Extract from Eucheuma cottonii Induces Apoptotic Cell Death on Human Osteosarcoma Saos-2 Cells via Caspase Cascade Apoptosis Pathway

Eucheuma cottonii 추출물에 의한 인체 골육종암 Saos-2 세포의 자가사멸 유도

Abstract

Osteosarcoma (OS) is the most common and malignant bone tumors. Although many types of resection surgery and experimental agents were developed, median survival and clinical prognosis are poorly investigated. Recently, several researches have reported that Eucheuma cottonii has potent as protective effects of coal dust-induced lung damage via inhibition of malondialdehyde (MDA) and oxidative stress in bronchoalveolar lavage fluids (BALF). However, anti-cancer effects and specific molecular mechanism of extract from Eucheuma cottonii (EE) has not been clearly studied yet. This study evaluated that anti-cancer potential of EE in human osteosarcoma Saos-2 cells. EE indicated cytotoxicity on Saos-2 cells in a dose-dependent manner. Morphological degradation and nucleic condensation were also observed under the EE treatment. However, it did not significantly affect on non-cancerous kidney HEK-293 cells under the same concentration which is shown cytotoxicity on Saos-2 cells. The phosphorylation of Fas-Associated Death Domain (FADD) and expression of cleaved caspase-8, -7 and -3 were upregulated in a dose-dependent manner. In immunofluorescence staining, expression level of Fas and cleaved PARP were upregulated by EE treatment. Furthermore, treatment of EE induces upregulation of sub G1 phase by flow cytometry analysis. The results demonstrated that EE has a therapeutic potential against osteosarcoma via FADD mediated caspase cascade apoptosis signal pathway.

본 연구에서는 인간 골육종암세포주인 Saos-2 세포를 이용하여 Eucheuma cottonii 추출물(Extract of Eucheuma cottonii, EE)의 항암 활성 및 분자적 작용기전을 분석하였다. 먼저 EE가 세포증식에 미치는 영향을 WST-1^® assay를 통해 확인한 결과 EE는 인간 위암세포 AGS, 인간 간암세포 SK-Hep 1, 인간 뇌교모세포종 U87MG, 인간 정상 신장세포 HEK-293의 생존율에는 영향을 미치지 않고 Saos-2 세포주의 생존율만을 농도의존적으로 감소시킴을 확인 하였다. 또한 처리 농도가 증가함에 따라 Saos-2 세포의 외형적 변화가 나타남을 도립현미경을 통해 확인할 수 있었다. 그리고 DAPI staining을 통해 apoptosis classical hall marker라고 할 수 있는 DNA fragmentation이 EE 처리 농도 의존적으로 나타남을 관찰할 수 있었다. 이를 토대로 EE가 Saos-2 세포에서 세포 내의 어떠한 기작을 통해 apoptosis를 유도하는지 Western blot analysis를 통해 확인한 결과, Fas-Associated Death Domain(FADD)에 의한 caspase cascade signal pathway 발현이 증가하였고, apoptosis의 key protein 이라고 할 수 있는 cleaved caspase-3와 하위 인자인 cleaved PARP가 증가 함을 확인할 수 있었다. 이와 관련된 분자적 기전 분석을 위한 immunofluorescence staining과 Flow cytometry analysis를 추가로 수행한 결과, EE 처리시 caspase cascade signal pathway의 시발점인 FAS와 cleaved caspase-3의 발현증가가 실제 세포 내에서 일어남을 관찰 할 수 있었으며 apoptosis 유발군인 sub G1기가 증가 함을 알 수 있었다. 이상의 결과를 통해 EE는 인간 골육종암세포에서 FADD에 의한 caspase cascade signal pathway 발현증가가 유도되어 apoptosis를 유발시킨다는 것을 증명하였으며 새로운 골육종암 치료제로서의 개발 가능성과 기전연구를 위한 중요한 기초자료가 될 수 있음을 시사한다.

서 론

뼈는 vascular mineralized tissue에 의해 아주 복잡하고 체계적으로 유지되고 있으며 근육과 인대, 장기의 지지 및 보호 역할과 미네랄 저장 등의 매우 다양한 기능을 수행하고 있다[1]. 골육종암은 뼈에 발생하는 암으로 현재 전세계적으로 유아와 청소년 등 젊은 연령층에서 흔히 나타나며 사망률이 두번째로 높은 암이다[2, 3]. 현재 가장 많이 쓰이는 치료법으로는 surgical resection과 methotrexate, doxorubicin, cisplatin 등을 사용한 chemotherapy가 알려져 있고, 이 두 가지 방법의 병행을 통한 치료에 의해 5년 생존율은 70% 정도까지 증가하였다. 하지만 일부 환자의 경우 chemotherapy의 약효가 제대로 나타나지 않아 치료가 어려우며, 그로 인해 이를 대체할 새로운 치료 방법에 대한 연구가 계속적으로 요구되는 상황이다[3-6].

