Effects of Boheotang-gagam on Milk Production and Factors Related Lactation in Postpartum Mice

보허탕가감 투여가 산후 생쥐의 유즙분비량 및 유즙분비 관련 인자에 미치는 영향

Abstract

Objectives :The purpose of this study was to investigate the effect on factors related the expression of aquaporins (AQP) and milk production after administration of Boheotang-gagam in lactating mice. Methods: The SKH-1 mice were randomly allocated to the control group which was administered with distilled water for two weeks after the parturition and the experimental groups such as, lactating+400G group (L400G) which was administered with Boheotang-gagam 400 mg/day, lactating+600G group (L600G) which was administered with 600 mg/day for two weeks after the parturition, and 400G+lactating+400G group (400G-L400G) which was administered with 400 mg/day for 3 weeks starting one week prior to parturition for experiment (n=6 per group). Results: 1. With regard to the immunohistochemical staining reaction for AQP1, AQP3, and AQP5, stronger immune response was also showed in mammary gland in all experimental groups as compared to the control group. AQP1 showed stronger immune response in the capillaries and venules which were located around the interlobular duct, while stronger immune response of AQP3 and AQP5 showed in the secretory alveolar epithelia and intralobular and interlobular ductal epithelial cells. 2. In the western blot, L400G group showed the most increased expression followed by L600G and then 400G-L400G group in AQP1. In AQP3, the order of expression density was observed as L600G, 400G-L400G and L400G group. Lastly, in AQP5, L400G group presented the most increased expression followed by L600G and 400G-L400G group. Conclusions: Boheotang-gagam would have the effect of increasing the lactation of mice after the birth by increasing the prolactin level and adjusting the expression of AQPs and prolactin receptor in the mammary glands.

I. 서 론

여성의 고학력화와 사회진출이 활발해지면서 만혼과 함께 고령임신 및 출산이 점차 늘어나는 추세이다. 이로 인하여 난산과 제왕절개 분만비율이 증가하고 있으며1), 이러한 사회적 분위기 속에서 많은 여성들은 모유수유에 어려움을 겪고 있고, 다수에서 모유량 부족을 경험하고 있다2).

한의학에서 산후에 유즙이 심하게 적거나 없는 것을 ‘缺乳’, ‘産後乳汁不行’, ‘乳少’, ‘産後無乳汁’ 등이라 한다. 이러한 유즙부족의 병인병기는 氣血이 虛하여 유즙생성이 부족한 경우와 氣血은 왕성하나 肝氣鬱結로 유즙분비가 잘 되지 않는 경우로 구분할 수 있다. 산후에는 분만 시에 衝任, 胞脈이 손상되고 출혈이 과다하여 亡血傷津에 이르기 쉽고, 正氣가 虛하여 邪氣에 쉽게 침범되어 營衛가 不調하고 氣血이 不和하며 장부의 기능이 손상을 받기 쉽게 된다3). 최근 증가하고 있는 고령임신 및 그에 따른 난산과 제왕절개 분만 시에는 이러한 氣血不足과 營衛不和의 상황이 더욱 쉽게 초래될 수 있으므로 산후의 식이 및 섭생이 더욱 중요하고 질병 발생 시에도 특별한 주의와 치료가 필요하다.

산후에 다용하는 補虛湯은 ≪丹溪心法≫4)에서 기원하여 ≪醫學入門≫5)에 최초로 수록된 처방이며, 산후 大補氣血을 목적으로 人蔘, 白朮, 當歸, 川芎, 黃芪, 陳皮, 甘草, 生薑으로 구성되어 있다. 許 등4,6)은 “産後當大補氣血爲先 宜用補虛湯 雖 有雜證以末治之”라 하여 산후에는 마땅히 大補氣血하여야 하고 산후 大補氣血의 목적으로 補虛湯의 사용이 매우 중요하다고 하였다. 따라서 氣血을 大補하는 補虛湯은 正氣가 虛하여 질병에 이환되기 쉬운 산후라는 특수한 상황에 적합한 처방으로 임상에서 두루 활용되었고, 관련연구 또한 이루어져 왔다7-9). 이 중 補虛湯의 유즙분비 촉진작용에 대한 최근 실험 연구로 분만직후 생쥐에 補虛湯과 補虛湯加鹿茸을 투여하고 유선조직 및 유즙분비 관련 인자의 mRNA 발현 등을 관찰한 연구9)가 있었으나, 의미 있는 결과 지표 선정 및 한의학적 기전의 현대 의학적 재해석을 위하여 추가 연구의 필요성을 제시하였다.

한편 1990년대에 aquaporin(AQP) 수분통로가 발견된 이후로 이 분야에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다10-4). AQP는 인체의 곳곳에 존재하는 것으로 밝혀졌는데, 유선조직의 AQP는 유방암에서 최초로 발견되었다10). 최근에는 설치류와 소의 정상 유선조직에서 AQP1, AQP3, AQP5의 발현이 증명되었고11,12), 모유량과 이들 AQP의 상관관계, 그리고 그 기전에 대한 연구가 진행되고 있다12-4).

이에 저자는 補虛湯에서 人蔘 대신 補腎益精 養血潤燥하는 海蔘을 加하고, 通氣下乳하여 임상에서 모유촉진 목적으로 다용되는 木通, 通草, 王不留行을 가미한 補虛湯加減을 분만 전후의 생쥐에게 복용시킨 후, 새끼생쥐의 무게와 수유량 측정, 유선조직 관찰 및 유선조직에서 유즙분비와 관련된 AQP11-4) 등을 관찰하여 補虛湯加減의 유즙분비촉진 작용에 대하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

 

II. 재료 및 방법

1. 재 료

1) 실험동물

실험동물은 25 g 내외의 SKH-1 생쥐를 자체 번식하여 20±2℃, 습도 55±5% 조건하에서 적응시킨 후에 사용하였다. 고형사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험 개시 전에 교미를 시킨 후 에 임신된 암컷(출산 날짜가 유사한 것)을 총 4군으로 나누어 분만하기 10일 전에 각각의 cage에 1마리씩 격리하여 적응시킨 후 한 군당 6마리씩 배정하여 사용하였다. 정상적인 분만과 수유를 하는 어미와 새끼들만을 실험에 사용하였으며, 대조군과 비교하기 위하여 임신을 하지 않은 SKH-1 생쥐를 virgin군으로 사용하였다. 동물실험은 우석대학교 동물실험윤리위원회의 승인(WS2015-002)을 받아 실시하였다.

