Effects of Fermented Fecal Solid Diets on Growth of the Sea Cucumber Apostichopus japonicus

육상어류양식장의 고형오물을 발효시켜 만든 사료를 급여한 해삼(Apostichopus japonicus)의 성장

Abstract

The effects of fermented fecal solid diets on the growth of the sea cucumber Apostichopus japonicus was investigated in a recirculating aquaculture system (RAS) during a 90-day experiment at 16.5-17.5℃, 32±0.5 psu salinity, pH 7.9-8.2, and 5.2-7.1 mg/L dissolved oxygen. The aim was to determine the feasibility of RAS fecal solid waste as a renewable feed for A. japonicus. In this study, unfermented fecal solid (UF), fermented fecal solid (FF), and commercial feed (CF) diets were used. The results showed that the growth rate did not differ significantly (P>0.05) between A. japonicus fed FF and CF; however, the growth rates of A. japonicus fed FF and CF were ~50% higher than that of those fed UF. Thus, utilization of fecal solid by A. japonicus may overcome the problem regarding accumulation of RAS waste. Use of a fermentation process would improve utilization of fecal solid as a renewable food source for A. japonicus.

서 론

최근 육상어류양식장에서 발생하는 배출수의 연안환경오염에 관한 문제는 전 세계적으로 심각한 사회문제로 대두되고 있다(Nordvarg and Johansson, 2002; Kang et al., 2004). 육상 어류양식장에서 배출된 고형오물은 주로 어류의 배설물과 일부 잔여사료로 구성되어 있으며(Naylor, 2000; Brune et al., 2003), 이를 처리하기 위한 방안으로 유기질비료로 사용(Sharrer et al., 2007), 바이오가스로 활용(Luo et al., 2013), 식물환경복원(Ghaly et al., 2005) 등을 시도하였지만, 실용화되지 못하고 있다. 또한 고염과 고농도의 유기물 함량 때문에 도시폐수처리장에서 처리가 곤란할 뿐만 아니라(Mirzoyan et al., 2008), 2016년부터 해양투기가 금지되었기 때문에 이에 대한 대책이 절실하다.

해삼은 저서퇴적물식자(deposit feeder)로서 저서의 퇴적물을 이용하여 성장하는 바다의청소부로 잘 알려져 있다(Kang et al., 2012). 해삼의 이러한 식성을 활용하여 다영양입체양식(Integrated Multi-Trophic Aquaculture, IMTA)의 여과생물로서 이용하고 있을 뿐만 아니라(Kang et al., 2003; Zamora and Jeffs, 2011; Nelson et al., 2012; Hannah et al., 2013), IMTA에서 배출된 저층배설물로 상품크기까지 성장시키고 있다(Yokoyama, 2013; Yu et al., 2014). 최근에는 더욱 진전하여 육상어류양식장의 고형오물을 처리하기 위한 시도에서 희망적인 결과를 얻고 있다. Jeong et al. (2016)의 연구결과 육상고형오물의 이화학적 성질로서 사료 내 잔류 중금속과 항생물질의 안정성을 밝혔으며, 이를 해삼에게 급여했을 때 이들을 효율적으로 소화시키는 높은 소화흡수율을 밝히고 있다. Jin et al. (2016)은 고형오물을 해삼사료자원으로 활용하기 위한 실험으로 육상양식장에서 배출된 고형오물을 해삼에게 급여했을 때 해삼의 에너지 수지 차원에서 이용가능성이 높다고 하였다. 그러나 성장에서는 고형오물을 그대로 급여했을 때는 상품사료의 60% 수준의 성장 효과를 나타내었기 때문에 고형오물에 대한 이용률 개선의 필요성을 제기하였다.

사료의 이용률을 높이는 방안으로 발효과정을 통하여 소화흡수율 개선하고 기능성물질을 증가시키는 방법은 이미 식품과 축산사료에서 널리 응용되고 있다(Kwak and Park, 2003; Song et al., 2011). 불소화 또는 난소화성 원료에 미생물을 접종 후 발효시켰을 때 고분자 물질을 저분자 물질로 변화시켜 소화성이 개선되고 또한 미생물 작용에 의한 악취 제거에도 뛰어난 효과를 가지고 있다(Anugwa et al., 1989; Wilfart et al., 2007).

