우슬과 골쇄보의 추출물이 항산화 활성 및 항산화 효소 대사에 미치는 효과

Effect of Achyranthis Radix and Drynariae Rhizoma Extracts on Antioxidant Activity and Antioxidant Enzymes

Abstract

본 연구는 우슬과 골쇄보 활용하여 in vitro와 in vivo에 대한 실험으로 진행 되었다. 이 두 가지 약용작물을 추출하고 골다공증을 예방하는 능력을 연구하였다. 연구재료로 사용 된 시료는 증류수를 사용하여 추출 후 동결건조 하였다. 시료는 다시 다이메틸설폭사이드에 녹여서 사용 하였다. in vitro실험의 스텐다드 프로토콜에 맞추어 DPPH 라디칼 소거능, 환원력, 총항산화력, SOD 유사활성 그리고 Fe²⁺chelate활성을 측정 하였다. In vivo동물 실험에서는 난소를 제거한 스프레그다우리 쥐를 4개의 식이요법그룹으로 무작위로 나누었다. SHAM: 모의처치 대조군, OVX: 난소를 제거한 후 일반 식이를 먹인 쥐, OVX-AR: 난소를 제거한 후 우슬을 먹인 쥐, OVX- DR; 난소를 제거한 후 골쇄보를 먹인 쥐, 사용하였으며 그리고 8주 동안 실험 식이를 먹인 후 혈장 및 적혈구 TBARS 농도와 SOD, GSH-Px, GR, CAT 활성도를 측정하였다. in vitro항산화 활성 분석 결과를 보면 양성 대조군이 1% Vitamin C 용액이 94%정도의 DPPH 라디칼 소거능을 보였으며 우슬과 골쇄보 추출물에 대한 DPPH 값은 골쇄보의 값이 우슬보다 유의적으로 높은 소거능을 보였다. 환원력에서도 골쇄보가 우슬보다 유의적으로 높은 높은 값을 보였다. 반면에 총 항산화력에서는 우슬이 골쇄보다 유의적으로 높은 항산화력을 나타내었다. SOD의 측정값은 우슬과 골쇄보 간에 유의적 차이가 없었다. Fe²⁺ chelate활성에선 DPPH와 환원력과 달리 우슬이 77.60%로 골쇄보 46.21%에 비해 유의적으로 높은 활성도를 나타내었다. 혈장 TBARS 농도는 우슬 추출물을 섭취한 OVX-AR군이 13.58 ± 0.20 (nmol/㎖)로 SHAM군의 15.70 ± 0.20와 비슷한 수준으로 낮았고, 난소 제거 후 일반 식이를 먹인 OVX군이 20.70 ± 0.08로 유의적으로 가장 높은 수치를 나타 내어 과산화 지질 함량이 가장 높았다. 간 조직 항산화효소 활성을 보면 OVX- AR군(우슬)이 GSH-Px, PON에서 유의적으로 높은 활성을 보였고 CAT와 GR에서 OVX-DR군(골쇄보)이 유의적으로 높게 났다. 신장 조직 항산화 효소 활성에서는 OVX- DR군(골쇄보) 이 SOD, GSH-Px, GR, PON 에서 유의적으로 높게 나타났으며, 자원 추출물 간의 CAT 활성도의 유의적인 차이는 없었다. 적혈구 항산화 효소 활성은 SOD에서 OVX-DR군(골쇄보)이, GSH- Px에서는 OVX-AR 군(우슬)이 유의적으로 높았고, CAT와 GR 활성은 난소절제 후 OVX(자원식물 추출)군이 SHAM(일반식이 투여)군 보다 유의적으로 높은 항산화효소 활성을 보여 주었다.

In vitro and in vivo experiments using Achyranthis radix and Drynariae rhizoma extracts were conducted. Antioxidant properties were analyzed and the effects on bone, glucose and lipid metabolism were investigated. Drynariae rhizoma (64.67%) obtained higher DPPH radical scavenging activity compared to Achyranthis radix (19.03%). Similar results were obtained in the reducing power. No differences were observed on the ABTS radical scavenging ability and SOD. In contrast, Achyranthis radix (77.60%) has higher chelating ability compared to Drynariae rhizoma (46.21%). In vivo experiments revealed higher plasma TBARS in OVX-DR than in OVX-AR. Opposite result was seen in erythrocyte TBARS. Hepatic, nephritic and erythrocyte enzymes were considered for the antioxidant enzyme activities. GSH-Px and PON of hepatic enzymes were higher in OVX-AR. While the CAT and GR were higher in OVX-DR. SOD, GSH-Px, GR and PON of nephritic enzymes of OVX-DR were higher compared to OVX-AR. Almost similar values were obtained in CAT using both extracts. The OVX treated rats obtained higher CAT and GR in the erythrocyte enzymes compared to SHAM. The SOD of erythrocyte enzymes in OVX-DR was higher compared to OVX-AR. On the other hand, the GSH-Px was higher in OVX-AR.