2) 투여 약재

補虛湯加減(이하 BHT)은 우석대학교 부속한방병원에서 처방하는 연조엑스를 사용하였다. BHT 연조엑스는 대한약전의약품 공정 기준과 함소아 제약회사 공정기준에 의하여 함소아원외탕전원에서 제조하였다. 첩당 3포(1포당 10 g 제품) 분량으로 3000포 조제분에 손실분을 고려한 한약재 59.84 kg을 480 L의 정수를 사용하여 90℃ 이상에서 2시간 30분 동안 탕전하고 325 L를 추출(3.0 Brix)하였다. 그 후 필터링(3 μm cleal cp filter)하여, 60℃ 이하에서 약 3시간에 걸쳐 10.92 kg의 농축액을 얻어내고, 정제수, 각종 매스킹 원료와 함께 조제탱크에 넣어 90℃ 이상에서 약 1시간 동안 멸균하였다. 멸균이 끝난 후 필터(75 μm cleal cp filter)를 장착하고, 멸균된 포장기 노즐을 장착하여 90℃ 이상으로 유지하며 1포당 10 g씩의 분량으로 포장하여 만들었다.

연조엑스는 실험군에 따라 분만 1주일 전 혹은 분만 후부터 1일 2회 오전과 오후에 2주 또는 3주간 구강투여 하였다. BHT는 ≪東醫寶鑑≫11)에 수재된 補虛湯을 기본으로 人蔘대신 補腎益精 養血潤燥하는 海蔘을 加하고, 通氣下乳의 효과가 있는 木通, 通草, 王不留行을 가미한 처방으로 처방구성약물과 1첩 분량은 다음과 같다(Table 1).

Table 1.Prescription of Boheotang-gagam(補虛湯加減, BHT)

2. 방 법

1) 실험군 설정

출산 후 1일째부터 2주간 증류수를 투여한 군을 대조군(control group, 이하 LH2O)으로 설정하고, 실험군은 출산 후 1일째부터 2주간 BHT 400 mg/day을 투여한 군(lactating+400G group, 이하 L400G), 출산 후 1일째부터 2주간 BHT 600 mg/day 을 투여한 군(lactating+600G group, 이하 L600G), 출산 1주 전부터 출산 후 2주째까지 3주간 1일에 400 mg/day을 투여한 군(400G+lactating+400G group, 이하 400G-L400G) 으로 나누었으며, 각 군마다 새끼를 잘 키우는 생쥐를 6마리씩 무작위 배분하여 본 실험에 사용하였다. 분만 직후에는 어미생쥐 1마리당 새끼생쥐 6마리만 남겨두고 실험을 진행하였다. 대조군과 비교하기 위하여 임신을 하지 않은 SKH-1 생쥐를 virgin군으로 사용하였다.

2) 새끼생쥐의 체중 측정

분만 후 3일째부터 오전에 6마리의 새끼생쥐의 체중을 2주간 매일 측정하여 각 군 간에 비교하였다.

3) 수유량 측정

수유량의 측정은 Liu 등14)의 방법을 변형하여 수유 전후 새끼생쥐의 무게를 측정하여 수유량으로 계산하였다. 분만 후 3일째부터 12일간 오전 9시경 어미생쥐를 새끼생쥐로부터 3시간 분리시켜 새끼생쥐를 굶긴 후에 수유 전 체중을 측정하였다. 그 후 3시간 동안 분리한 어미생쥐를 각각의 새끼생쥐 케이지에 넣어 1시간 동안 수유시킨 후 즉시 새끼생쥐의 수유 후 체중을 측정하였다. 수유 후 새끼생쥐의 체중에서 수유 전 새끼생쥐 체중을 뺀 차이를 수유량으로 계산하였다.

4) 혈액 채취 및 광학현미경적 관찰을 위한 조직 절취

출산 후 2주째 실험이 종료된 후 각 실험군의 어미생쥐와 8주령 미경산 생쥐(virgin)를 Avertin으로 마취하여 혈액을 채취하여 prolactin에 대한 ELISA 분석용 혈청으로 사용하였다. 혈액을 채취한 후 생리식염수로 혈액을 완전히 방혈시킨 후 Bouin용액으로 관류 고정하였다. 고정한 후 서혜부쪽의 유선을 절취하여 일반적인 방법에 의하여 탈수와 투명화 과정을 거쳐 파라핀으로 포매하였다. 포매 후 7 μm 두께의 절편을 제작하여 H&E 염색과 Masson’s trichrome 염색을 시행하여 광학현미경적 변화를 관찰하였다. Masson’s trichrome 염색은 weigert iron hematoxylin으로 10분간 염색하고, Biebrich scarlet-Acid fuchsin으로 15분간 염색한다. 그 후 phosphomolybdic-phosphotungstic acid로 탈색과 감별을 위하여 10분간 처리 하였다. 그 후 Aniline blue로 15분간 염색한 후 1% acetic acid로 5분간 처리하고 탈수와 투명화 과정을 거친 후 permount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