따라서 본 연구는 해삼의 고형오물에 대한 이용성을 개선하는 목적으로 4단 발효공정을 거친 고형오물을 해삼에게 공급하는 사육실험을 통하여 육상어류양식장에서 배출되는 고형오물의 이용성을 높이고자 연구를 수행하였다.

 

재료 및 방법

실험사료

실험사료는 고형오물로 제조한 미발효고형오물사료(Unfermented fecal solid, UF)와 이를 발효시켜 제조한 발효고형오물사료(Fermented fecal solid) 및 시판중인 상품사료(Commercial feed, CF)를 포함한 3종류를 실험에 사용하였다. 고형오물사료는 충청북도 충주시 금가면 오석리에 소재하고 있는 무지개송어(Oncorhynchus mykiss)양어장의 배설물 침전조에 축적된 고형오물을 채취하여 실험실로 운반 후 해삼사료로 제조하여 사용하였으며 상품사료는 중국에서 수입한 해삼배합사료(DL CO., LTD, China)를 사용하였다.

발효사료 제조

발효사료의 제조공정은 4단계로 하였고, 발효사료와 미발효사료의 원료배합 비율은 Table 1에 나타낸 바와 같으며, 그 원료의 일반성분은 Table 2에 나타낸 바와 같다. 고형오물에 악취제거와 수분조절을 위하여 미강을 첨가하였고, 단백질 함량 조절을 위하여 대두박을 첨가하였다. 고형오물, 미강 및 대두박의 비율은 2:1:1로 혼합하여 이를 발효기질로 하였다. 제1단 발효는 미생물 증식에 필요한 영양원 즉 기질을 살균하기 위한 목적으로 항균물질 생산능력이 있는 유산균(Lactococcus lacti IFO 12007)을 이용하였고, 제2단과 제3단 발효과정은 고형오물 중 고분자 물질과 난분해성 물질을 분해하는 단계로서 제2단 황국균(Aspergillus oryzae)과 제3단 고초균(Bacillus subtilis GSK3580)을 이용하였으며, 제4단계는 고도불포화 지방산 함량을 증가시키기 위하여 Schizochytrium mangrovei GNU226 배양액을 첨가하였다. 각 단계별 발효조건은 제1단계 L lactis IFO 12007과 2단계 A. oryzae를 각각 106 CFU/g과 106 spores/g을 분무 접종하여 30℃에서 48시간 동안 1단과 2단 발효를 연속으로 실시하였다. 다음으로 3단계는 증류수를 첨가하여 수분을 90%로 조절하고 B. subtilis GSK3580을 106 CFU/g 접종해서 43℃에서 24시간 동안 발효를 실시하였으며, 마지막 4단계로 해양미세조류 S. mangrovei GNU 226 발효액을 5%첨가하여 발효공정을 마쳤다. 모든 실험사료는 볼밀(Seojin SJB-250A, Korea)을 이용하여 45 µm 될 때까지 충분히 분쇄시켰다. 이 분쇄된 고형오물 입자에 Cr2O3 0.5%와 Cellulose sodium alginate 0.5%를 완전하게 섞어 반죽한 후, 펠렛 제조기(Dongwen EP-C220, Korea)에서 펠렛 형태로 압출성형하였다. 성형된 고형오물을 65℃에서 건조시킨 후, 다시 분쇄시켜 입자크기가 350 µm인 크럼블 사료로 가공하였고 건조기에 건조시켜 수분함량을 5.4%로 조절하였으며 4℃에서 냉장 보관하여 실험에 사용하였다.

Table 1.1UF, unfermented fecal solid diet; FF, fermented fecal solid diet; CF, commercial feed. 2CA, certain amount.

Table 2.1UF, unfermented fecal solid diet; FF, fermented fecal solid diet; CF, commercial feed diet.

