지감초자(志甘草煮)가 4-HNE로 유도된 Apoptosis에 미치는 영향

Effects of Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix on 4-HNE-induced Apoptosis in PC-12 cell

Abstract

Objectives : The study was designed to observe the effect of Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix on 4-Hydroxynonenal (4-HNE)-induced apoptosis in PC-12 cell.Methods : A cytotoxic test on Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix (PG) was conducted and another MTT assay was conducted to observe the cytoprotective effect against 4-HNE that cause oxidative stress. In addition, in order to observe the expression of Bax, Bcl-2, Caspase-3 and TNF-α protein involved with apoptosis, western blot was conducted.Results : The groups treated with 25 ㎍, 50 ㎍ and 100 ㎍ of PG water extract had no toxicity for PC-12 cell. The groups treated with 25 ㎍, 50 ㎍ and 100 ㎍ of PG water extract showed a significant increase of cell survival rate in comparison with the control group injected by only 4-HNE. The groups treated with 25 ㎍ and 50 ㎍ of PG water extract showed a significant supression on increase of Bax protein expression in the control group. The group treated with 100 ㎍ of PG water extract showed a significant promotion on decrease of Bcl-2 protein expression in the control group. The group treated with 50 ㎍ of PG water extract showed a significant supression on increase of Caspase-3 protein expression in the control group. The group treated with 25 ㎍ of PG water extract showed a significant supression on increase of TNF-α protein expression in the control group.Conclusions : These results suggest that Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix is effective in reducing apoptosis by 4-HNE-dameged cell.

서 론

Apoptosis란 세포가 외부의 자극이나 환경 변화 등에 의해 이루어지는 계획된 세포 죽음(programmed cell death)이며 체내의 항상성을 유지하기 위한 작용이다1). Apoptosis의 이상에 의한 질환은 대표적으로 암, 후천성면역결핍증(AIDS), 신경변성 질환에 속하는 알츠하이머병과 파킨슨씨병, 허혈손상질환인 심근경색증과 뇌졸중 등이 있다2).

遠志는 원지과에 속한 다년생 초본인 원지 (polygala tenuifolia Willd.) 의 뿌리로3), 寧心安神, 祛痰開竅, 消散腫痛의 작용을 하여 神昏, 驚悸, 不眠, 健忘을 치료한다4).

遠志의 실험적 연구로 항염증 효과5), 신경세포 보호 효과6), 인지장애 개선 효과7) 등이 보고되었다.

遠志甘草煮는 포제법 중의 煮法에 따라 원지를 감초 달인물에 삶은 것으로, 이 과정을 통해 遠志가 가진 독성은 완화되고 정신 안정작용이 향상8)되므로 遠志甘草煮 또한 신경 보호효과가 있을 것으로 생각된다.

이에 저자는 遠志甘草煮의 신경 보호효과를 확인하기 위해 PC-12 cell의 손상에 의한 apoptosis 영향을 관찰하였다. Apoptosis를 촉진하는 4-Hydroxynonenal(4-HNE)를 투여하여 손상된 PC-12 cell의 세포 보호 효과를 측정하였다. 그리고 apoptosis에 관여하는 Bax, Bcl-2, Caspase-3 및 TNF-α 단백질의 발현을 western blot 분석으로 관찰한 바 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

 

재료 및 방법

1. 세포배양

본 실험에 사용한 PC-12(rat adrenal pheochromocytoma cell) 세포는 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다. 세포의 배양을 위해 10 % horse serum과 5 % fetal bovine serum, 2 % NaHCO3, 1 % penicillin/streptomycin이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 37 ℃의 온도와 5 % CO2가 포함된 공기가 공급되는 CO2 incubator에서 세포를 배양하였다.

2. 기기 및 시약

1) 기기

본 실험을 위해 사용된 기기는 Clean Bench(Nuaire, USA), CO2 Incubator (Nuaire, USA), Microplate Reader(Dynex, USA), Spectrophotometer (Implen, Germany), Water Purification (High-Q, USA), Freezing dryer(Eyela, Japan), Auto clave(Sam woo, Korea), Balance(Mettler, Switzerland), Centrifuge (Gyrozen, Korea), Sonicator (Sonics, USA), Gel Doc XR System(Bio-Rad, USA), Automatic X-RAY Film Processor(JPI, Korea) 등이다.