5) 면역조직화학적 염색

면역조직화학적 염색을 위해 유선조직의 파라핀 절편을 제작하였다. 파라핀 절편은 7 μm의 두께로 절단한 후 100% methanol에 0.3% H2O2를 넣은 용액에서 endogenous peroxidase를 제거하였다. 그 후 비특이적인 면역반응을 제거하기 위하여 30분간 정상혈청(normal serum, 1:50)으로 처리하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 유선에서는 prolactin receptor(1:15, sc-20992, Santa Cruz, CA, USA), AQP1(1:15, sc-20810, Santa Cruz, CA, USA), AQP3(1:100, ab125219, abcam, UK), AQP5(1:100, ab104761, abcam, UK)를 이용하였다. 1차 항체의 희석배율은 구입한 회사에 따라 차이가 있으므로 각각의 항체에 대한 positive control test를 실시하여 상기한 적정 항체 희석 배율을 정한 후 4℃의 moisture chamber에서 24시간 염색하였다. 2차 항체는 1차 항체 반응 후 5분간 3회 0.1 M phosphate buffer(PB) 로 수세과정을 거친 후에 Hsu 등15)의 방법에 따라 biotinylated anti-IgG(Vector Laboratories, Inc., CA, U.S.A.)를 1:200으로 희석한 후 실온의 moisture chamber에서 30분 동안 반응시켰다. 다시 5분간 3회 0.1 M PB 수세과정을 거친 후 peroxidase가 표지된 ABC 용액에서 30분간 반응시켰다. 그 후 다시 0.1 M phosphate buffered saline(PBS)으로 15분간 2회 수세하고 나서 30 mg의 3-3' diaminobenzidine를 150 mL의 0.1 M PBS에 녹인 용액에서 5분간 반응시킨 후 과산화수소를 0.005%가 되게 첨가하여 갈색의 발색반응을 약 15분간 시행하였다. 반응이 끝난 조직들은 hematoxylin으로 핵염색을 시행한 후 통상적인 방법에 따라 탈수와 투명화를 거친 후 permount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

6) 혈청 내 Prolactin 농도 측정

혈청 내 prolactin 농도는 prolactin mouse ELISA kit(abcam, ab100736, UK)를 구입하여 Bassey 등16)의 방법에 의하여 측정하였다. Anti-mouse prolactin antibody가 코팅된 microplate의 각 well에 혈청시료 100 μL씩 분주하고 실온에서 2시간 30분 반응시킨 후 wash buffer로 4회 세척하였다. 그 후 Biotinylated anti-mouse antibody 100 μL를 각 well에 넣고 실온에서 1시간 반응 한 후 4회 wash buffer로 세척하였다. 세척 후 HRP-streptavidin solution 100 μL를 각 well에 넣고 실온에서 45분 반응 한 후 4회 wash buffer로 세척하였다. 발색을 위하여 TMB One-Step substrate 100 μL를 각 well에 넣고 실온에서 30분간 반응 시킨 후, 50 μL Stop solution을 넣어 반응을 종료시킨 후 microplate reader(VERSAmax, U.S.A.)로 450 nm에서 측정하였다. 표준물질은 recombinant mouse prolactin standard를 사용하였다.

7) 유선조직의 단백질분리 및 AQP1,AQP3, AQP5의 Western blotting

실험이 종료된 후 각 실험군의 유선조직 10 mg을 RIPA lysis buffer(+PMSF 0.2M, Aprotinin 10 mg/mL, Pepstatin A 1 mg/mL, Amresco Inc., U.S.A.)를 사용하여 조직분쇄기(T10 basic, IKA, China)로 13,500 rpm으로 10초간 2회 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 bradford법을 이용해 정량한 후 well 당 20 μg씩 10% acrylamide gel에 loading 한 후 SDS-PAGE system(Mini-PROTEIN 3 CELL, Bio-Rad)을 이용하여 단백질 전기영동을 시행하였다. 전기영동 후 Transfer system(Mini-Trans-Blot Electrophoretic TransferCell, Bio Rad)을 이용해 PVDF membrane (0.22 μm, Millipore)에 1시간 동안 transfer를 한 다음 1시간 동안 5% skim milk로 blocking하였다. 본 실험에 사용된 각각의 1차 항체는 α-Tubulin(sc-8035, Santa Cruz Biotech., CA, USA), AQP1(sc-20810, Santa Cruz Biotech., CA, USA), AQP3(sc-20811, Santa Cruz Biotech., CA, USA), AQP5(sc-28628, Santa Cruz Biotech., CA, USA)를 overnight 반응(1:200, 4℃)하고 TBS-T(0.05% Tween 20)로 4회 세척한 후, goat anti-rabbit or mouse IgG-HRP conjugated antibody(Bio-Rad laboratory)를 1:3000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 4회 세척 후 membrane을 ECL법을 이용해 화상 이미지 분석시스템(Fusion-Solo, Vilber Lourmat, France)으로 촬영 후 분석하였다.

3. 자료분석

통계적 분석은 IBM SPSS Statistics 23.0 for windows를 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였으며, 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 적용하였다. 각 군간 차이를 검증하기 위하여 Kruskal-Wallis 검증(Kruskal Wallis test)을 실시하였고, 통계적 유의수준은 p<0.05로 실시하였다.

 

III. 결 과

1. 새끼생쥐의 체중변화

출산 후 3일째부터 14일째까지 매일 새끼생쥐의 무게를 측정한 결과 L600G군의 체중이 가장 많이 증가하였고, 400G-L400G군, L400G군, LH2O군 순이었다. 평균적으로 증가한 양은 LH2O군 4.265±0.545 g에 비해 L400G군 4.429±0.529 g, L600G군 4.721±0.298 g, 400G-L400G군 4.630±0.698 g으로 나타나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 1).

Fig. 1.Average litter weight from postpartum day 3 to day 14 in four groups. [LH2O (control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G]

2. 수유량과 총수유량

출산 후 3일째부터 14일째까지 관찰기간 동안의 일일 수유량은 실험군이 대조군에 비하여 더 많은 경향이 있었으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 2). LH2O군 5.136±0.550 g에 비해, L600G군 5.397±0.942 g, L400G군 5.335±1.001 g, 400G-L400G군 5.173±1.148 g 순으로 더 많은 경향을 보였으나, 통계적 유의성은 없었다(Fig. 3).