발효고형오물 일반 성분 분석

실험사료의 일반성분 분석은 일반성분은 AOAC (1995) 방법에 따라 조단백질은 Kjeldahl법으로 분석하였으며, 조지방은 choloroform과 methanol을 2:1 비율로 혼합한 용액을 용매로 한 Bligh and Dyer추출법(1959)에 준하였다. 수분은 상압가열 건조법으로 105℃의 건조기(Dongwon, dry oven, Korea)에서 6시간 동안 건조 후 측정하였으며, 조회분은 직접회화법으로 600℃ 회화로에서 4시간 동안 태운 후 정량 하였다. 탄수화물 함량은 시료의 수분, 단백질, 지질 및 회분의 함량을 뺀 값으로 하였다.

발효고형오물 아미노산 분석

총아미노산은 시료 100 mg에 6 N 염산 2 mL를 첨가하여 이를 heating block (HF21, Yamato Scientific Co., Japan)에서 110℃로, 24시간 가수분해한 후 glass filter로 여과 및 감압건조하였다. 건조물은 sodium citrate buffer (pH 2.2)로 100 mL 정용 플라스크에 정용한 후 아미노산 자동분석기(Biochrom 30, Amershame Parmacia Biotech, England)로 분석 및 정량 하였다.

발효고형오물 지방산 분석

총 지질 추출은 Bligh and Dyer (1959) 방법에 준수하여 Chloroform과 methanol을 2:1로 혼합한 용액을 이용하여 추출하였다. 추출된 총 지질 80 mg을 취하고, 0.5 N NaOH-methanol 용액을 이용하여 검화하였으며 BF3-methanol (Sigma, USA)을 사용하여 fatty acid methyl ester로 methylation 시킨 후 capillary column (OmegawaxTM-320, 30 m×0.32 mm×0.25 μm, I.D., SUPELCO, USA)이 장착된 Gas Chromatography(Glarus 600, Perkin Elmer, USA)로 지방산을 분석하였다. Carrier gas는 헬륨을 사용하였고 injector 온도는 250℃, detector (FID) 온도는 270℃로 각각 설정하였다. 이때 column 온도는 180℃에서 8분간 유지하고 3℃/분 속도로 230℃까지 증가시킨 후 항온 상태에서 10분간 유지시켰다. 지방산의 동정은 GC-MS로 동정된 menhaden oil을 동일 조건으로 분석한 결과와 ECL (equivalent chain length) 값을 비교하여 동정하였다.

발효고형오물을 이용한 해삼 사육실험

실험에 사용한 돌기해삼(Apostichopus japonicus)은 경남 통영시 산양면에 위치하고 있는 해삼 종묘 생산업체에서 분양받아 경상대학교 어류양식 및 사료 실험실의 배양장으로 운반하여 1,000 L 수조에 수용하였다. 해삼 사육실험은 순환여과 시스템에서 수행하였으며, 보충수는 20%/일로 하였고 순환률은 1회전/일로 하였다. 이때의 실험 환경은 온도 17±1℃, 염분 32±1 psu, 용존산소 5.0-7.2 mg/L로서 인공 배합사료를 공급하면서 5 주간 예비 사육을 하였다.

예비 사육을 거친 해삼을 24시간 절식시킨 후 평균 체중 11.50 g인 개체를 180마리 선별하여 9개의 사육수조인 직사각형 아크릴 수조(45×60×50 cm, 수량 80 L)에 각각 20마리씩 무작위로 분배하여 3개의 실험구를 설정하였다. 각 실험구마다 각각 다른 실험 사료를 급여하여 총 3개 실험구를 3회 반복으로 실험을 수행하였다.

샘플 수집

해삼의 초기 체중은 실험 개시와 동시에 20마리를 채집하여 65℃에서 건조한 후 생체 중량과 건조중량을 측정하여 초기 샘플로 하였다. 변과 잔여 사료의 시료 채취는 사료를 급여하기 전에 사이펀을 이용하여 수조 바닥에 있는 잔여 사료와 변을 채집하였으며, 이를 증류수로 탈염하여 65℃에서 건조 한 후 무게를 측정하였다. 해삼의 최종 체중은 사육 실험이 종료되었을 때, 실험 해삼을 48시간 절식시킨 후에 초기 샘플과 동일한 방법으로 체중을 측정하였다.

성장 및 소화율

생존율(survival rate), 일일 성장률(specific growth rate, SGR), 사료 섭식률(ingestion rate, IR), 증체량(weight gain) 및 겉보기 소화흡수율(apparent digestibility AD)의 계산식은 다음과 같다.