2) 시약

본 실험에 사용된 시약은 RPMI Medium 1640(Gibco, USA), Fetal Bovine Serum(Gibco, USA), Horse Serum(Gibco, USA), 4-Hydroxy Nonenal (Cayman, USA), MTT(Sigma, USA), Sodium Bicarbonate(Sigma, USA), Trzma Base (Sigma, USA), Sodium Chloride(Sigma, USA), Dimethyl Sulfoxide(Amresco, USA), protein assay dye reagent (Bio-Rad, USA), mouse actin antibody (Millipore, USA)와 rabbit Bax antibody (CST, USA), rabbit Bcl-2 antibody (CST, USA), rabbit Caspase-3 antibody (CST, USA), rabbit TNF-α antibody (CST, USA), ECL detection Reagent (Amersham, UK), horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody (CST, USA), nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA), Mini-PROTEANⓇ TGXTM Gel(Bio-Rad, USA), Gel Documentation (Bio-Rad, USA) 등을 구입하여 사용하였다.

3. 약물의 제조

본 실험에 사용한 遠志甘草煮(Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix, PG)는 (주)옴니허브에서 구입하였다. 遠志甘草煮 50 g 에 물 500 ㎖ 를 가하여 환류추출기에서 2시간 동안 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다. 遠志甘草煮는 8 g 의 추출물을 얻어 수율은 16 % 이었다.

4. PC-12 cell 에서 PG의 4-HNE로 자극된 세포 생존율 측정

세포 생존율을 측정하기 위해 MTT (3-[4,5–Dimethylthiazol-2-yl]-2,5–diphenyl–tetrazolium bromide) assay를 사용하였다. 이 방법은 세포의 미토콘드리아 내 효소인 succinate-dehydrogenase에 의해 MTT가 formazan으로 변하여 세포의 성장이 멈추거나 세포가 죽으면 formazan의 생성이 줄어들게 되는 것을 이용한 것이다. PG의 PC-12 세포 생존율을 측정하기 위해 96 well plate에 각 well당 2 × 104 개/㎖를 성장 배지에 seeding 하였다. 24시간 후 serum-free RPMI 1640 배지로 갈아주고 PG를 처리하지 않은 정상군(Normal)과 PG를 각각 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도로 24시간 처리한 실험군으로 나누었다. 또한 4-HNE을 투여한 실험그룹은 6개 군으로, 정상군(Normal)과 4-HNE 35 μM 을 처리한 대조군(Control), PG를 각각 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖을 24시간 처리 후 4-HNE를 35 μM 의 농도로 24시간 동한 처리한 4개의 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. MTT reagent (stock 농도 5 mg/㎖)를 96 well에 15 ㎕ 씩 넣어 37 ℃ incubator에서 2시간 동안 배양시켰다. 그 후 media를 제거하고 DMSO 100 ㎕ 를 넣은 후 70 ℃ incubator에서 10분간 녹여서 ELISA reader를 이용하여 흡광도 570 ㎚ 에서 세포의 생존율을 측정하였다.

5. Western blot 분석

세포는 차가운 PBS(pH 7.4)로 2번 씻어낸 후 원심분리기를 이용하여 1000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 그리고 세포분해용액(iNtRON Biotechnology, Korea)을 넣은 후 초음파 분쇄기로 세포를 균질화 하고 다시 원심분리기를 이용하여 20분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad의 protein assay dye reagent를 사용하여 흡광도로 측정하였다. 정량한 단백질을 Mini-PROTEANⓇ TGXTM Gel에 loading하여 분리한 다음 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 1차 항체로 mouse actin antibody (1:15,000)와 rabbit Bax antibody (1:1000), rabbit Bcl-2 antibody (1:1000), rabbit Caspase-3 antibody (1:2000), rabbit TNF-α antibody (1:1000) 를 사용하였다. 2차 항체로는 Bax, Bcl-2, Caspase-3, TNF-α용 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody를 사용하였다. Nitrocellulose membrane으로 단백질 이동을 제외하고 모든 실험은 실온에서 시행하였으며, Nitrocellulose membrane으로 단백질 이동은 4℃ 냉장고 안에서 실시하였다. 단백질 밴드 검출은 ECL detection Reagent를 사용하여 발색시켰다.

각 단백질의 발현을 비교하기 위해서 발색된 band의 밀도는 Gel Documentation의 Quantity One Analysis Software (Bio-Rad)로 측정을 하였다.