Fig. 2.Milk production from postpartum day 3 to day 14 in four groups. [LH2O (control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G]

Fig. 3.Quantification of total accumulated milk production from postpartum day 3 to day 14 in four groups. [LH2O (control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G] The amount of daily milk production from postpartum day 3 to day 14 measured once a day. Total amount of milk production during experimental period was added.

3. 혈청 내 prolactin 농도

실험 종료 후 혈청 내 prolactin 농도를 관찰한 결과 임신하지 않은 virgin군은 566.8±12.2 pg/mL이었으나 대조군인 LH2O군은 6278.8± 214.1 pg/mL로서 유의성 있게(p<0.001) 증가하였다. BHT를 투여한 실험군인 L400G군은 15184.5±433.1 pg/mL, L600G군은 35151.5±1162.5 pg/mL, 400G-L400G군은 27423.7±490.2 pg/mL으로 LH2O군에 비하여 유의성 있게(p<0.001)증가하였다(Fig. 4).

Fig. 4.Effects on the serum prolactin concentration after administration of BHT in prepartum or postpartum mice. Each data represents a Mean SD (n=5). Values are significantly different from Virgin group (###) and control group (***); ###p<0.001; ***p<0.001.

4. 광학현미경적 관찰소견

실험 종료 후 생쥐를 희생시켜 유선조직의 광학현미경 구조를 H&E 염색하여 관찰한 결과 대조군에 비해 BHT를 투여한 모든 실험군에서 유선조직의 유선포세포 및 사이질조직이 발달한 것을 관찰할 수 있었다. 유선조직의 발달 정도는 L600G군, L400G군 및 400G-L400G군 순서대로 발달하였다(Fig. 5). 또한 특수한 염색인 Masson’s trichrome 염색을 시행하여 관찰한 결과 L600G군, L400G군 및 400G-L400G군 순서대로 유선포세포가 발달하였다(Fig. 6).

Fig. 5.Microscopic observation of lactating mammary tissue of mice in four groups. [LH2O (control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G] H&E Stain, ×200. Arrow, mammary tissue. Differentiating mammary epithelial cells were found in L400G group, L600G group and 400G-L400G group.

Fig. 6.Microscopic observation of lactating mammary tissue of mice in four groups. [LH2O (Control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G]. Masson’s trichrome stain, ×100. Arrow, mammary tissue.

5. 유선조직 prolactin receptor의 면역 조직화학적 염색 소견

실험 종료 후 생쥐를 희생시켜 유선조직 내 prolactin receptor에 대한 면역조직화 학염색법을 시행하여 관찰한 결과 대조군에 비해 BHT를 투여한 모든 실험군에서 유선조직의 일부 유선포세포, 유선포 사이질세포와 사이질조직 및 혈관 등에 강한 면역반응을 나타내었다(Fig. 7, 8).

Fig. 7.Immunostaining of lactating mammary tissue of mice for prolactin receptor in four groups. [LH2O (Control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G]. ×100. Arrow, interlobular septa of alveolus in mammary tissue Prolactin receptor were detected in some alveolar epithelia, capillaries, venules and interlobular septal cells in mammary tissue.

Fig. 8.Immunostaining of lactating mammary tissue of mice for prolactin receptor in four groups. [LH2O (Control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G]. × 400. Arrow, interstitial tissue of alveolus in mammary tissue.

6. 유선조직 AQP1, AQP3, AQP5의 면역조직화학적 염색 소견

실험 종료 후 생쥐를 희생시켜 유선조직의 AQP1, AQP3, AQP5에 대한 면역 조직화학염색법을 시행하여 관찰하였다.

AQP1은 대조군에 비해 BHT를 투여한 모든 실험군에서 유선조직의 유선포 사이질조직과 도관주위조직에 위치한 모세혈관과 세정맥 등에 강한 면역반응을 나타내었다(Fig. 9).

Fig. 9.Immunostaining of lactating mammary tissue of mice for AQP1 in four groups. [LH2O (Control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G]. ×200. Lactating mice with or without BHT treatment at postpartum day 14 or from prepartum day 7 to postpartum day 14. The tissue sections were stained with rabbit anti- AQP1 antibody. AQP1 was found predominantly around capillaries and venules in the differentiating mammary gland. Arrow, capillary and venule of interlobular septa of alveolus in mammary tissue.

AQP3는 대조군에 비해 BHT를 투여한 모든 실험군에서 유선조직의 일부 유선포세포와 사이질조직에 강한 면역반응을 나타내었다(Fig. 10). 실험군간 비교하면 L600G군, L400G군 및 400G-L400G군 순서대로 AQP3에 대한 면역염색 반응이 강하게 염색되었다(Fig. 10).

Fig. 10.Immunostaining of lactating mammary tissue of mice for AQP3 in four groups. [LH2O (control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G]. ×200. Lactating mice with or without BHT treatment at postpartum day 14 or from prepartum day 7 to postpartum day 14. The tissue sections were stained with rabbit anti- AQP3 antibody. AQP3 was detected in some secretory alveolar epithelia and intralobular and interlobular duct epithelial cells. Immunohistochemical density of AQP3 was increased markedly in lactating mice in L600G group.

AQP5는 대조군에 비해 BHT를 투여한 모든 실험군에서 유선조직의 일부 유선포세포와 사이질조직에 강한 면역반응을 나타내었다(Fig. 11). 실험군간 비교하면 L400G군, L600G군 및 400G-L400G군 순서대로 AQP5에 대한 면역염색 반응이 강하게 염색되었다(Fig. 11).