서 언

호르몬이나 약물의 경우 장기간 투여하거나 복용 할 시 많은 부작용을 동반하고 있기 때문에, 최근에는 한약재 및 식품 등 천연 생약물질의 활성 성분을 이용한 대체요법 및 식이요법에 대한 연구들이 진행되는 추세이다. 골 관련 질환에 효과가 있다고 알려진 한약재들의 골다공증 예방 관련 효능 검증에 대해서는 다양한 연구가 이루어지고 있지 않는 실정이므로 골밀도 개선 효능이 우수한 소재를 우리나라에서 자생하는 약용자원으로부터 개발하여 실용화시킬 수 있다면, 현재 이용되고 있는 다른 골다공증 치료제보다도 경제적인 면이나 환자의 순응도 등을 고려할 때 기존의 것에 비해 비교 우위에 있을 것이다. 본 연구의 한약제로는 우슬과 골쇄보를 사용하였으며, 우슬(牛膝, Achyranthis radix) 비름과(Amaranthaceae)에 속하는 다년생 초본의 뿌리를 일컬으며, Saponin과 다량의 칼슘염을 함유하고 있고, 우리나라에서 우슬은 대한약전외한약규격집에 비름과에 속하는 다년생 초본인 쇠무릎 Achyranthis japonica Nakai의 뿌리로 규정하고 있다(Li et al., 2007). 우슬의 맛은 신맛이 나고 체내에서 간과 신장을 보하고, 근육과 뼈를 튼튼히 하며, 어혈을 풀고, 염증을 다스리는 효능이 있다고 하여, 예로부터 민간요법으로 고혈압, 류머티스 관절염, 울혈 치료제, 이뇨제, 강장제 등으로 널리 쓰였으며 어린 순은 따다가 나물로 먹기도 한다. 또한 우슬이 파골세포의 분화를 억제한다는 연구결과도 있어 골다공증 치료에 효능을 보일 가능성을 제시한다고 볼 수 있다(전국한의과대학 공동교재편찬위원회, 2000 in press; Kim et al., 2010).

또한, 골쇄보(骨碎補, Drynariae rhizoma)란 고란초(皐蘭草 Crypsinus hastatus (Thunb.) Copel.)과에 속하는 여러해살이 풀인 넉줄고사리(骨碎补, 兔脚蕨 Davallia mariesii T. Moore ex Baker)의 뿌리와 줄기를 말린 것으로 이름은 부서진 뼈를 붙인다는 뜻을 가진다. 골쇄보는 흔히 넉줄고사리라고 불리며 다년생 초본으로 뿌리는 옆으로 길게 뻗어 있으며 송곳 또는 지렁이 모양으로 생겼다. 뿌리마다 귀가 달린 것처럼 돌기가 나있으며 털로 가득 덮여있으며, 한의학에서는 염증, 고중성지방혈증, 동맥경화, 골다공증, 골절, 골재흡수 뿐만 아니라 부인과질환에 효과적인 것으로 보고되고 있다(Jeong et al., 2003). 그 외에도 한국본초도감에서는 골쇄보의 약리작용을 고지혈증의 예방과 치료, 뼈에서 칼슘의 흡수를 촉진시키는 동시에 혈액 칼슘농도를 높여 골절이나 골다공증에 효과가 있다고 하였다(Ahn, 1998). 골쇄보에 대한 최근의 연구는 골쇄보 추출물의 mouse 파골세포에서 cathepsin K 매개에 의한 뼈의 재흡수 억제효과 파골세포 활성에 대한 뼈세포의 기능 촉진 및 아교질분해와 뼈의 재흡수 억제기능 등이 있다(Jeong et al., 2003; Sun et al., 2002; Hong and Jeong, 2000). 이상의 두 약제는 임상에서의 응용 가능성은 매우 높을 것으로 생각되며, 골다공증 치료제로 사용되어지고 있는 고가의 약제들에 비해서 비용이 저렴하기 때문에 경제적 측면에서도 많은 환자에게 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

따라서 본 연구는 우슬과 골쇄보의 열수 추출물이 가지는 항산화 활성을 분석하고 항산화 효소 대사를 조사하여 천연자원 식물의 약용 가능성을 비교하고자 본 실험을 실시하였다.