6. 통계처리

통계분석은 4-HNE와 4-HNE + PG 투여 group 간의 유의성 검증으로 Graphpad Prism(USA)으로 Student's t-test를 사용하였으며, 실험 결과는 평균 ± 평균의 표준오차[means ± standard error of the mean(SEM)]로 나타내었다. 통계적 유의성 검정은 P < 0.05로 하였다.

 

결 과

1. 遠志甘草煮가 세포 생존율에 미치는 영향

遠志甘草煮가 PC-12 cell에 독성이 있는 가를 관찰하기 위해, 세포에 遠志甘草煮물추출물을 처리하고 세포의 생존율을 측정하였다. 정상군(Normal)의 세포 생존율을 100 %로 하였다.

遠志甘草煮물추출물 25 ㎍ 주입군(LT25)에서 PC-12 cell 생존율은 125.8 ± 9.877 % 이었고, 遠志甘草煮물추출물 50 ㎍ 주입군(LT50)의 PC-12 cell 생존율은 131.0 ± 8.972 % 이며, 遠志甘草煮물추출물 100 ㎍ 주입군(LT100)의 PC-12 cell 생존율은 135.5 ± 8.510 %로 세 실험군 모두 정상군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었다. 遠志甘草煮물추출물 200 ㎍ 주입군(LT200)과 400 ㎍ 주입군(LT400)의 PC-12 cell 생존율은 각각 77.25 ± 5.721 % 와 63.50 ± 8.180% 로 정상군에 비해 오히려 감소하였다.

이상에서와 같이 遠志甘草煮물추출물 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 실험군은 세포독성이 없었다(Fig. 1).

Fig. 1.Effect of Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix (PG) on the cell viability. Normal ; only media-treated group. PG25 ; 25 ㎍/㎖ PG-treated group. PG50 ; 50 ㎍/㎖ PG-treated group. PG100 ; 100 ㎍/㎖ PG-treated group. PG200 ; 200 ㎍/㎖ PG-treated groupPG400 ; 400 ㎍/㎖ PG-treated group. Data are represented by mean ± SEM (n = 4 independent experiments).

2. 遠志甘草煮가 4-HNE 손상에 대한 세포보호 효과

遠志甘草煮가 4-HNE 손상에 의한 PC-12 cell에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 세포에 遠志甘草煮물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 생존율을 측정하였다. 정상군(Normal)의 세포 생존율을 100 % 로 하였으며 4-HNE만 투여한 대조군(Control)의 PC-12 cell 생존율은 69.42 ± 1.718 % 이었다.

遠志甘草煮물추출물 25 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT25)의 PC-12 cell 생존율은 80.25 ± 3.681 % 이었고, 遠志甘草煮물추출물 50 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT50)의 PC-12 cell 생존율은 79.58 ± 2.884% 이었으며, 遠志甘草煮물추출물 100 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT100)의 PC-12 cell 생존율은 77.39 ± 2.455%로 세 실험군 모두 대조군에 비해 유의한 증가를 나타내었다.

遠志甘草煮물추출물 200 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT200)의 PC-12 cell 생존율은 45.88 ± 7.014 %로 대조군에 비해 감소하였다(Fig. 2).

Fig 2.Effect of Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix (PG) on the cell viability with 4-HNE. Normal ; only media-treated group. Control ; 35 μM 4-HNE-treated group. PG25 ; 35 μM 4-HNE and 25 ㎍/㎖ PG-treated group. PG50 ; 35 μM 4-HNE and 50 ㎍/㎖ PG-treated group. PG100 ; 35 μM 4-HNE and 100 ㎍/㎖ PG-treated group. PG200 ; 35 μM 4-HNE and 200 ㎍/㎖ PG-treated group. The values represented as mean ± SEM (n = 4 independent experiments). Statistical significances are based on comparison to the Control group (*, p < 0.05).

3. 遠志甘草煮가 Bax 단백질 발현에 미치는 영향

遠志甘草煮가 Bax 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포에 遠志甘草煮물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 Bax 단백질 발현양을 측정하였다. 정상군(Normal)의 Bax 단백질 발현양을 100 %로 하였으며, 4-HNE만 투여한 대조군(Control)의 Bax 단백질 발현양은 111.3 ± 7.055 % 이었다.