Apoptosis는 흔히 programmed cell death라고 알려져 있으며 잘못된 세포의 증식과 유전적 결함의 축적을 막아 종양의 형성을 막음으로써 다세포 생물의 생존에서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다[7]. Apoptosis는 크게 extrinsic (death receptor) pathway와 intrinsic (mitochondrial) pathway 두 가지 경로로 나뉜다. Extrinsic (death receptor) pathway는 세포막 표면에 있는 FAS ligand와 같은 인자에 의해 활성화된다[8. FAS ligand는 FAS-Associated Death Domain (FADD)을 활성화시켜 하위인자인 caspase-8을 활성화 형태인 cleaved caspase-8으로 cleavage시킨다[9, 10]. Cleaved caspase-8은 하위인자인 caspase-7, caspase-3, PARP [poly (ADP-ribose) polymerase] 차례대로 cleavage시키며 활성화시키고 cleaved caspase-3와 cleaved PARP에 의해 DNA fragmentation, chromatin condensation, cell shrinkage, membrane blebbing 등이 진행되어 apoptosis가 유도된다[11]. Intrinsic (mitochondrial) pathway는 mitochondria membrane의 투과성을 조절하는 Bcl family 중 pro-apoptosis protein인 Bid, Bak, Bad, Bax 등의 발현을 유도하여 mitochondria membrane의 투과성을 증대시켜 mitochondrial intermembrane space protein인 cytochrome c의 방출을 유도한다[12]. Mitochondria membrane의 외부로 방출된 cytochrome c는 세포질에 존재하는 pro-apoptotic protein들과 복합체를 형성하여 하위인자인 caspase들의 활성화를 유도하여 최종적으로 apoptosis를 유도한다[13].

최근 여러 연구를 통해 해조류는 항암, 항염증, 항미생물, 항궤양성 등 다양한 생리활성을 나타내는 천연물을 제공하는 것으로 보고되고 있다. 이러한 특성때문에 현재 항종양 활성을 가지는 해조류로부터 유래한 천연물의 분리와 이를 활용한 새로운 항암제의 개발을 위한 연구가 진행되고 있다[14]. 홍조류의 일종인 Eucheuma cottonii는 아주 깨끗한 물에서 서식하며 매우 빠르게 성장하여 45일 마다 수확이 가능하다[15]. 현재까지 알려진 E. cottonii의 기능으로는 석탄먼지와 같은 산화적 스트레스요인에 의한 염증으로부터 보호 작용이 있으나, 항암효능과 그 메커니즘에 대한 구체적인 연구는 아직 이루어지지 않았다[16-18].

본 연구에서는 E. cottonii의 추출물(이하 EE)에 의해 골육종암 Saos-2 세포에서 나타나는 항암효과가 apoptosis와 관련된 다양한 단백질들의 어떠한 상호작용을 통하여 일어나는지를 WST-1® cytotoxicity assay, DAPI staining, Western blot analysis, immunofluorescence staining, flow cytometry를 통해 분석하였다. 실험 결과, EE는 골육종암 Saos-2 세포에서 Fas Associated Death Domain (FADD)에 의한 caspase cascade signal pathway의 활성을 통해 apoptosis를 유도함을 확인하였다.

 

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용한 원료인 E. cottonii는 식품용 카라기난 제조용으로 인도네시아로부터 수입되어 사용하고 있는 원료를 사용하였다. E. cottonii 원료는 흐르는 물에 침지시켜 24시간 동안 계속적으로 물을 흘려주면서 탈염 처리하였고, 탈염이 끝난 원료는 48시간 진공 건조하여 수분을 8%이하로 제거한 후, 분쇄하여(60 mesh 이하) 추출 원료로 사용하였다. E. cottonii 추출액은 알코올 추출, 감압여과 그리고 감압농축 과정을 거쳐 준비되었고, 94% Ethyl alcohol (SK Chemical Co., Korea)을 원료대비 15배를 가하여 상온에서 24시간 동안 교반하여 얻었다. 추출액은 다시 정성용 여과지(No.2, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Japan)로 진공펌프(N 840.3 FT.18, KnF, Freiburg, Germany)를 이용하여 감압 여과한 뒤, 농축기(N-1200A, EYELA, Japan)를 이용하여 농축, 동결 건조시켜 실험에 사용하였다.