 

재료 및 방법

실험재료

항산화 활성 분석에 사용된 우슬(牛膝, Achyranthis radix)은 충북 제천시에 있는 제천한방약에서 구입하였으며 골쇄보(骨碎補, Drynariae rhizoma)는 서울 동대문구에 있는 지리산 한약나라에서 구입하였고 원산지는 우슬은 경북 경산, 골쇄보은 중국산을 사용하였다.

두 종류의 자원식물 100 g을 깨끗이 씻어 불순물을 제거한 다음 각각 2 L 증류수를 가하여 가정용 약탕기인 오쿠(OC-8300R, 헬스쿠킹하이텍, Korea)의 달임 기능으로 112℃에서 3시간 30분 동안 열수 추출하였다. 이 과정을 수회 반복하여 얻어진 추출물을 가제를 이용하여 거른 다음 농축시킨 후, 동결건조기(Freeze dryer)로 동결 건조하여 건조 분말을 얻었다. 이 건조분말을 10 ㎎/㎖의 농도로 DMSO(dimethylsul-foxide)에 녹여 항산화 활성 분석에 사용하였다.

in vitro 항상화 활성 분석

DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scaven-ging activity) 측정

시료 10 ㎕와 에탄올 1 ㎖, 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) 0.99 ㎖를 분주한 실험관에 500 ㎕의 0.5 mM DPPH (2,2-dipheny 1-2-picrylhy drazyl)용액을 첨가한 군과 DPPH 용액은 첨가하지 않은 군, 시료를 첨가하지 않은 군을 구분하여 용액을 제조한 후 교반 및 분주하여 빛과 반응하지 못하게 foil로 감싸준 뒤 실온에서 30분간 방치한 후 ELISA reader를 이용해 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(%)은 아래계산식으로 산출하였고, As는 시료 첨가군, Ac는 DPPH 무첨가군의 흡광도 값을 대입하였다. 양성 대조군으로는 1% Vitamin C 용액을 사용하였다.

EDTA(%)=(1−(As−Ac)/control) × 100

환원력(Reducing power) 측정

환원력 측정은(Oyaizu, 1986)방법에 따라 0.2 M Phosphate buffer와 시료 0.5 ㎖, 1% potassium ferricyanide 0.5 ㎖를 각각 혼합시킨후50℃에서 20분 동안 정치한 다음 TCA (trichloroacetic acid) 용액 0.5 ㎖를 첨가하여 centrifuge에서 5,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 상층액 0.5 ㎖에 증류수 0.5 ㎖와 1% ferric chloride용액 0.1 ㎖를 첨가하여 발색반응을 유도한 후96 well plate에 0.2 ㎖씩 분주한 뒤ELISA reader를 이용해 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

총항산화력(ABTS) 측정

총항산화력은(Roberta, 1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. 증류수에 용해한 7.4 mM의 ABTS (2,2”-azinobis 3-ethyl benzothia zoline-6-sulfonic acid)와 2.6 mM potassium persulphate을 혼합한 후, 안정화를 위해 암실상태에서 12에서 16시간 방치하여 ABTS+를 형성시킨다. 734 ㎚에서 OD값이 1.45 ± 0.05이 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석하였다. 시료 용액 50 ㎕에 위의 ABTS·+용액 1 mL을 첨가 및 혼합하여 30분간 실온에서 정치한 후 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로서 L-ascorbic acid를 사용하여 AEAC (ascorbic acid equivalent anti oxidant capacity) 방법으로 시료의 항산화력을 나타내었다.

SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity) 측정

SOD 유사 활성 측정은 Marklund의 방법에 따라 pyrogallol이 촉매제로서 생성된 과산화수소(H2O2)를 제거하는 반응을 SOD 유사활성으로 나타내었다(Marklund and Marklund, 1974). 시료 50 ㎕에 Tris-HCL 완충용액(50 mM Tris+10 mM EDTA, pH 8.5) 1.5 ㎖와 7.2 mM pyrogallol 0.1 ㎖를 가한 후 25℃에서 10분간 반응시킨 다음, 1N HCl 50 ㎕를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 ELISA reader로 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율을 %로 나타내었다. 이때 SOD-like activity 계산법은 아래와 같다.

Scavenging activity(%)=(1−(Sabs−Babs)/Cabs) × 100 Sabs; Sample의 흡광도 Babs; pyrogallol 대신 buffer Cabs; Sample 대신 buffer

Fe2+chelate활성 측정

Fe2+chelate활성은 변형된 Yen의 방법을 이용하여 측정하였다(Yen et al., 2002). 시료 300 ㎕에 2 mM ferrous chloride 100 ㎕와 5 mM ferrozine을 200 ㎕ 가하여 흡광도 값의 조정을 위해 95% ethanol 3.4 ㎖를 혼합하였다. 10분 동안 상온에서 반응시킨 후, 562 ㎚에서 반응액의 흡광도를 측정하여 시료 첨가군와 시료 무첨가군의 흡광도차를 백분율로 표시하여 Fe2+이온 제거 능력을 나타내었다. 대표적 chelating agent인 EDTA를 대조군으로 사용하였다.

Metal Chelating activity(%) = (1−A/B) × 100 A:시료 첨가군의 흡광도 B:시료 무첨가군의 흡광도

in vivo 동물 실험

실험동물

실험동물은 갱년기 유도를 위해 생후10주령Sprague-Dawley 암컷 Rat 40마리를 중앙실험동물로 부터 구입하여 사용하였다. 고형사료를 제공하면서 2주간 안정화 시킨 후 난소 제거 수술 절차에 따라 난소를 제거하여 갱년기를 유도한 뒤 2주간의 회복기간을 가진 다음, SHAM군을 제외하고는 체중이 유사하도록 난괴법(randomized block design)에 의해 실험동물을 10마리씩 4군으로 나누었다. 전체 시험군은 정상식이(AIN-76 semisyn-thetic diet)를 급여한 SHAM군과 OVX군, AIN-76 diet를 base로 각각 1%씩 우슬(Achyranthis Radix), 골쇄보(Drynariae Rhizoma) 열수 추출물을 첨가한 시험군으로 구성하였으며 8주간 실험 식이를 공급하였다.

동물 사육실의 환경은 항온(25 ± 2℃), 항습(50 ± 5%)을 유지하도록 하여 6:00에서 18:00까지 사육기간 동안 light cycle을 유지하면서 개개의 stainless cage안에서 사육하였다. 조제된 실험 식이는 사육 기간 동안 냉장 보관하며 자유식(ad libitum)으로 공급하였고, 식수 역시 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.

난소 제거 수술

모든 난소제거 대상 실험동물은 12시간 이상 절식시켜 Zoletile (Virbac, France; 25 ㎎/㎏, 복강투여) 마취하에 옆으로 눕힌 자세에서 늑골 아래를 2 ㎝정도 절개하여 양쪽 난소를 제거한 후 일반적인 방법으로 봉합하였다. 한편 SHAM 수술군에서는 동일한 방법으로 마취와 절개를 진행하지만 난소는 제거하지 않고 봉합하였다.

혈장 및 적혈구 TBARS 함량 측정

혈장과 적혈구 Thiobarbituric acid reactive substrance (TBARS) 측정은 (Tarladgis et al., 1964)에 따라 지질의 산패 시 생성되는 적색의 Malondialdehyde (MDA) 흡광도를 측정하는 비색정량법을 이용하였다.

먼저 적혈구 TBARS 함량 측정은 적혈구를 취해 희석한 다음, 5% trichloroacetic acid (TCA)에 thiobarbituric acid (TBA)를 첨가하여, 80℃에서 90분 동안 정치시켰다. 이를 실온에서 냉각 시킨 후 2000 rpm에서 15분간 원심분리 시켜 상층액을 얻은 다음 535 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. MDA 표준용액은 tetra-methoxypropane (TMP)를 가수분해하여 조제하였으며, 조제된 표준용액은 적혈구와 동일한 조건에서 반응시켜TBA-MDA choro-mopore의 표준곡선을 그리고 TBA 반응물질의 양을 MDA equivalent로 구하였다.