Fig. 11.Immunostaining of lactating mammary tissue of mice for AQP5 in four groups. [LH2O (control) group, Lactating+H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating +600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating +400G]. × 200. Lactating mice with or without BHT treatment at postpartum day 14 or from prepartum day 7 to postpartum day 14. AQP5 was detected in some secretory alveolar epithelia and intralobular and interlobular duct epithelial cells. Immunohistochemical density of AQP5 was increased markedly in lactating mice in L400G group, L600G group and 400G-L400G group.

7. 유선조직 AQP1, AQP3, AQP5의 western blot 소견

실험 종료 후 희생시킨 생쥐의 유선조직을 단백질 정량하여 AQP1, AQP3, AQP5에 대한 western blot을 시행하였다.

AQP1의 발현은 virgin군에 비하여 대조군에서 약간 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 대조군인 LH2O군에 비하여 BHT를 투여한 모든 실험군에서 증가하였으며, 실험군간 비교하면 L400G, L600G 및 400G-L400G군 순서대로 AQP1의 발현이 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 12, 13).

Fig. 12.Western blots of AQPs (AQP1, AQP3, AQP5) in lactating mammary tissue of mice in five groups. [Virgin group; LH2O (Control) group, Lactating +H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating+600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating+400G]. Protein levels of AQP1 and AQP5 in all the experimental groups were upregulated in lactating mice compared to LH2O (Control) group. Protein levels of AQP3 in L600G group and 400G-L400G group were upregulated in lactating mice compared to LH2O (Control) group.

Fig. 13.Quantification of AQP1 of the western blots in lactating mammary tissue of mice in five groups. [Virgin group; LH2O (Control) group, Lactating +H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating+600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating+400G].

AQP3의 발현은 virgin군에 비하여 대조군에서 증가하는 경향을 나타내었다. 대조군인 LH2O군에 비하여 BHT를 투여한 모든 실험군에서 증가하였으며, 실험군간 비교하면 L600G, 400G-L400G 및 L400G군 순서대로 AQP3의 발현이 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 12, 14).

Fig. 14.Quantification of AQP3 of the western blots in lactating mammary tissue of mice in five groups. [Virgin group; LH2O (Control) group, Lactating +H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating+600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating+400G].

AQP5의 발현은 virgin군에 비하여 대조군에서 증가하는 경향을 나타내었다. 대조군인 LH2O군에 비하여 BHT를 투여한 모든 실험군에서 증가하였으며, 실험군간 비교하면 L400G, L600G 및 400G-L400G군 순서대로 AQP5의 발현이 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 12, 15).

Fig. 15.Quantification of AQP5 of the western blots in lactating mammary tissue of mice in five groups. [Virgin group; LH2O (Control) group, Lactating +H2O; L400G group, Lactating+400G; L600G group, Lactating+600G; 400G-L400G group, 400G+Lactating+400G].

 

IV. 고 찰

모유수유는 영아의 질병 이환율을 감소시키고 원만한 인격형성을 이루게 한다. 더욱이 분만 후 산모의 자궁수축을 촉진하여 산후회복을 빠르게 하고 산욕기 우울증과 유방암 등을 예방하며 경제성 및 간편성과 더불어 환경오염 감소 등 많은 장점이 있다17). 그러나 출산 후의 많은 산모들은 스트레스, 걱정과 같은 심리적요인과 산모의 고령화, 제왕절개 등의 이유로 모유량 부족을 경험하고 있으며 이는 모유수유를 중단하게 되는 직접적인 이유가 되기도 한다2).

Gabay 등18)의 연구에 따르면 모유량 증가의 목적으로 metoclopramide, domperidone 같은 양약을 장기간 사용 시 안전성에 대한 고찰이 이루어지지 않아 사용이 제한적이기 때문에, 많은 산모들이 산후 조리의 목적이나 수유 관련 질환 치료 목적으로도 한약과 허브티 등의 보완대체의학을 활용하고 있다. 세계적으로 천연 모유촉진제에 대한 수요가 증가하고 있으며 이에 대한 수유모들의 태도는 매우 긍정적인 것으로 평가되고 있다19).

국내에서 한약의 유즙분비 촉진에 대한 실험적 연구로는 通乳湯20), 涌泉散21), 加味四物湯22), 生化湯8,23), 補虛湯7)-9) 八物湯24)등에 관한 연구가 있었다. 위 연구들에서 유즙분비량의 변화를 측정하기 위하여 지표로 사용한 것들은 새끼생쥐의 체중변화, 혈청 중 prolactin, growth hormone, cortisol 측정, 유선조직 관찰, 유즙분비 관련 유전자 측정, 유선조직에서 prolactin 및 estrogen 수용체, oxytocin에 대한 면역 조직화학염색 등의 관찰을 통한 방법이었다. 그러나 이러한 방법들은 다음과 같은 한계점을 가지고 있다. 첫째, 새끼생쥐의 체중 변화는 모유량을 직접적으로 측정하는 것이 아니며, 또한 새끼생쥐의 체중이 매우 적게 나가기 때문에 상대적으로 오류나 변수가 있을 확률이 크다. 둘째, 호르몬의 농도가 반드시 모유량과 비례하지는 않는다는 점이다. 모유생산의 개시는 내분비적으로 prolactin과 cortisol 등의 호르몬에 의해서 조절되지만, 결국 긴 기간 동안의 모유생산은 자가분비조절체계로 이행되어 유지되기 때문이다25). 셋째, 유선조직의 관찰은 조직학적으로 부분적인 세포를 관찰하여 육안적인 구별에 의지해야하므로 한계가 있을 수밖에 없다. 따라서 지금까지의 연구를 보완하여 변화하는 모유량을 보다 객관적으로 측정할 수 있는 추가 지표 선정의 필요성을 인식하였다. 또한 모유수유에 도움이 되는 많은 한약처방 중에서 임상적으로 산후에 다용하는 補虛湯을 기본으로 하여 모유수유에 도움이 되는 약재를 가미한 補虛湯加減에 대해 연구하고자 하였다.

