방법을 응용하여 측정하였다. 각각의 시료 용액 150 ul에 증류수 600 ul와 5% NaNO2 45 ul를 첨가하여 5분간 반응시킨 후, 10% AlCl3·6H2O 100 ul를 가하고 6분간 반응시킨 후에 1 N NaOH 300 ul를 첨가하여 반응을 정지 시킨 다음 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 rutin을 위와 같은 방법으로 실험하여 표준 곡선으로 하여 함량을 구하였다.

DPPH radical 소거능 측정

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거활성은 Blois의 방법[3]을 일부 변형하여 측정하였다. 시료 상등액 0.2 ml에 DPPH 용액(ethanolic solution)을 0.8 ml를 가하여 혼합한 다음 실온에서 10분간 방치 후, 525 nm에서 흡광도 감소치를 측정하였다. 이때 DPPH radical 소거활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 백분율로 나타내었으며, 양성대조군으로 Vitamin C를 사용하였다.

SOD 유사활성 측정

SOD 유사활성은 Marklund 등[24]의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 원심분리 한 각각의 시료 상등액 0.1 ml에 Tris-HCl buffer (pH 8.5, 50 mM Tris+10 mM EDTA) 1.3 ml와 7.2 mM pyrogallol 0.1 ml를 각각 혼합한 다음 25℃에서 10분간 상온에서 반응시키고 1 M HCl 50 ul를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 SOD 유사활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 백분율로 나타내었으며, 양성대조군으로 Vitamin C를 사용하였다.

α-Glucosidase 활성 저해능 측정

α-Glucosidase 활성 저해능은 Choe 등[8]의 방법에 따라 2.5 mM ρ-nitrophenyl α-D-glucopyranoside를 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.8)에 첨가하여 반응기질로 하고 α-glucosidase와 시료 추출물을 차례로 가한 후 효소액을 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 0.1 M NaOH 100 μl로 반응을 정지시켰다. 이때 반응 생성물인 ρ-nitrophenol을 405 nm에서 UV-VIS spectrophotometer로 측정하여 α-glucosidase 활성의 저해정도로 나타내었다.

 

결과 및 고찰

마늘 고상발효 유산균의 분리 및 마늘 고상 발효물 제조

마늘발효를 위해 유산균을 분리한 결과 Fig. 1에서와 같이 마늘 추출물에 저항성을 보이는 균주를 각각 선발하였다. 마늘내 성분 중 alliicin은 젖산균을 포함한 다양한 미생물에 대해 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있다[7, 9]. 그러나, 분리 균주인 유산균 3Y, 45-1, 59, D-18, Lh와 L. plantarum KCTC 13093 균주는 allicin에 대한 저항성을 보이며 증식하였다. 각각의 유산균에 따라 미미한 성장의 차이를 보이지만 마늘 발효 균주로 적합한 것으로 확인되어 최종적으로 6가지 균주 선발하여 마늘 고상 발효에 사용하였다. Jeong 등[13]에 의하면 마늘의 항균 활성도는 유산균에 따라 저항력이 각각 다르게 나타나므로 유산균 종류에 따라 발효가능 여부를 확인할 수 있고 보고하였다.

Fig. 1.Screening of the lactic acid bacteria fermented garlic. Inhibition zone of lactic acid bacteria was not used garlic extracts. Non-clear zone was growth of lactic acid bacteria against garlic extracts.

Total polyphenol 및 Total flavonoid 함량 측정

일반적으로 식물은 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물과 같은 2차 대사산물을 함유하고 있는데 이들은 방향성 화합물로 고리구조상 -OH기로부터 전자를 공여하여 페놀 고리구조 공명에 의해 구조적 안정화되면서 항산화 활성을 나타내게 된다[26]. 이러한 폴리페놀과 플라보노이드는 항산화, 항염증, 항혈전 및 항암 등 생리활성에 관여하는 것으로 최근 많은 연구에서 밝혀지고 있다[3]. 유산균을 이용한 마늘 고상발효 시 열처리와 열처리 하지 않은 발효물의 총 폴리페놀 함량은 Fig. 2에서 와 같이 대조구에서 열처리 827.64 ug/g과 비열처리 758.52 ug/g으로 비열처리 마늘이 높게 나타났으며, 유산균 발효시 열처리구와 비열처리구 730.98-771.86 ug/g과 799.58-845.19 ug/g으로 대조구보다 유산균 발효 마늘 시료가 각각 미미한 변화를 보였다.

Fig. 2.Total polyphenol contents of the fermented garlic by lactic acid bacteria. Result are presented as mean ± S.D of three independent experiments. C: without probiotics, 4-1, 3Y, D-18, 45-1, 59 and Lh: Isolated Lactobacillus sp. from Korean traditional fermented food, 13093: Lactobacillus plantarum KCTC 13093.