혈장 TBARS 측정은 적혈구 TBARS와 동일한 방법으로 측정하였다. 혈에 TCA와 TBA를 넣어 혼합한 후 80℃에서 90분간 하여 실온에서 냉각시킨 후, 2000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 535 ㎚에서 상층액의 흡광도를 측정하였다.

Superoxide dismutase (SOD) 활성도 측정

SOD는 Superoxide anion radical을 H2O2와 O2로 분해시키는 반응에 관여하는 효소로 측정법은(Marklund and Marklund, 1974) 방법을 수정 및 보완하여 사용하였다. 알칼리 상태의 pyrogallol이 자동산화에 의해 발색되는 정도를 측정하는 것으로, 세포질 분획의 지질 침전을 위하여 ethanol:chloroform (5:3, v/v) 용액에 혼합하여 10,000 rpm 원심분리로 상층액을 얻어 실험에 사용하였다. 즉, EDTA를 포함한 Tris-HCl buffer (pH 8.5)에 효소원 0.1 ㎖와 pyrogallol 용액 0.1 ㎖를 잘 혼합하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 50 ㎕ HCl 를 첨가하여 반응을 종결시키고 420 ㎚에서 흡광도를 측정하여 효소활성을 산출하였다. 효소활성의 단위는 효소원을 넣지 않고 반응시킨 pyrogallol 용액의 자동산화를 방해하는데 필요한 hemoglobin 또는 protein의 양으로 정하였다.

Glutathione Peroxidase(GSH-Px)활성도 측정

Glutathione Peroxidase (GSH-Px) 활성도 측정은(Paglia and Valentine, 1967)의 방법을 일부 수정하여 사용하였다. 환원형Glutathione (GSH)은 GSH-Px에 의해 산화형 Glutathione (GSSG)이 되고, GSSG가 NADPH에 의하여 환원 될 때의 흡광도 변화를 이용하여 측정한 것으로 0.1 M Tris-HCl (pH 7.2) buffer 2.6 ㎖와 30 mM GSH 0.1 ㎖를 넣고 6 mM NADPH 용액 0.1 ㎖에 25 ㎛ H2O2를 넣은 다음, 25℃에서 5분간 미리 반응시켰다. 세포질 분획을 첨가하여 25℃에서 5분간 추가 반응시킨후에 340 ㎚에서 흡광도 변화를 측정하였다. 활성도 단위는 1분당cytosolic protein이나 적혈구 hemoglobin 1 g에 의해 산화된 NADPH nmole로 하였다.

Catalase (CAT) 활성도 측정

H2O2를 물과 산소로 분해하는 역할을 하는 효소인 Catalase (CAT) 활성도는(Aebi et al., 1974)의 방법을 수정 및 보완하여 측정하였다. 50mM pota ssium phosphate buffer (KH2PO4: K2HPO4=1:1.55,pH7.4)에 효소원 분리로 얻은 mitochondria 분획을 넣고 25℃에서 5분간 전반응 시킨 다음 340 mM H2O2용액을 첨가하여 25℃에서 5분간 추가로 반응시켜 240 ㎚에서의 흡광도 변화를 측정하였다. 효소 활성도 계산은 mitochondrial protein 1 ㎎과 hemoglobin 1 g이 분해시킨 H2O2의 μmol로 하였다.

Glutathione Reductase (GR) 활성도 측정

Glutathione Reductase(GR) 활성도는 Charles (1952)의 방법을 수정, 보완하여 측정하였다. GSSG가 GR의 작용으로 GSH로 환원될 때 NADPH가 산화되어 감소되는 정도를 측정하기 위해 반응액으로는 1 mM EDTA, 1 mM GSSG, NADPH 0.1 mM를 포함하는 potassium phosphate buffer (pH 7.4)를 사용하고 이 반응액에 효소원 cytosol을 첨가한 후 25℃, 2분 간 흡광도 감소량을 340 ㎚에서 측정하였다. 활성도 단위는 cytosolic protein 1 ㎎ 이 1분간 산화시킨 NADPH의 nmol로 나타내었다(nmol NADPH oxidized/min/㎎ cytosolic protein, nmol NADPH oxidized/min/g hemoglobin).