補虛湯은 李5)에 의해서 ≪醫學入門≫에 수록된 처방이나 원래는 ≪丹溪心法≫에서 기원하고 있는 처방이다. 朱4)는 ≪丹溪心法⋅卷五⋅産後九十二≫에서 ‘産後無得令虛, 當大補氣血爲先, 雖有雜證, 以末治之.’라 하여 補虛方을 제시하였는데, 李가 朱의 처방에서 茯苓을 去하고, 黃芪를 加하여 補虛湯이라 명명하였다. 이러한 補虛湯은 産後의 氣血不足으로 인한 각종 虛證에 사용할 수 있는 처방으로 후세의 가들에 의하여 다용되어 왔다6).

이 연구에 사용된 補虛湯加減은 우석대학교부속한방병원 여성의학센터에서 처방되는 연조엑스 제제로 함소아원외탕전원에서 제조되었으며, 補虛湯에서 人蔘을 去하고 補腎益精 養血潤燥하는 海蔘과 通氣下乳의 효과가 있는 木通, 通草, 王不留行을 加味한 처방이다.

補虛湯이 유즙분비에 미치는 영향에 관한 연구로 車7)는 補虛湯이 혈중 prolactin 수치를 증가시키지 못하여 유즙분비에 영향을 미치지 못하는 것으로 생각된다고 결론짓고 있으며, 朴8)은 補虛湯 복용군의 혈중 prolactin과 oxytocin이 유의성 있는 증가를 보이지 못한다고 보고하고 있다. 그러나 모유생산을 좌우하는 것은 혈중 프로락틴 농도가 아니라 프로락틴 수용체의 개수라는 것이 정설이며26), 초기 모유 분비에 프로락틴이 필요하긴 하지만, 그 농도와 모유 생산량이 비례하지는 않는다25). 이후에 李 등9)은 補虛湯이 생쥐의 유선조직을 활성화 시키고 prolactin receptor에 대한 면역반응을 높임으로써 유즙분비를 촉진시키는 효과가 있을 것이라고 결론을 내리고 있으나, 조직학적 소견은 육안적으로 차이를 구분하여야 하고 정량화된 객관적 수치로 나타내기가 힘들기 때문에 한계가 있을 수밖에 없다. 이에 증가하는 모유량을 반영할 수 있는 결과지표로서 최근 그 존재가 밝혀져 활발한 연구가 이루어지고 있는 AQP를 이번 연구의 중요한 지표로 추가 선정하고, 한의학적 기전의 현대 의학적 재해석을 위하여 이번 연구를 계획하였다.

AQP는 세포막에서 단단한 결합으로 수분의 이동을 위한 통로를 만들며, 세포막의 수분 투과성을 증가시키는데 중요한 역할을 한다28,29). 유선에서 발견되는 AQP는 아직 그 기전이 명확히 밝혀지지는 않았으나, 모유 분비와 관련이 있는 것으로 추정되고 있으며11-4), 최근 연구에서 AQP1과 AQP3는 인간의 유선조직에서도 발견되었다30,31).

유선조직에서 AQP에 대한 실험적 연구로 Liu 등14)은 한약을 먹인 생쥐에서 모유 생산과 AQP의 발현이 대조군에 비하여 증가함을 발견하였다. 또 태생 곤충인 체체파리의 AQP 발현 변화에 대한 연구32)에서, 수유기 동안에는 AQP의 발현이 증가하며, 발현의 감소는 결과적으로 모유 농도를 증가시켜 물의 투과를 방해한다는 사실을 입증하였다. 이러한 기전으로 증가한 AQP는 모유의 분비를 촉진시키고, 결과적으로 FIL(feedback inhibitor of lactation)의 농도를 비롯한 모유의 농도를 감소시키면서 자가분비조절체계에 영향을 미쳐 모유량을 조절할 것으로 사료된다. 이러한 이유로 변화하는 모유량을 반영할 수 있는 지표로써 AQP를 추가 선정하였다.

이번 실험결과 새끼생쥐의 체중변화는 L600G군에서 가장 많은 증가를 보였고, 대조군에 비하여 모든 실험군의 무게가 증가하였으나 통계적인 유의성은 없었다. 관찰기간 동안의 일일 수유량은 실험군이 대조군에 비하여 더 많이 증가하는 경향이 있었고, 총수유량의 평균값에서도 대조군인 LH2O군에 비하여 모든 실험군이 더 높은 경향을 보였으나, 일일 수유량과 총수유량 모두 통계적 유의성은 없는 것으로 나타났다. 이는 새끼생쥐의 기본 체중 및 변화량이 매우 적어 오차가 발생하기 쉽고, 표본수도 적기 때문인 것으로 보인다.

혈청 내 prolactin 농도 관찰에서는 대조군인 LH2O군은 6278.8±214.1 pg/mL으로 측정된 것과 비교하여 모든 실험군에서 유의성 있게 증가한 것으로 나타났는데, 특히 L600G군은 35151.5±1162.5 pg/mL 으로 측정되어 L600G군의 prolactin 혈청농도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이는 실험군에서 혈중 prolactin의 수치가 높아져 초기 모유분비에서 유즙생성 촉진 가능성이 커짐을 의미한다.

실험종료 후 유선조직의 광학현미경적 관찰 소견에서 모든 실험군의 유선조직은 대조군에 비하여 발달하였고, 발달정도는 L600G, L400G 및 400G-L400G군 순서대로 발달한 것으로 나타났다. 유선조직의 prolactin receptor에 대한 면역조직화학적 염색에서도 대조군에 비하여 모든 실험군의 유선조직의 유선포세포, 유선포 사이질세포와 사이질조직 및 혈관등에 강한 면역반응이 나타나는 것을 볼수 있었다. 이는 실험군에서 유즙분비가 촉진되고 있음을 의미한다.