또한 총 플라보노이드 함량의 조사결과 Fig. 3에서와 같이 대조구에서 열처리와 비열처리에 389.35 ug/g과 90 ug/g으로 각각 조사되었으며, 열처리 후 유산균 발효한 마늘은 259.13-413.57 ug/g으로 감소되거나 미미한 차이를 보였으며, 비열처리 유산균 마늘 발효에서는 92-119.35 ug/g으로 증가되는 것으로 조사되었다. 마늘 발효시 열처리와 비열처리의 경우 열처리에서 3배 이상 총 플라보노이드 함량이 증가 되는 것으로 조사되었다. Lee 등[22]에 의하면 마늘의 총 폴리페놀 함량이 9.99±0.04-14.88±0.20 mg quercetin/g으로 생마늘에 비해 열처리한 홍마늘 및 흑마늘의 총 페놀과 플라보노이드 함량이 높은 것으로 보고하였다. 이러한 결과는 발효과정과 열처리 과정 중 마늘내 화합물이 페놀성 물질로 전환되었거나, 조직이 연화되어 시료 내부에 강하게 결합되어 있던 폴리페놀 화합물이 유리되어 저분자 폴리페놀 화합물의 농도 증가된 것으로 추정된다. Shin 등[27]은 숙성온도에 따른 마늘 추출물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과 60℃보다 90℃에서 숙성한 마늘에서 이들 물질의 증가량이 많았으며, 60℃에서는 숙성 후반기, 90℃에서는 숙성 초기에 그 함량이 급격히 증가하는 현상으로 숙성에 따라 갈변화 물질이 생성이 많아지고 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량이 증가한다고 하였다.

Fig. 3.Total flavonoid contents the fermented garlic by lactic acid bacteria. Result are presented as mean ± S.D of three independent experiments. C: without probiotics, 4-1, 3Y, D-18, 45-1, 59 and Lh: Isolated Lactobacillus sp. from Korean traditional fermented food, 13093: Lactobacillus plantarum KCTC 13093.

DPPH radical 소거능 측정

DPPH는 화학적으로 안정화 된 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로서 515-525 nm 부근에서 최대 흡광도를 가지는 보라색의 화합물로 ascorbic acid, BHA, 토코페롤과 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 보라색이 탈색됨으로서 항산화 물질의 전자공여능을 측정할 때 사용된다[6].

본 실험에서 유산균을 이용하여 마늘 고상 발효에 따른 DPPH radical 활성 소거능 측정 결과 Fig. 4와 같이 다양한 유산균 종에 따라 열처리 후 발효한 발효마늘이 90-99%로, 비열 처리구에서 75-84%로 각각 조사되었다. 대조구인 마늘 74-80% 보다 열처리 발효 마늘의 DPPH radical 활성 소거능이 증가되는 것으로 나타났다. 발효양상에 따른 DPPH radical 활성 소거능을 보면 발효 전 고압멸균을 하였을 때가 열을 가하지 않고 발효한 마늘이 10-20% 이상 증가하는 것으로 조사되었다. 이러한 결과는 열처리와 발효를 통해 마늘의 총 폴리페놀 함량과, 총 플라보노이드 함량에 의해 DPPH저해 활성능이 더 높아진 것으로 사료된다. Jeong 등[13]에 의하면 당침 마늘 발효 1개월부터 36개월까지의 발효마늘 추출물들이 전자공여능이 80.12-91.23%까지 증가하는 결과를 보였으나, 본 결과에서 유산균을 이용하여 발효할 경우 짧은 시간에서도 90%이상의 DPPH radical 활성 소거능이 증가하는 것으로 조사되어 기능성 식·음료 소재로 활용이 가능할 것으로 사료된다. 마늘, 양파와 같은 Allium속 식물에는 L-cysteine (SAC), S- ethyl cysteine (SEC), S-methyl cysteine (SMC) 등과 같은 친수성 유기황 화합물들이 다량 존재하며 항산화와 항당뇨 등과 같은 생리활성 기능이 있는 것으로 알려져 있다[28, 33]. Ide 등[12]이 숙성마늘에서 분리한 대표적인 항산화 물질로 알려진 SAC 농도와 비례적으로 항산화 효과를 나타낸다고 보고하였는데 본 실험결과에서는 SAC 함량을 조사하지 않았으나 항산화 효과의 연관성이 있다고 사료되며 향후 SAC에 대한 연구를 진행하여야 할 것으로 사료된다.

Fig. 4.DPPH radical scavenging activity of the fermented garlic by lactic acid bacteria. Result are presented as mean ± S.D of three independent experiments. C: without probiotics, 4-1, 3Y, D-18, 45-1, 59 and Lh: Isolated Lactobacillus sp. from Korean traditional fermented food, 13093: Lactobacillus plantarum KCTC 13093.