Survival rate SR (%) = 100 × (N2 / N1)

위 식에서 N2는 최종생존 개체 수, N1은 최초 개체 수이다.

SGR (%/day) = 100 (lnW2 − lnW1) / T

IR (mg/g/day) = C / [T × (W2 + W1) / 2]

위 식에서 W1과 W2는 실험 전과 후 각 수조에 있는 해삼의 건조중량, T는 사육기간, C는 섭식한 사료의 건조중량이다.

Weight gain (WG): WG (g/tank) = WF − WI

위 식에서 WI는 수조당 수용한 해삼의 최초 총 습중량, WF는 최종 총 습중량이다.

AD (%) = 100−100×Cr2O3 in diet /Cr2O3 in feces

Cr2O3 함량은 Furukawa (1966) 방법에 따랐으며, 광학식 플레이트에 150 µL씩 넣어 UV-Vis spectrometer을 이용하여 350 nm에서 3반복으로 분석하였다. 분석 후 결과 값과 Y=0.2089 X+0.0032 (Y = 흡광도, X = Cr2O3 mg/100 mL)공식을 이용해 Cr2O3값을 구하였다.

통계처리

모든 통계분석은 SPSS 16.0 프로그램을 사용하였고 Oneway ANOVA test를 실시한 후 Duncan’s multiple rang test(Duncan, 1955)로 평균 간의 유의성(P<0.05)을 검정하였다.

 

결 과

발효고형오물의 일반성분

4단 발효과정을 거친 발효고형오물의 일반성분은 Table 2에서 나타낸 바와 같이 조회분은 발효전의 48.86%에서 발효후 49.68%로 변화가 없었으며 조단백은 21.55%에서 20.43%로, 조지방은 4.75%에서 4.12%로 낮아졌다.

발효고형오물의 아미노산 조성

고형오물사료 발효 전과 후의 아미노산 분석결과는 Table 3에 나타낸 바와 같이 4단 발효과정을 통해 발효된 고형오물사료의 aspartic acid 함량은 2.17%에서 1.76%로 낮아 졌으며 glycine 함량은 0.68%에서 1.35%로 높아지는 것으로 나타났다. Threonine 함량은 0.79%에서 0.55%로 낮아졌으며 methionine함량은 0.28%에서 0.82%로 높아지는 것으로 나타났다. Phenylalanine 함량은 0.63%에서 0.55%로 낮아졌으며 lysine은 0.69%에서 1.27%로, arginine은 0.94%에서 1.16%로 높아지는 것으로 나타났다.

Table 3.1UF, unfermented fecal solid diet; FF, fermented fecal solid diet.

발효고형오물의 지방산 조성

고형오물사료 발효 전과 후의 지방산조성은 Table 4에 나타낸 바와 같이 총 24종 지방산이 동정되었으며 동정되지 않은 peak의 총합이 각각 5.36%와 5.09%였다. 18:2n-6 함량은 21.28%에서 15.11%로 낮아졌으며 20:5n-3 (EPA)과 22:6n-3 (DHA) 함량은 각각 0.25%와 0.82에서 1.49%와 2.87%로 높아지는 것으로 나타났다. 포화지방산(SFA) 함량은 40.72%에서 37.77%로 낮아졌으며 iso-15, anteiso-15 및 iso-16을 포함한 분지지방산(Branched chain fatty acid, BCFA) 함량은 2.08%에서 9.57%로 높아지는 것으로 나타났다.

Table 4.1Values are means of triplicate groups and values in the same row with different superscripts are significantly different (P<0.05). 2UF, unfermented fecal solid diet; FF, fermented fecal solid diet.

발효고형오물을 이용한 기초사육실험

전 실험기간을 통한 해삼의 성장 결과는 Table 5에 나타낸 바와 같다. 미발효고형오물사료구(UF)구는 초기 11.50 g에서 25.32 g으로 성장하였으며, 발효고형오물사료(FF)구는 초기 11.50 g에서 56.09 g으로 성장하였다. 이 때 상품사료(CF)구는 초기 11.50 g에서 55.42 g으로 성장하였다. 미발효고형오물 사료 실험구는 발효 고형오물사료 실험구와 상품사료 실험구에 비하여 유의한 차이로 낮으며(P<0.05) 발효고형오물사료와 상품사료 실험구에서는 유의적 차이가 없었다(P<0.05).