유선조직의 AQP에 대한 면역조직화학적 염색 소견에서 AQP1, AQP3, AQP5는 대조군에 비해 모든 실험군에서 강한 면역 반응을 나타내었다. 이는 補虛湯加減이 유선조직 AQP1, AQP3, AQP5의 발현을 촉진시킬 수 있음을 시사한다

AQP1은 유선포의 사이질조직과 도관 주위조직에 위치한 모세혈관, 세정맥 등에 강한 면역반응을, AQP3와 AQP5는 유선포세포와 사이질조직에서 강한 면역반응을 나타내었다. 이러한 결과는 이전의 설치류와 소를 이용한 유선의 AQP의 발현위치에 대한 연구결과와 유사하다11-4). 또한 Liu 등14)의 결과에서처럼 AQP1, AQP3는 대부분 유선세포의 세포질에서 강한 면역반응을 보인 반면, AQP5는 유선포세포와 사이질조직의 세포질뿐만 아니라 유선세포의 세포핵에서도 강하게 염색되었다. 그리고 대조군보다 실험군, 그 중에서도 L400G군의 세포질 및 사이질 조직에서 더욱 진하게 염색된 것을 관찰할 수 있었다.

수유기의 유선은 임신상태에서보다 더욱 발달하여 소엽의 대부분이 실질성분으로 채워지고, 그에 따라 소엽속 버팀질과 소엽사이중격이 현저히 줄어드는데, 특히 유선포 주위의 결합조직에는 모세혈관망이 잘 발달해 있고, B림프구와 형질세포들이 다수 존재하게 된다33). 수유기에는 모세혈관망이 발달하기 때문에 AQP1의 발현은 virgin군에 비하여 대조군에서 더욱 강한 면역반응을 나타낸 것으로 보이며, 그러므로 대조군에 비하여 실험군에서 AQP1이 강한 면역 반응을 보이는 것은 실험군의 유선조직 모세혈관망이 더욱 발달하여 유즙분비를 촉진할 수 있음을 의미한다.

AQP1, AQP3, AQP5에 대한 western blot을 시행하여 단백질 정량분석한 결과 AQP1은 L400G, L600G 및 400G-L400G군 순서대로, AQP3는 L600G, 400G-L400G 및 L400G군 순서대로, AQP5는 L400G, L600G 및 400G-L400G군 순서대로 발현이 증가하는 경향을 나타내었다. Western blotting 결과에서 AQP3는 virgin군에서 거의 발견되지 않는 반면(0.0159), LH2O군에서 0.0559, L400G군에서 0.1398, L600G군에서 0.1906으로 증가하여, 가장 많은 비율로 증가하였다. 이러한 결과는 virgin군이나 임신 중에 비하여 수유기에 AQP3의 발현이 확연하게 증가한다는 기존의 연구들과 유사하다13,14). AQP3는 모유의 분비에 있어서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 수유를 하는 동안에 유선조직에서는 상당한 양의 중성지방이 합성되고 분비되는데34), 이때 AQP3가 물과 더불어 글리세롤 운송에 중요한 단백질로 작용하기 때문이다. AQP3뿐만 아니라 AQP1과 AQP5도 대조군에 비하여 모든 실험군에서 증가하는 것으로 나타났는데, 다만 새끼생쥐의 체중변화나 수유량, 혈청 내 prolactin 농도, 광학현미경적 관찰 결과와는 다르게 투여량에 비례하여 증가하지는 않았다.

Liu 등14)의 연구와 이번 연구에서 사용된 한약처방 중 동일 구성 한약재는 通草, 王不留行, 黃芪이다. 특히, 木通, 通草, 王不留行은 利水通氣의 효능을 가지고 있으면서 通乳효과가 있다고 알려져 있어 산후에 다용된다. 흔히 hydrochlorothiazide, furosemide 등 성분의 이뇨제는 단순히 소변량을 증가시켜 체내 수분을 줄이고, 심하면 탈수 상태를 초래하며, 장기간 사용할 경우 모유생산을 줄이게 된다고 알려져 있다35). 따라서 이뇨제의 이뇨작용과 한약의 이수작용간에는 기전의 차이가 있음을 추론할 수 있다. 최근 일본을 중심으로 五苓散의 AQP를 매개로 한 뇌와 신장의 수분대사조절 메커니즘에 대한 연구가 발표되고 있는데, 그 중 한 연구에 따르면 五苓散은 AQP를 매개하여 체내 수분대사를 조절하고 생체 내 항상성을 유지하며 전해질이상 개선효과와 신장보호작용을 함께 가지고 있어, 일반적인 이뇨제와는 다른 기전으로 수분대사를 조절한다는 것이 밝혀졌다36,37). 五苓散이 AQP를 조절하여 인체의 수분 평형을 조절하듯, 補虛湯加減이 모유생산을 촉진하는 기전은 단순한 수분의 체외배출이 아니라 AQP의 발현과 연관되어 있을 것으로 사료된다. 그러나 補虛湯加減의 구성약물 중에서 어느 약물이 이러한 효과와 관련이 클 것인지에 대해서는 향후에 개별약물에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

이상의 실험결과 補虛湯加減은 출산 후 생쥐의 모유량을 증가시키고, prolactin의 혈중 내 농도를 높이며, 유선조직을 발달시키고, AQP의 발현을 증가시키는 경향이 있어서 유즙분비를 촉진함을 알수 있었다. 하지만 AQP에 대해서는 補虛湯加減의 투여량에 따른 효과가 일관성을 보이지 않아 추후에 한약 복용과 AQP의 연관성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