SOD 유사활성 측정

Superoxide는 산소가 전자 하나를 받아 환원된 형태로, 체내 산화적 손상을 야기할 수 있으며 이것을 산소로 전환시키는 것이 SOD이다. SOD 유사물질이란 SOD와 같이 superoxide를 정상의 산소로 전환시킬 수는 없으나 superoxide의 반응을 억제하여 생체를 산화적 손상으로부터 보호할 수 있는 주로 phytochemical의 저분자 물질을 의미한다[10, 11]. 유산균 발효마늘의 SOD 유사활성을 조사한 결과 Fig. 5에서와 같이 발효 균주에 따라 19-89%의 SOD 유사활성능을 보이는 것으로 나타났다. 열처리 후 유산균 발효를 하였을 경우 SOD 유사활성이 대조구 16%에 비해 더 높은 것으로 조사되었다. 특히 Lactobacillus sp. 45-1균주의 경우 비열처리 마늘은 큰 변화가 없지만, 열처리 유산균 발효 마늘은 대조구에 비해 5배 이상 SOD유사활성을 보이는 것으로 조사되었다. Jung과 Park[15]에 의하면 발효시간이 길어질수록 SOD유사활성이 증가되어 24-36개월에 약 56.52-58.21%의 SOD 유사활성을 나타낸다고 보고하였으나, 본 연구 결과 열처리 후 유산균을 이용하여 마늘을 발효할 경우, 짧은 시간에도 SOD 유사활성이 높아질 수 있다는 것을 확인하였다. 또한 Lactococcus lactis subsp. lactis DIP15 [30]와 L. sake [2] 균주가 SOD 유사활성이 있다고 보고되는 등, 유산균에 의한 활성산소 제거 능력이 다양하게 보고되고 있다[1, 20, 25]. 이러한 결과로 보아 유산균 발효 마늘을 기능성 식품소재로 이용하여 섭취를 한다면 인체내 산화적 스트레스 개선에 도움을 줄 것으로 사료된다.

Fig. 5.Superoxide dismutase (SOD)-like activity of the fermented garlic by lactic acid bacteria. Result are presented as mean ±S.D of three independent experiments. C: without probiotics, 4-1, 3Y, D-18, 45-1, 59 and Lh: Isolated Lactobacillus sp. from Korean traditional fermented food, 13093: Lactobacillus plantarum KCTC 13093.

α-Glucosidase 저해활성

α-Glucosidase는 당질 분해속도를 조절하는 효소로 작용함으로써[5], 소장에서 탄수화물의 흡수 저해 및 혈당 상승을 억제하는 것으로 알려져 있는데[4], 마늘 중의 성분은 가공조건에 따라 달라지며[29], 마늘 중 diallyl trisulfide와 같은 유기황 화합물이 혈당 강하에 효과적인 것으로 보고된 바 있다[23]. 본 실험에서 유산균 마늘발효 추출물은 Fig. 6에서와 같이 대조구에서 열처리 유무에 따라 큰 차이를 보이지 않는 것으로 조사되어다. 하지만 유산균 발효 마늘에 있어서는 발효 전 열처리와 비열처리에 따라 차이를 보이는 것으로 나타났다. 비열처리 발효 마늘은 84-90%, 열처리 발효 마늘은 75-85%로 비열처리 발효 마늘이 10% 정도 α-glucosidase 저해 활성이 증가되는 것으로 조사되었다. 발효 균주 중 Lactobacillus sp. 45-1의 경우 비열처리와 열처리에서 각각 90%와 82% α -glucosidase 저해 활성 보여 다른 균에 비해 우수한 것으로 조사되었다. Lee 등[22]은 마늘을 열처리함에 따라 α-glucosidase저해 활성이 증가된다고 보고 하였으나, 본 결과와 다르게 나타난 것으로 조사 되었으나, garlic oil의 항당뇨 활성에 diallyl disulfide 이외의 다른 물질이 관여한다고 한 Liu 등[23] 보고와도 같이 본 결과는 유산균에 의한 발효로 마늘 성분의 변화가 나타나 α-glucosidase저해 활성이 증가된 것으로 판단된다.

Fig. 6.α-Glucosidase inhibition activity of the fermented garlic by lactic acid bacteria. Result are presented as mean ±S.D of three independent experiments. C: without probiotics, 4-1, 3Y, D-18, 45-1, 59 and Lh: Isolated Lactobacillus sp. from Korean traditional fermented food, 13093: Lactobacillus plantarum KCTC 13093.

이상의 결과를 종합하였을 때 유산균을 이용한 마늘 발효 있어서, 1차적으로 열처리 과정을 거친 후 발효 한 발효산물이 항산화 활성과 α-glucosidase 저해활성 등의 우수한 생리활성을 보이는 것으로 조사되었다. 또한, 이러한 연구결과를 바탕으로 향후 마늘을 발효 제품 개발에 있어, 열처리 과정과 probiotics를 이용한 한다면 기능성 식·음료소재로 활용도가 높을 것으로 사료된다.