遠志甘草煮물추출물 25 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT25)에서 Bax 단백질 발현양은 74.67 ± 8.007 % 이었고, 遠志甘草煮물추출물 50 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT50)에서 Bax 단백질 발현양은 80.33 ± 6.360 % 로 두 실험군 모두 대조군에 비해 유의한 감소를 나타내었다. 遠志甘草煮물추출물 100 ㎍ 과 4-HNE를 주입한 군(LT100)에서 Bax 단백질 발현양은 101.7 ± 14.17% 로 대조군에 비해 감소를 나타내었지만 유의성은 없었다(Fig. 3).

Fig 3.Effect of Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix (PG) on Bax expression. Normal ; only media-treated group. Control ; 35 μM 4-HNE-treated group. PG25 ; 35 μM 4-HNE and 25 ㎍/㎖ PG-treated group. PG50 ; 35 μM 4-HNE and 50 ㎍/㎖ PG-treated group. PG100 ; 35 μM 4-HNE and 100 ㎍/㎖ PG-treated group. The values represented as mean ± SEM (n = 3 independent experiments). Statistical significances are based on comparison to the Control group. (*, p < 0.05).

4. 遠志甘草煮가 Bcl-2 단백질 발현에 미치는 영향

遠志甘草煮가 Bcl-2 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포에 遠志甘草煮물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 Bcl-2 단백질 발현양을 측정하였다. 정상군(Normal)의 Bcl-2 단백질 발현양을 100% 로 하였으며, 4-HNE만 투여한 대조군(Control)의 Bcl-2 단백질 발현양은 35.02 ± 7.813 % 이었다.

遠志甘草煮물추출물 25 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT25)에서 Bcl-2 단백질 발현양은 49.59 ± 10.60 % 이었고, 遠志甘草煮물추출물 50 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT50)에서 Bcl-2 단백질 발현양은 56.58 ± 5.260 % 이었으며, 遠志甘草煮물추출물 100 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT100)에서 Bcl-2 단백질 발현양은 87.60 ± 5.901 %로 세 실험군 모두 대조군에 비해 증가했으며, 遠志甘草煮물추출물 100 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT100)만 유의성을 나타내었다(Fig. 4).

Fig 4.Effect of Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix (PG) on Bcl-2 expression. Normal ; only media-treated group. Control ; 35 μM 4-HNE-treated group. PG25 ; 35 μM 4-HNE and 25 ㎍/㎖ PG-treated group. PG50 ; 35 μM 4-HNE and 50 ㎍ /㎖ PG-treated group. PG100 ; 35 μM 4-HNE and 100 ㎍/㎖ PG-treated group. The values represented as mean ± SEM (n = 3 independent experiments). Statistical significances are based on comparison to the Control group (**, p < 0.01).

5. 遠志甘草煮가 Caspase-3 단백질 발현에 미치는 영향

遠志甘草煮가 Caspase-3 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포에 遠志甘草煮물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 Caspase-3 단백질 발현양을 측정하였다. 정상군(Normal)의 Caspase-3 단백질 발현양을 100 %로 하였으며, 4-HNE만 투여한 대조군(Control)의 Caspase-3 단백질 발현양은 161.3 ± 18.11% 이었다.

遠志甘草煮물추출물 25 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT25)에서 Caspase-3 단백질 발현양은 123.7 ± 14.52 % 이었고, 遠志甘草煮물추출물 50 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT50)에서 Caspase-3 단백질 발현양은 101.3 ± 8.969% 이었으며, 遠志甘草煮물추출물 100 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT100)에서 Caspase-3 단백질 발현양은 130.7 ± 13.86 % 로 세 실험군 모두 대조군에 비해 감소했으며, 遠志甘草煮물추출물 50 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT50)만 유의성을 나타내었다(Fig. 5).

Fig 5.Effect of Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix (PG) on Caspase-3 expression. Normal ; only media-treated group. Control ; 35 μM 4-HNE-treated group. PG25 ; 35 μM 4-HNE and 25 ㎍/㎖ PG-treated group. PG50 ; 35 μM 4-HNE and 50 ㎍ /㎖ PG-treated group. PG100 ; 35 μM 4-HNE and 100 ㎍/㎖ PG-treated group. The values represented as mean ± SEM (n = 3 independent experiments). Statistical significances are based on comparison to the Control group (*, p < 0.05).