세포배양

실험에 사용한 인간 골육종암세포 Saos-2, 인간 위암세포 AGS, 인간 간암세포 SK-Hep1, 인간 뇌교모세포종 U87MG, 인간 정상 신장세포 HEK-293는 American Tissue Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받아 사용하였다. AGS 세포는 RPMI 1640 (Cellgro Mediatec, Inc., Mannassas, USA) 배지, SK-Hep 1과 U87MG는 Minimum Essential Medium (MEM) (Cellgro Mediatec, Inc.) 배지, Saos-2와 HEK-293 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Cellgro, Mediatech, Inc.) 배지를 사용하여 배양하였다. 각 배지는 10% heat inactivated fetal bovine serum (Cellgro Mediatec, Inc.)과 100 μg/ml Penicillin and 100 μg/ml Streptomycin (Hyclone, Logan, UT, USA)을 첨가하여 사용하였으며 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.

세포 증식 억제 효과와 형태적 변화 분석

E. cottonii 추출물이 Saos-2 세포의 증식에 미치는 영향은 WST-1Ⓡ assay로 확인하였다. Saos-2 세포를 96-well microplate의 각 well에 1×104 cells씩 분주하고 24시간 배양한 후, 추출물을 추출물을 100 μg/ml, 300μg/ml 농도로 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후 EZ-Cytox Cell Viability Assay Solution WST-1Ⓡ (2-(4-iodophenyl)-3(40nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt) (Daeil Lab Service, Jong-ro, Korea)을 각 well 에 10 μl씩 넣고 37℃, 5% CO2의 조건에서 4시간 동안 반응시킨 후 Microplate reader (Molecular Devices, Silicon Valley, CA, USA)를 이용하여 460 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. E. cottonii 추출물의 처리에 따른 세포의 형태적 변화는 추출물 처리 24시간 후 도립 현미경 CKX41 (Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 200배, 400배의 배율로 관찰하였다.

Western blot analysis에 의한 단백질 발현 분석

단백질 발현량의 변화를 분석하기 위해서 Saos-2 세포에 E. cottonii 추출물을 주어진 농도로 24시간 동안 처리한 후 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 ice-cold lysis buffer [50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 1% Triton x-100, 1% Deoxycholate, 0.1% SDS and proteinase inhibitors (PMSF, EDTA, Aprotinin, Leupeptin, Prostatin A) (Intron biotechnology, Gyeonggi, Korea)]를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후 14,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 그 상등액을 회수하였다. 상등액에 포함된 단백질의 농도는 bovine serum albumin (BSA)을 standard로 Protein Quantification Kit (CBB solutionⓇ) (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA)를 이용하여 측정하였다. 각각의 단백질 sample은 Laemmli sample buffer (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)와 섞어 5분간 끓인 후 식혀서, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (PALL Life Sciences, MI, USA)으로 electro-transfer 시킨 후 5% skim milk를 함유한 PBST buffer (135 mM Sodium chloride, 2.7 mM Potassium chloride, 4.3 mM Sodium phosphate, 1.4 mM Potassium dihydrogen phosphate, 0.5% Tween-20)으로 상온에서 2시간 정도 반응시켜 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 그 다음 PBST로 15분 정도 세척한 후 1차 항체[anti-FAS, anti-FADD, anti-p-FADD (Ser 194), anti-cleaved caspase-8, anti-cleaved caspase-7, anti-cleaved caspase-3, anti-PARP, anti-cleaved PARP, anti-GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)] (Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA)를 처리하여 4℃에서 overnight 시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 PBST로 세척하고 처리된 1차 항체에 대해 적절한 2차 항체(horseradish peroxidase-coupled anti-rabbit lgG or anti-mouse lgG) (Cell Signaling Technology Inc.)를 PBST buffer에 넣은 용액을 이용하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 다시 PBST로 세척하고 enhanced chemiluminescent (ECLⓇ) detection solution (Pierce, Rockford, lL, USA)을 처리한 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현양상을 비교 분석하였다.