Table 5.1Data values are means of triplicate groups and values in the same row with different superscripts are significantly different (P<0.05). 2UF, unfermented fecal solid diet; FF, fermented fecal solid diet; CF, commercial feed.

증체량(WG)은 Table 5에 나타낸 바와 같이 미발효고형오물사료 실험구, 발효고형오물사료 실험구 및 상품사료 실험구는 각각 276.41 g, 891.84 g 및 878.32 g였다. 발효고형오물사료 실험구는 상품사료 실험구에 비하여 유의적 차이가 없었으나 미발효고형오물사료 실험구보다 유의한 차로 높게 나타났다(P<0.05). 일일성장률(SGR)에 있어 미발효고형오물사료 실험구, 발효고형오물사료 실험구 및 상품사료 실험구는 각각 0.88%/d, 1.76%/d 및 1.75%/d였다. 발효고형오물사료 실험구는 상품사료 실험구에 비하여 유의적 차이가 없었으나(P<0.05) 미발효고형오물 실험구보다 유의한 차로 높게 나타났다(P<0.05). 전 실험기간에 모든 실험구에서는 폐사한 개체가 없어 생존율 100%였다. 사료섭식률(IR)과 겉보기 소화율(AD)는 Table 5에 나타낸 바와 같다. 사료섭식률에 있어 미발효고형 오물 실험구, 발효고형오물 실험구 및 상품사료 실험구는 각각 8.23 g/g/d, 11.71 g/g/d 및 12.23 g/g/d였다. 미발효고형오물사료 실험구는 발효고형오물 실험구와 상품사료 실험구에 비하여 유의한 차이로 낮게 나타냈으며(P<0.05) 발효고형오물 실험구와 상품사료 실험구에서는 유의적 차를 나타내지 않았다(P<0.05). 겉보기 소화율에 있어 미발효고형오물사료 실험구, 발효고형오물사료 실험구 및 상품사료 실험구는 각각 15.26%, 26.73% 및 27.48%였다. 미발효고형오물사료 실험구는 발효고형오물사료 실험구와 상품사료 실험구에 비하여 유의한 차이로 낮게 나타냈으며(P<0.05) 발효고형오물사료 실험구와 상품사료 실험구에서는 유의적 차를 나타내지 않았다(P<0.05).

 

고 찰

전 세계적으로 육상순환양식시스템(RAS)에서 배출되는 고형오물에 의한 환경오염 문제는 갈수록 그 정도가 심각해지고 있기 때문에 근본적인 해결책이 요구되고 있다. 2012년 국내 어류양식 생산량은 76,308톤 이고 이를 생산하기 위하여 소비된 생사료는 443,382 톤이고, 배합사료는 67,127톤이다(KOSIS, 2013). 공급한 사료의 약 36%가 고형오물로 배출되었을 때 연간 약 24,165톤의 고형오물이 발생될 것으로 추정된다. 고형오물은 어류가 소화하지 못한 잔여 영양소와 섭식하지 못한 잔여 사료로 구성되어 유기물 함량이 50-92% 차지한다(Piedrahita, 2003; Gebauer, 2004; Gebauer and Eikebrokk, 2006; Mirzoyan et al., 2008). 본 연구에서는 육상어류양식장에서 배출된 고형오물의 이러한 특성을 이용하여 농가부산물인 미강과 대두박을 보조원료로 첨가하여 미생물 발효를 통하여 해삼사료로 활용하는 시도를 하였다. 성장 결과를 보았을 때 Talbe 5에 나타낸 바와 같이 발효고형오물사료 실험구는 미발효고형오물 실험구보다 높은 성장 결과를 나타났고 상품사료와 동일한 해삼 성장을 나타내었다. 미발효고형오물 사료구에서 성장이 저조한 것은 해삼이 육상어류양식장에서 배출된 고형오물, 미강 및 대두박에 대한 소화흡수능력이 약한 점이 저조한 성장 결과에 반영된 것으로 추정된다(Table 5). Anugwa et al. (1989) 및 Wilfart et al. (2007)의 연구에 의하면 불소화 또는 난소화성 원료를 발효시키면 고분자 물질을 저분자 물질로 변화시켜 소화성이 개선된다고 보고되어 있다. 본 연구에서 발효과정을 거친 고형오물사료는 겉보기 소화율이 15.26%에서 26.73%로 높아지는 점이 이와 유사하였다. 선행연구에서 해삼사료의 아미노산 조성에서 glutamic acid, methionine, lysine 및 arginine이 해삼의 성장에 중요한 역할을 한다고 보고된 바가 있다(Li et al., 2012). 본 연구에서 발효과정을 통한 고형오물사료의 아미노산조성에 있어 glutamic acid, methionine, lysine 및 arginine이 각각 2.0 배, 3.0 배, 1.8 배 및 1.2 배로 증가되었다. 이러한 특정 아미노산의 증가로 인해 해삼의 성장이 개선된 것으로 생각된다.