6. 遠志甘草煮가 TNF-α 단백질 발현에 미치는 영향

志甘草煮가 TNF-α 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포에 遠志甘草煮물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 TNF-α 단백질 발현양을 측정하였다. 정상군(Normal)의 TNF-α 단백질 발현양을 100% 로 하였으며, 4-HNE만 투여한 대조군(Control)의 TNF-α 단백질 발현양은 151.3 ± 8.963% 이었다.

遠志甘草煮물추출물 25 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT25)에서 TNF-α 단백질 발현양은 107.3 ± 11.35 % 이었고, 遠志甘草煮물추출물 50 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT50)에서 TNF-α 단백질 발현양은 100.0 ± 16.77 % 이었으며, 遠志甘草煮물추출물 100 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT100)에서 TNF-α 단백질 발현양은 121.0 ± 14.47 % 로 세 실험군 모두 대조군에 비해 감소했으며, 遠志甘草煮물추출물 25 ㎍과 4-HNE를 주입한 군(LT25)만 유의성을 나타내었다(Fig. 6).

Fig 6.Effect of Polygalae Radix Preparata Cum Glycyrrhizae Radix (PG) on TNF-α expression. Normal ; only media-treated group. Control ; 35 μM 4-HNE-treated group. PG25 ; 35 μM 4-HNE and 25 ㎍/㎖ PG-treated group. PG50 ; 35 μM 4-HNE and 50 ㎍ /㎖ PG-treated group. PG100 ; 35 μM 4-HNE and 100 ㎍/㎖ PG-treated group. The values represented as mean ± SEM (n = 3 independent experiments). Statistical significances are based on comparison to the Control group (*, p < 0.05).

 

고 찰

生遠志는 去痰開竅작용이 비교적 강하지만, 內服하면 쉽게 惡心嘔吐가 일어날 수 있다. 遠志甘草煮는 甘草水를 사용하여 咽喉의 점막에 대한 자극성이 완화되고 안으로는 安神益智의 효능을 증강시켜서, 주로 心神不安, 不眠, 健忘, 驚悸怔忡 등의 병증이 나타나는 경우에 많이 응용한다8,9).

Apoptosis는 세포가 죽을 때 사전에 미리 준비된 상황에서 사망프로그램을 가동시키면서 능동적으로 죽음을 맞이한다는 개념이다. 세포의 괴사(necrosis)를 수동적인 사망이라 한다면 apoptosis는 능동적인 자연사로서 자발적인 사망 기전이다10).

Apoptotic pathway는 death receptor pathway (extrinsic pathway)와 mitochondrial pathway (intrinsic pathway) 2가지로 대별된다. 그 중 미토콘드리아를 경유하는 apoptosis 과정은 미토콘드리아의 막의 침투성의 변화, 막 전위의 파괴, 막에 존재하는 침투막의 생성 및 세포독성에 관련된 단백질의 세포질로의 방출을 통해 caspase 활성을 총괄한다11). 이 때, 미토콘드리아 막 침투성은 Bcl-2 family를 통하여 주로 조절된다. Bcl-2 family protein은 Bcl-2와 Bcl-XL와 같이 apoptosis를 억제하는 anti-apoptotic members와 Bax와 Bak 같이 apoptosis를 유도하는 pro-apoptotic members가 있다12).

Apoptosis는 생명체에서 매우 중요한 위치를 차지하므로, 여러 가지 요인으로 인해 적절히 조절되지 못할 경우 많은 질환의 원인이 되기도 한다. 특히 apoptosis의 이상 증가에 의한 질환에 속하는 알츠하이머병, 심근경색증, 뇌졸중2) 등에 대해서는 遠志의 精神 安定과 祛痰 작용이 높아진 遠志甘草煮가 유의한 효능이 있을 것으로 판단되어 본 연구를 통해 遠志甘草煮가 세포 손상에 의한 apoptosis에 미치는 영향을 관찰하였다.

遠志甘草煮에 대한 세포독성 검사를 하고 산화스트레스를 일으키는 4-HNE에 대한 세포보호 효과를 관찰하기 위해 MTT assay를 하였으며, wetern blot을 실시하여 Bax, Bcl-2, Caspase-3 및 TNF-α 단백질 발현을 관찰하였다.

신경세포 독성 연구에 많이 사용되고 있는 PC-12 cell에서 遠志甘草煮의 세포 생존율을 측정한 결과 遠志甘草煮물추출물 25 ㎍, 50 ㎍, 100 ㎍ 주입군에서 세포독성이 없었다.