Paraoxonase (PON) 활성도 측정

Paraoxonase 활성도는(Mackness et al., 1991)의 방법을 수정 및 보완하여 paraoxon이 분해되어 생긴 p-nitrophenol (extinction coefficient: 17,000 M-1 ㎝-1)로 인한 흡광도 값의 증가를 측정하였다. 반응액의 최종 농도는 1.9 mM, CaCl2, 90 mM Tris-HCl buffer (pH8.0), 5 mM paraoxon (O,O-diethyl-O- nitrophenyl phosphate)로 하여 mitochondria 분획을 첨가하고 25℃, 90초 동안 생성되는 p-nitrophenol을 412 ㎚에서 측정하였다.

통계분석

본 연구의 모든 실험결과는 SPSS package program (statistical package for the social sciences, SPSS Inc., Chicago, III)을 사용하여 각 실험군당평균과 표준오차로 나타내었고, 각 군 간의 평균차이에 대한 유의성 검정은 one-way analysis of variance (ANOVA)를 이용하였다. 다군 간의 차이는 Tukey’s test에 의한 P < 0.05수준에서 검정하였으며, 그 결과는 mean ± S.E. (standard error)로 표시하였다.

 

결과 및 고찰

in vitro 항산화 활성 분석

DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scaveng-ing activity)

Fig. 1은 DPPH radical 소거능 측정은 전자공여능 측정하는 방법으로 황 함유 아미노산, aromatic amine, ascorbic acid 등에 의해 환원되어 탈색되는 것이므로, 다양한 천연 소재의 항산화 물질을 확인하는데 많이 측정되고 있다(Kim, 2004). 우슬과 골쇄보 추출물에 대한 DPPH radical을 측정한 결과를 설명하고 있다(Fig. 1). Vitamin C를 기준으로 보았을 때의 DPPH 값은 골쇄보가 우슬의 값보다 유의적으로 높은 값을 보였다.

Fig. 1.DPPH radical scavenging activities of Achyranthis radix and Drynariae rhizoma plant extracts.

환원력(Reducing power)

환원력 측정은 700 ㎚에서 Fe3+ (ferric ferricyanide) 이온을 Fe2+ (ferric sulphate)로 안정화시키며, 산화반응을 중단 시키는 환원력을 측정한 것이다. 그 결과 우슬 보다 골쇄보가 더 높은 환원력이 측정되었다(Fig. 2).

Fig. 2.Reducing powers of Achyranthis radix and Drynariae rhizoma plant extracts.

총항산화력(ABTS)

ABTS+는 비교적 안정적인 free radical로써, DPPH와 함께 항산화 활성 측정에 널리 쓰이는 방법 중 하나이다. 이 실험은 potassium persulfate 와 ABTS의 산화에 의해 ABTS+가 활성 양이온이 된 후 시료의 항산화력에 의해 ABTS+소거되며 청록색으로 탈색되는데 이때의 흡광도를 측정하여 항산화력을 관찰한다(Kim, 2013). 두 약용자원 추출물의 항산화력을 비교 해 보면 우슬이 42.808 ㎎ AEAC/g, 골쇄보가 41.44 ㎎ AEAC/g으로 골쇄보 보다 우슬이 유의적으로 높은 항산화력을 보이고 있다 (Fig. 3).

Fig. 3.ABTS radical scavenging activities of Achyranthis radix and Drynariae rhizoma plant extracts.

SOD유사활성(Superoxide dismutase-like activity)

SOD (Superoxide dismutase)는 인체 내에서 superoxide를 peroxidase나 catalase로 인하여 산소와 물로 변환시키는 활성산소 저해효소이다(Choi, 2009). 이 실험에서는 superoxide와 갈변반응을 하는 pyrogallol의 자동산화 억제능을 측정하는 원리로 측정하였는데 SOD의 측정값은 우슬과 골쇄보 모두 유의적 차이가 없었다(Fig. 4).

Fig. 4.Superoxide Dismutase (SOD) abilities of Achyranthis radix and Drynariae rhizoma plant extracts.

Fe2+chelate활성

Fe2+chelate활성은 활성산소종의 생성 억제를 하여 세포의 산화적 손상을 막으며 지질 과산화 생성물을 생성하는데 촉매 역할을 하는 전이 금속 농도 또한 낮춰 준다(Duh, 1999). 실험결과를 보면 DPPH, 환원력, SOD 실험 결과와 달리 우슬의 활성도가 골쇄보의 활성도에 비해 유의적으로 높은 결과를 보이고 있다(Fig. 5).