Immunofluorescence staining

Cover-glass bottom dish에 자란 Saos-2 세포를 4,6-Diamidimo-2-Phenylindole Dihydrochloride Hydrate (DAPI; Roche, Germany)으로 15분간 37℃에서 반응시켜 핵을 대비 염색하였다. 1x PBS (phosphate-buffered saline) buffer로 한 번 세척한 후 4% formaldehyde (Junsei Chemical Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 세포를 고정시켰다. PBS로 5분씩 3번 세척한 후, blocking과정으로 blocking solution [1 dish 당: Distilled water 199 μl, 10x PBS 25 μl, Normal rabbit serum 12.5 μl, Normal mouse serum 12.5 μl (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), Triton X-100 0.75 μl]을 넣고 상온에서 한 시간 동안 암반응시켰다. Blocking 후 세척 과정 없이 확인하고자 하는 단백질(FAS, cleaved PARP)과 결합하는 1차 antibody (Cell Signaling Technology Inc.)와 β-actin antibody (mouse; Cell Signaling Technology Inc.)를 넣은 antibody dilution buffer [1 dish 당: Distilled water 0.9 ml, 10x PBS 0.1 ml, 5％ BSA 0.05 g (Bioshop, Canada), Triton X-100 3 μl]를 넣어 4℃에서 overnight 시켰다. 2차 antibody 처리 전 세척과정은 1x PBS로 5분씩 1차, 2차 세척을 한 후 high salt PBS [50 ml 당: Distilled water 45 ml, 10x PBS 5 ml, NaCl 1.17 g (Sigma-Aldrich, Inc., MO, USA)]로 3차 세척을 하였다. 세척 후 2차 antibody (mouse, rabbit 0.4 μl씩; Cell Signaling Technology Inc.)를 넣은 antibody dilution buffer에서 1시간 30분간 상온에 반응시켰다. 그 후 1차, 3차 세척은 1x PBS로 시행하고 2차 세척은 high salt PBS로 시행하였다. 세척 과정이 끝난 후 Prolong Gold® Antifade Reagent (Invitrogen, Eugene, OR, USA)을 cover glass 위에 떨어뜨려 형광이 유지되게 한 후, slide glass 위에 올려 형광 현미경(Carl Zeiss LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 1,000배의 배율에서 관찰하였다.

Flow cytometry 분석

Trypsin-EDTA 처리를 통해 세포를 회수 한 후 70% ethanol을 처리하여 4℃에서 overnight 시켰다. 이 후 세포를 PBS buffer로 풀어 준 후 0.2 mg/ml의 RNase A가 첨가된 PBS buffer를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 40 μg/ml의 propidium iodide를 첨가한 후 실온에서 30분 동안 암반응 시켰다. Sub-G1 phase의 비율은 flow cytometer BD FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

통계분석

실험의 측정 결과는 SPSS ver. 12.3 통계프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, 각 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA) 후student’s test를 통해 P value가 0.05 미만(*p<0.005)인 경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

 

결과 및 고찰

E. cottonii 추출물의 정상 및 암세포 증식에 대한 효과

E. cottonii 추출물(EE)이 정상 및 암세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 다양한 농도의 EE를 정상 세포인 HEK-293 신장세포주와 다양한 암 세포주(위암세포 AGS, 간암세포 SK-Hep-1, 교모세포종 U87MG, 골육종암 세포 Saos-2)에 각각 처리한 후 WST-1® assay를 통해 각 세포들의 세포생존율을 분석하였다. EE의 처리농도가 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml로 증가함에 따라, Saos-2 세포의 생존율이 각각 78%, 57%, 44%로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 AGS, SK-Hep1, U87MG 세포주들의 생존율 감소는 관찰되지 않았다. 또한 HEK-293 세포의 생존율은 Saos-2 세포와 같은 처리농도에서 그 생존율이 크게 감소하지 않음을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 이를 통하여 EE는 골육종암 Saos-2 세포에 상대적으로 특이하게 세포생존율을 억제하는 효능을 나타낸다는 것을 확인하였다.

Fig. 1.The cytotoxicity of extracts from E. cottonii on cell proliferation. Each of Saos-2, AGS, SK-Hep1, U87MG and HEK-293 cells were treated with indicated concentration of the extracts from E. cottonii for 24 hr. Each bar represents the mean ± SD (n=3). Asterisks are significant differences from control by ANOVA (*p<0.005).