4-HNE는 apoptotic 및 necrotic 세포 죽음을 유도하는 것으로 알려져 있다. 4-HNE의 이런 유도 수준은 세포 증식, 분화 및 세포주기 조절, 산화 스트레스 그리고 하류 신호 단백질과 관련된 유전자 변화에 의한 apoptosis에 영향을 미치며 PC-12 cell에서 apoptosis의 실행에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다13).

遠志甘草煮가 4-HNE에 의한 PC-12 cell 손상에 미치는 영향을 관찰한 결과 遠志甘草煮물추출물 25 ㎍, 50 ㎍, 100 ㎍을 주입한 실험군에서 대조군에 비해 유의한 증가를 나타내 세포보호 효과가 있었다.

Apoptosis의 intrinsic pathway에서는 주로 산화성 스트레스에 의해 비특이적 막투과성이 증가되고, 미토콘드리아 막전위가 점진적으로 감소하는 특징적 변화가 나타난다14). 이 때 미토콘드리아의 막간격에 존재하는 호흡연쇄 구성요소인 cytochrome c가 세포질 내로 유출되는데, pro-apoptotic group인 Bax는 세포질에서 미토콘드리아로 이동하여 cytochrome c의 유출을 유도하고15), 미토콘드리아에 위치한 anti-apoptotic group인 Bcl-2에 의해 유출이 억제되기도 한다16).

遠志甘草煮가 proapoptosis 인자인 Bax에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포의 Bax 단백질 발현양을 측정한 결과 遠志甘草煮물추출물 25 ㎍과 50 ㎍을 주입한 실험군에서 유의한 감소를 나타내었다.

遠志甘草煮가 antiapoptosis 인자인 Bcl-2에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포의 Bcl-2 단백질 발현양을 측정한 결과 遠志甘草煮물추출물 100 ㎍을 주입한 실험군은 유의한 증가를 나타내었다.

Caspase는 apoptosis에서 관찰되는 대부분의 형태학적 변화를 초래하며 일종의 행동대장과 같은 역할을 한다. intrinsic pathway에서는 미토콘드리아에서 Bcl-2 family의 조절 하에 배출된 cytochrome c가 개시자 caspase인 caspase-9을 활성화시키고 이차적으로 caspase-3와 같은 작동자 caspase를 활성화시켜 형태학적 특징을 초래한다. Extrinsic pathway에 서는 TNF-α와 Fas regand 등이 사멸 신호를 받은 후 각각 의 사멸 수용체와 결합하고, 그 결과로 caspase-8/10이 활성화되어 이차적으로 작동자 caspase가 활성화된다17).

遠志甘草煮가 proapoptosis 인자인 Caspase-3에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포의 Caspase-3 단백질 발현양을 측정한 결과 遠志甘草煮물추출물 50 ㎍을 주입한 실험군은 유의한 감소를 나타내었다.

TNF-α는 TNFR와 결합 후 분리되어 나간 FADD가 death-inducing signaling complex (DISC) 활성을 통해 procaspase 8을 자극하고, 활성화된 caspase-8은 caspase-9를 거치거나 혹은 caspase-3/7을 연속적으로 자극하여 apoptosis를 실행한다18).

遠志甘草煮가 proapoptosis 인자인 TNF-α에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포의 TNF-α 단백질 발현양을 측정한 결과 遠志甘草煮물추출물 25 ㎍ 실험군은 유의한 감소를 나타내었다.

이상의 결과를 종합해 보면 遠志甘草煮는 세포 손상에 대해 apoptosis를 유도하는 Bax, Caspase-3 및 TNF-α는 감소시키고, apoptosis를 억제하는 Bcl-2는 증가시킴으로써, apoptosis의 촉진을 억제하는 작용을 한다고 판단된다.

 

결 론

본 연구에서는 遠志甘草煮가 apoptosis에 미치는 영향을 연구하였다. 遠志甘草煮의 세포독성 검사와 4-HNE에 대한 세포보호 효과를 관찰하였다. 또한 apoptosis에 관여하는 Bax, Bcl-2, Caspase-3 및 TNF-α 단백질의 발현을 관찰한 결과 다음과 같다.

이상의 결과들로 보아 遠志甘草煮가 세포 손상에 의한 apoptosis를 억제하는 효능이 있는 것으로 생각된다.