Fig. 5.Fe2+Chelatingabilitiesof Achyranthis radix and Drynariae rhizoma plant extracts.

in vivo 동물 실험

혈장, 적혈구의 TBARS 비교

TBARS (thiobarbituric acid reactive subs tances) 분석법은 지질 과산화를 측정하는데 대표적으로 사용되는 분석방법이다. 지질과산화물의 지표인 Thiobarbituric acid reactive substances의 결과를 나타내었다(Table 1).

Table 1.zTBARS: Thiobarbituric acid reactive substance ySHAM; Sham operated rats fed with normal control diet, OVX; Ovariectomized rats fed with normal control diet, OVX-AR; OVX + Achyranthis Radix, OVX-DR; OVX +Drynariae Rhizoma.xValues are means ± SE (n = 10). Means in the same row not sharing a common superscript are significantly different at p < 0.05.

먼저혈장 TBARS 농도는 우슬 추출물을 섭취한 OVX-AR군이 13.58 ± 0.20 (nmol/㎖)로 가장 낮았고, 난소 제거 후 일반 식이를 먹인 OVX (20.70 ± 0.08)군이 유의적으로 가장 높은 수치를 나타내어 과산화지질 함량이 가장 높았다. Mittal et al. (2008)은 난소절제 흰쥐의 혈장 TBARS 수치가 Estradiol 투여 이후 감소함을 보여 주었는데 실험 결과 이와 유사한 결과를 보여 주었다. 또한 적혈구 TBARS 측정 결과 골쇄보 추출물 식이섭취군이 우슬 추출물 섭취군보다 각각 57%, 15% 억제 된 것을 확인 하였다. 따라서 산화 스트레스로 인한 물질들의 감소 효과로 보아 자원 식물 추출물이 항산화 및 심혈관계 질환에 좋은 효과를 나타낼 것으로 보인다. 간, 신장 그리고 적혈구의 항산화효소 활성을 설명하고 있다(Table 2). 간조직에서의 OVX -AR군이 GSH-Px, PON에서 유의적으로 높은 활성을 보였다. D-garactose로 산화가 유발된 흰쥐에 우슬과 혼합한 자원 추출물이 CAT 활성을 촉진시키고, 우슬의 다당 성분이 항산화 작용으로 인한 노화 방지에 효과가 있다고 보고 하였다(Lee, 2004; Liu, 2001). 본 연구 결과 CAT와 GR에서 OVX-DR군이 유의적으로 높은 항산화 활성도를 나타내어 앞선 결과와 일치하였다. 신장 조직 항산화 효소 활성에서는 OVX-DR군이 SOD, GSH-Px, GR, PON에서 유의적으로 높게 나타났으며, 자원추출물 간의 CAT 활성도의 유의적인 차이는 없었다. 낮은 PON 활성도는 관상동맥 질환의 위험인자로 알려져 있으므로 PON 활성이 가장 높게 나타난 골쇄보 추출물이 관상동맥 질환에 효과가 있을 것이라 짐작 할 수 있다(Aviram et al., 2000). 적혈구 항산화 효소 활성은 SOD에서 OVX -DR군이, GSH-Px에서는 OVX-AR군이 유의적으로 높았고, CAT와 GR 활성은 난소 절제 후 자원식물 추출군이 일반식이 투여군 보다 유의적으로 높은 항산화효소 활성을 보여 주어 우슬 및 골쇄보 추출물은 폐경 이후 체내 항산화계가 활발히 작용하여 일부 긍정적인 효과가 있는 것으로 판단되어, 갱년기 여성들의 심혈관계 질환 예방에 효과를 기대할 수 있다.

Table 2.zSHAM; Sham operated rats fed with normal control diet, OVX; Ovariectomized rats fed with normal control diet, OVX-AR; OVX + Achyranthis Radix, OVX-DR; OVX +Drynariae Rhizoma. ySOD: superoxide dismutase, GSH-Px: glutathione peroxidase, CAT: catalase, GR: glutathione reductase, PON: paraoxonase. xValues are means ± SE (n = 10). Means in the same row not sharing a common superscript are significantly different at p < 0.05.