E. cottonii 추출물 처리에 의한 세포의 형태 변화 및 nucleic condensation 관찰

EE의 처리에 의한 Saos-2 세포의 증식 억제 효과가 Saos-2 세포의 외형 변화와 어떠한 관련성이 있는지 알아보기 위해 도립현미경을 이용하여 세포의 모양 변화를 관찰하였다. EE를 처리하지 않은 대조군에서는 세포의 외형 붕괴가 나타나지 않았고 세포의 외부와 세포막이 구분이 될 만큼 깔끔한 형태를 유지하는 반면, EE의 처리농도가 100 μg/ml, 300 μg/ml로 각각 증가한 실험군에서는 세포 외형의 붕괴와 세포질에서 apoptosome이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 세포에서 apopotsis가 유발되면 세포 외형의 붕괴, apoptosome, nucleic fragmentation 등의 전형적인 특성이 나타난다는[19] 보고를 토대로 DAPI staining을 통한 Saos-2 세포 내에서의 핵 형태 변화를 형광현미경으로 관찰하였다. Saso-2 세포에 EE를 각각 0 μg/ml, 100 μg/ml, 300 μg/ml의 농도로 24시간 처리한 후 DAPI solution으로 staining하여 세포를 관찰한 결과, apoptosis의 전형적 특성인 nucleic fragmentation이 처리 농도가 증가함에 따라 더 확연히 나타난다는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2) [20, 21]. 이러한 결과를 통하여 EE는 Saos-2 세포에 처리시 세포의 apoptosis를 유도하여 세포의 증식을 억제하는 것으로 예측할 수 있었다.

Fig. 2.The extracts from E. cottonii induced morphological changes in Saos-2 cells. (A) Saos-2 cells were treated with the extracts in indicated concentrations for 24 hr, and imaged cell morphology under a phase contrast inverted microscope at ×200 and ×400 magnifications respectively. (B) Fragmented nucleus in Saos-2 cells were observed followed by DAPI staining. Each arrows are indicated the apoptosome in Saos-2 cells.

E. cottonii 추출물의 처리에 따른 apoptosis 관련 단백질의 발현량 변화

Fig. 2의 결과와 같이 EE는 Saos-2 세포에 대하여 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제하며, 이러한 EE의 Saos-2 세포에 대한 증식 억제 효과는 apoptosis의 유도에 의해 발생될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Western blot 분석을 통하여 apoptosis와 관련된 단백질들의 발현량 변화를 확인하였다. Extrinsic (Death receptor) apoptosis는 Tumor-Necrosis Factor (TNF), Fas ligand (CD95L), TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) 같은 ligand들이 세포의 외막에 존재하는 death receptor에 결합하여 발생한다고 알려져 있다.[22-24]. 이들 ligand와 death receptor와의 결합은 Fas-Associated Death Domain (FADD)의 recruitment를 유도하며 하위인자인 caspase-8를 cleaved caspase-8으로 분절시켜 활성화를 유도한다[25, 26]. 활성화 형태의 cleaved caspase-8은 순차적으로 하위인자인 caspase-7, caspase-3을 cleavage시켜 caspase cascade signal pathway의 활성화를 유도한다[27]. Caspase는 cysteine-containing aspartate-specific protease family로 세포가 정상적으로 성장 및 생존할 때에는 핵과 세포질에 영향을 주지 않는 불활성화 형태인 pro-enzyme 형태로 존재하고 있다[28]. 그러나 외부의 death signal이나 endoplasmic reticulum stress 등이 발생하게 되면 세포는 활성화된 형태의 cleaved caspase-3를 유도하여 apoptosis의 전형적인 특징인 DNA fragmentation, chromatin condensation, cell shrinkage, membrane blebbing을 일으키게 되고[20], DNA 손상 시 수선에 관여하는 중합효소인 PARP (Poly ADO-Ribose Polymerase)까지 cleavage시켜 cell cycle arrest를 유도하는 것으로 알려져 있다[20, 29]. 이러한 연구 보고들을 토대로 Extrinsic (Death receptor) apoptosis와 관련된 단백질들의 발현량을 분석하였다. Saos-2 세포에 EE를 농도별로 24시간 처리한 다음 주요 단백질들의 변화량을 확인한 결과 FADD의 인산화와 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 FADD의 하위인자인 cleaved caspase-8, -7, -3 그리고 최종적으로 cleaved PARP의 발현량까지 EE의 처리 농도가 증가함에 따라 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 이러한 결과는 immunofluorescence staining을 통해 caspase cascade signal pathway의 주요 인자인 FAS와 cleaved PARP의 세포내 발현량이 EE를 처리함에 따라 증가되어진다는 것을 현미경하에서 추가적으로 확인할 수 있었다(Fig. 3B, 3C). Fig. 3의 결과를 통하여 EE는 Saos-2 세포에서 extrinsic (death receptor) pathway 중 하나인 FADD에 의한 caspase cascade signal pathway의 활성화를 통해 apoptosis를 유도한다는 것을 확인하였다.