최근 AQP와 모유 분비의 관련성에 대한 연구들이 지속적으로 이루어지고 있으나, 그 기전이 명확히 밝혀져 있지는 않다. 모유촉진을 목적으로 임상에서 다용되는 한약처방의 AQP관련 실험연구 또한 Liu 등14)의 연구가 유일하였다. 이번 연구에서는 출산 일주일 전부터 한약을 복용한 군을 설정을 하였는데, 출산 후부터 복용한 군과 비교하여 더 큰 유즙촉진효과를 나타내지는 않았다. 유방내 유선과 연관조직 발달을 포함하는 유방발달은 태아기, 사춘기, 성년기를 통해 일어난다. 임신에서 수유에 이르기까지의 유방변화의 단계는 세포분열과 분화가 일어나는 유방발달, 분비세포의 기능이 활성화되고 임신 2/3분기부터 초유가 만들어지면서 저장되는 유즙생성 I 기, 태반만출 후 완전한 모유공급 체계가 확립되는 유즙생성 II 기, 성숙모유의 생성과 공급단계, 즉 젖합성 단계로 불리는 유즙생성 III 기로 구분된다. 모유생산은 태반만출 전 호르몬에 의해 조절 받으며 유즙생성 II 기 동안 자가분비 조절체계로 변화된다. 모유에는 FIL(feedback inhibitor of lactation)이라고 하는 작은 유청단백질이 들어있는데, FIL은 유방이 차 있을때 모유 합성을 느리게 한다. 반대로 유방이 비워지고 FIL의 농도가 낮아지면 모유 합성 속도가 올라간다. 모유 생성을 지속하게 하는 능력은 시상하부와 연관된 자가분비기전에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다25). Nazemi 등13)은 유즙생성 II 기의 AQP 변화를 살펴보기 위한 연구를 진행하여, 임신기와 수유기에 유선조직 내 AQP1, AQP3, AQP5의 조절과 기능에 발달상 변화가 있음을 밝혀내었다. 즉, 임신 중 생쥐에게 강제로 장기간 약물을 공급하게 된 것에 대한 스트레스 요인으로 모유촉진효과를 나타내지 못했을 가능성 외에 한약복용의 시점에 따른 모유분비의 기전의 영향에 대한 가능성을 제시해 볼 수 있다. 그러므로 이러한 결과는 사람이 복용하였을 때 나타나는 효과와는 다소 차이가 있을 것으로 생각되며, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.

모유촉진 효과를 입증하는 다양한 방법의 연구들이 이루어지고 있음에도 불구하고 동물실험으로 이루어질 수밖에 없는 한계와 더불어 정량적 지표를 찾기 어려운 점이 있다. 기존지표의 한계와 더불어 최근에서야 연구되어지고 있는 AQP지표 또한 다양한 연구설계를 통한 해석이 필요할 것으로 보인다.

산후 大補氣血의 대표 처방인 補虛湯에 通氣下乳의 효과를 더한 補虛湯加減은 여러 지표 결과 상 유선조직을 발달 시키고 모유분비를 촉진함을 알 수 있었다. 향후 補虛湯加減의 개별약재에 대한 기전연구와 산모를 대상으로 한 임상연구가 이루어진다면 산후 유즙부족에 더 많은 임상적 가치와 활용도를 가질 것으로 판단된다.

 

V. 결 론

補虛湯에서 人蔘을 去하고 海蔘, 木通, 通草, 王不留行을 加味한 補虛湯加減을 복용시킨 후 유즙분비와 유즙분비 관련인자에 미치는 영향을 알아보기 위하여 분만 전후의 생쥐에 각각 용량과 기간을 달리하여 補虛湯加減을 투여한 후, 새끼생쥐의 체중, 수유량 및 prolactin 호르몬 농도 측정, 유선의 조직학적 관찰, 면역조직화학적 염색, 유선조직의 단백질 분리 및 western blotting 검사를 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 새끼생쥐의 체중변화는 L600G군에서 가장 많은 증가를 보였고, 대조군에 비하여 모든 실험군의 무게가 증가하였으나 통계적인 유의성은 없었다.

2. 수유기간 내 총수유량은 L600G군이 가장 많았으며, L400G, 400G-L400G, LH2O군 순서로 총수유량이 많았던 것으로 나타났다. 일일 수유량 비교에서 대조군에 비하여 실험군들의 수유량이 더 많은 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다.

3. 혈청 내 prolactin 농도는 대조군에 비하여 모든 실험군에서 유의성 있게 증가하였으며(p<0.001), L600G군의 prolactin 혈청농도가 가장 높았고, 그 다음으로 400G-L400G, L400G군의 순서였다.

4. 광학현미경적 관찰 소견에서 모든 실험군의 유선조직은 대조군에 비하여 발달하였고, 발달 정도는 L600G, L400G 및 400G-L400G군 순서대로 발달하였다.

5. 유선조직의 prolactin receptor에 대한 면역조직화학 염색반응에서는 대조군에 비하여 모든 실험군의 유선조직 내 유선포세포, 유선포 사이질세포와 사이질조직 및 혈관 등에 강한 면역반응이 나타나는 것을 볼 수 있었다.

6. 유선조직의 AQP에 대한 면역조직화학적 염색 소견에서 AQP1, AQP3, AQP5는 대조군에 비해 모든 실험군에서 강한 면역 반응을 나타내었다. AQP1은 유선포의 사이질조직과 도관주위 조직에 위치한 모세혈관과 세정맥 등에서 관찰되었고, AQP3와 AQP5는 유선포세포와 사이질조직에서 강한 면역반응을 나타내었다.

7. Western blot 소견에서 AQP1의 발현은 L400G, L600G 및 400G-L400G군 순서대로, AQP3의 발현은 L600G, 400G-L400G 및 L400G군 순서대로, AQP5의 발현은 L400G, L600G 및 400G-L400G군 순서대로 증가하는 경향을 나타내었다.

이상의 결과를 토대로 補虛湯加減 투여는 출산 후 생쥐의 prolactin 농도를 증가시키고, 유선조직에서 prolactin receptor 및 AQP의 발현을 증가시켜 유선조직을 발달시킴으로써 모유분비를 증가시키는 효과가 있을 것으로 사료된다.