해삼은 20:1n-9, 22:1n-9, 20:3n-3, 20:4n-6 및 20:5n-3를 어느 정도로 합성할 가능성이 제시되고 있으나, 기타 해양동물처럼 사료에 20:5n-3 (EPA)와 22:6n-3 (DHA)이 결핍될 때 성장에 영향을 미친다(Hasegawa et al., 2014; Yu et al., 2015; Wen et al., 2016). 본 연구에서 발효과정을 거친 고형오물사료는 EPA와 DHA 함량이 각각 5.97 배와 3.48 배로 증가하였다. 이러한 고도불포화지방산의 증가로 인하여 발효 전과 후의 해삼사육효과의 차이를 나타나게 된 원인이 될 수 있을 것으로 생각된다. 발효 전과 후의 지방산 변화에 있어 또한 BCFA가 4.6 배 높아진 것을 발견하였다. 대다수 BCFA는 미생물에 의하여 합성되는 특이한 지방산이다(Leo and Patrick, 1966). 해삼은 BCFA을 합성할 수 없으나 먹이로부터 섭취하여 체내에 다량으로 축적하고 있다(Kaneniwa et al., 1986; Hasegawa et al., 2014). BCFA의 해삼에 대한 생리 기능이 아직 밝혀지지 않았으나, Hasegawa et al. (2014)의 연구에 의하면 사료의 BCFA 함량이 증가함에 따라 해삼의 빠른 성장률을 나타낸다고 보고된 바가 있다. 이러한 복합적인 요인의 작용에 의하여 고형오물사료가 발효과정을 통하여 해삼 사육 효과가 개선된 것으로 생각된다.

지충이(Sargassum thunbergii)는 해삼 배합사료에 널리 사용되고 있는 주요한 원료로서(Seo et al., 2011; xia et al., 2012; Yuan et al., 2006) 최근 해삼양식규모가 커짐에 따라 지충이의 가격이 급격하게 비싸지고 있으며 이로 인한 해조자원의 고갈이 우려되고 있다(Gao et al., 2011; Seo et al., 2011; Shi et al., 2013). 이런 문제를 해결하기 위하여 육상식물로 해삼사료 원료인 지충이를 20-40%를 대체하고 있다(Seo et al., 2011; Yu et al., 2015 ). 본 연구에서 해조분말을 사용하지 않고 육상어류양식장에서 배출된 고형오물과 가격이 저렴한 농가부산물 미강과 대두박을 첨가하여 발효시킨 후 해삼에게 급여하였을 때 상품사료와 동일수준인 성장효과를 얻었다. 이는 육상어류양식장에서 배출된 고형오물을 처리하는 동시에 해삼사육에 있어 사료비용 절감과 해조류의 대량 채집으로 인한 생태자원파괴를 개선하는데 기여될 수 있을 것으로 판단된다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 지금까지 육상어류양식장에서 배출되는 고형오물을 처리하는데 마땅한 대한이 없는 상황에서 육상고형오물의 발효과정을 거쳐서 해삼사료 자원화를 시도했다는 점에서 본 연구의 의의는 크다고 생각한다.