Fig. 3.The extracts from E. cottonii induced FADD mediated apoptosis pathway. (A) Saos-2 cells were treated with 100 μg/ml and 300 μg/ml of the extracts for 24 hr respectively and isolated proteins were analyzed by Western blot analysis with indicated antibodies. GAPDH was used as internal control. Saos-2 cells were treated with the extracts and examined by immunofluorescence staining to detect the expression levels of (B) FAS and (C) cleaved PARP using a confocal laser scanning microscope.

E. cottonii 추출물에 의한 세포주기의 변화

Western blot 분석과 immunofluorescence staining을 이용하여 EE가 Saos-2 세포에서 FADD에 의한 caspase cascade signal pathway를 통해 apoptosis를 유도함을 확인하였다(Fig. 3). Apoptosis가 유발되는 동안 세포는 cytoskeleton collapse, chromatin condensation, DNA fragmentation과 같은 다양한 세포의 생명유지에 치명적인 현상이 나타나게 된다[19]. 또한 세포 내에서의 정상적인 DNA 수선 기능이 작동되지 않아 세포주기가 진행되지 못하고 멈추게 되어 sub G1의 비율이 높게 나타나게 되는 것으로 알려져 있다[30, 31]. 이러한 보고들을 토대로 EE를 Saos-2 세포에 처리하게 되면 apoptosis가 유도되고 이와 동시에 DNA 수선 기능에 문제가 생길 경우 sub G1 비율은 증가 할 것으로 예측할 수 있다. 이러한 세포주기의 변화를 확인하기 위해 EE를 Saos-2 세포에 각각 100 μg/ml, 300 μg/ml로 24시간 처리하고 DNA에 결합하는 형광물질인 Propidium Iodide (PI)로 DNA를 staining한 후 flow cytometry로 세포주기의 변화를 분석하였다. 앞서 예측한바와 같이, EE의 처리 농도가 증가함에 따라 Saos-2 세포의 sub-G1 phase가 각각 8.97%, 18.97%로 증가함이 확인되었다(Fig. 4). 이 결과는 EE의 처리가 Saos-2 세포에서 apoptosis를 유도함과 동시에 세포주기 sub-G1의 비율을 증가시킨다는 것을 증명하고 있다. 실험의 모든 결과들을 종합하면, EE는 Saos-2 세포에서 FADD에 의한 caspase cascade signal pathway를 활성화시키고, 최종적으로 DNA 수선 단백질인 PARP를 cleaved PARP로 cleavage시켜 apoptosis를 유도한다고 할 수 있으며 Fig. 5를 통해 그 작용기작을 설명할 수 있다.

Fig. 4.The extracts from E. cottonii increased sub-G1 phase in Saos-2 cells. Saos-2 cells were treated with the extracts in indicated concentrations for 24 hr, and sub-G1 DNA contents were measured by FACS analysis.

Fig. 5.Schematic diagram of FADD mediated apoptosis pathway induced by the extracts from E. cottonii in Saos-2 cells.

과학기술의 발달과 더불어 과거에 비해 골육종 치료에 보다 더 발전된 surgical resection과 다양한 chemotherapy가 이용되고 있지만, 수술 후 남게 되는 후유증이나 약물 반응성의 제한적인 점 등 여러 가지 문제점으로 인해 천연물유래 항암치료제의 개발에 대한 관심은 꾸준히 증대되고 있는 상황이다[32, 33]. 따라서 본 연구에서는 EE를 골육종암의 새로운 천연물유래 치료제로서 활용할 수 있는지 그 활용 가능성을 알아보고자 항암 활성 및 작용기전을 확인하였다. EE는 Saos-2 세포에서 FADD 활성에 의한 caspase cascade signal pathway의 활성을 유도하고 PARP의 cleavage를 증가시켜 apoptosis를 유도하는 것으로 확인되었으며, 이러한 분자적 항암 작용기전은 골육종암 치료에 대한 새로운 천연물유래 항암제 후보 물질을 발굴하는 과정의 기초 자료로 사용될 것으로 사료된다. 또한 이러한 기초 기전연구를 바탕으로 실질적인 골육종암 치료제로서의 사용 가능성을 확인하기 위해서는 추가적인 생리 활성 성분의 순수분리 및 in vivo에서의 추가 실험 등이 수행되어야 할 것이다.