서 론
GABA (γ-aminobutyric acid)는 비단백질 구성 아미노산으로서 사람과 동물에 있어 중추신경계의 주된 흥분 억제성 신경전달물질이며, 뇌기능 촉진, 신경안정, 혈압강하, 이뇨 작용, 간기능 개선, 비만방지, 알콜대사 촉진, 소취작용 등 매우 다양한 생리기능을 갖는 것으로 알려져 있다[1, 12, 15, 18]. 미국 및 일본에서는 뇌혈류 개선용 의약품으로 승인되어 GABA 성분을 주로 의약용으로 이용하고 있으나, 한국에서는 최근 식품, 식품첨가물 및 화장품 소재로 이용하려는 시도가 다양하게 이루어지고 있으며, 특히 인간의 구강 점막 섬유아세포(buccal mucosa fibroblast)에서 collagen 합성을 촉진하는 것으로 보고된 바 있어 주름 개선을 위한 화장품 소재로의 사용이 점점 증대되고 있다[13, 14, 16]. 한편, 피부 주름의 발생원인 중 하나는 collagen의 결핍으로 알려져 있는데, collagen은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조와 탄력을 유지하는 역할을 하며, 나이가 들면서 생성의 감소를 보이며 분해도 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하고 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. 이러한 주름개선을 위해 기존에 사용되는 소재인 retinol과 adenosine 등은 collagen의 합성을 증가시키고, 표피각화과정을 정상화시켜 피부재생에 관여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다[10].
Lactobacillus sakei B2-16 균주를 사용하여 미강, 쌀눈 및 대두 추출물을 주원료로 발효하는 경우에 5~10%(w/v)의 monosodium glutamate (MSG)가 90% 이상 GABA로 전환된 곡물발효 소재를 얻을 수 있는 것으로 보고되었다[8]. 이와 같이 각종 기능성 성분을 갖는 곡류 및 해산물을 이용하여 유산균을 발효 하였을 때, GABA와 같은 기능성 성분뿐만 아니라 곡물 및 해산물에서 유래하는 각종 영양성분이 함유된 발효물을 얻을 수 있으며, 이것은 다양한 생리적 기능을 가질 수 있음을 의미한다.
본 연구에서는 다양한 곡류(메밀, 귀리, 참깨, 검은콩, 율피, 현미, 보리, 들깨, 밀) 및 다시마를 배지 성분으로 사용하여 유산균을 배양하였고, 이중에서 메밀 및 다시마를 포함하는 배양물이 fibroblast의 collagen 합성을 촉진하는 것으로 확인하였다. 메밀은 12∼15% 단백질이 함유되어 있고, 다른 곡류작물에서 부족한 필수 아미노산인 lysine을 많이 함유(5∼7%)하고 있으며, 지방, 철, 인, 아연 등 무기질과 비타민 B1과 B2도 비교적 많이 함유하고 있다. 다시마는 칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘 등 신체의 생리 대사에 관여하는 무기질을 다량 함유하며 갑상선 호르몬의 주성분인 요오드를 4,000 ppm 이상 함유하고 있을 뿐만 아니라 인체의 소화효소에 의해 분해되지 않는 알긴산을 풍부하게 함유하고 있다[3, 6]. 본 연구에서는 메밀 및 다시마를 포함하는 배양물들을 화장품 소재로 사용하기 위하여 GABA 함량, 항염증 및 세포 안정성 효과와 같은 생리적 기능을 조사하였다.
재료 및 방법
사용 균주
유산균 배양에 사용한 균주는 본 연구실에서 분리한 Lactobacillus brevis AR1을 사용하였고, 전배양에는 4% MSG가 첨가된 MRS 배지(pancreatic digest of gelatin 10 g, beef extract 8 g, dextrose 20 g, dipotassium phosphate 2 g, polysorbate 80 1 g, sodium acetate 5 g, ammonium citrate 2 g, magnesium sulfate 0.2 g, manganese sulfate 0.05 g, 1 L-1)를 이용하여 30℃에서 48시간 배양한 후 본 배양에 사용하였다.
곡물 및 다시마 추출물의 제조
각종 곡물(메밀, 귀리, 참깨, 검은콩, 율피, 현미, 보리, 들깨, 밀) 및 다시마는 수세 및 분쇄공정을 거쳐 적당한 크기로 분쇄한 다음, 각 시료 100 g에 증류수를 5배 가하고 60℃에서 12시간 동안 추출한 후, 원심분리(6,000 rpm, 15분)하고 상등액을 분리하여 곡물 및 다시마 추출물을 제조하였다.
곡물 및 다시마 함유 유산균 배양물의 제조
상기에서 제조한 곡물 또는 다시마 추출물 각각 500 ml에 SY 배지(4% sucrose, 1% yeast extract, 4% MSG)를 혼합한 후, 80℃에서 1시간 가열하여 살균처리 하였다. 2일간 전배양 한 Lb. brevis AR1을 혼합배지 500 ml에 1%(v/v) 농도로 접종하고 120 rpm으로 교반하면서 30℃에서 68시간 배양함으로서 곡물 추출물 또는 다시마 추출물을 함유하는 유산균 배양물을 수득하였다. 수득한 곡물 또는 다시마를 함유하는 유산균 배양물을 원심분리(8,000 rpm, 10분)하여 상등액을 분리한 후 pore size 1.0 μm의 filter paper를 사용하여 상등액을 여과한 다음, 균체 및 불용성 성분이 제거된 유산균 배양물을 회수하였다.
Collagen 합성량 측정
곡물 및 다시마 함유 유산균 배양물의 collagen 합성 촉진 효능을 알아보기 위하여 Sircol collagen assay kit (Biocolor, UK)을 사용하였다. Collagen 합성량 측정을 위해서 한국세포 주은행에서 분양 받은 fibroblast NIH 3T3 세포주를 사용하였고, 10% fetal bovine serum (FBS)가 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에서 배양하면서, 24-well plate에 각각 4×104개의 세포를 분주하였다. 유산균 배양물의 처리전에 세포의 접착을 위해서 1 ml의 세포 배양물을 분주하여 12시간 배양한 후, 각종 곡물 및 다시마 함유 유산균 배양물을 각각 0.5% 처리한 후 24시간 배양하였다. 대조구로는 순수 유산균 배양물 만을 사용하였다. 배양 후 상등액 800 μl를 얻은 후 12,000 rpm에서 원심 분리한 후 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 Sircol collagen assay kit에서 제공하는 방법대로 반응한 후 분광 광도계로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
GABA 함량 분석
메밀 또는 다시마 추출물을 함유하는 배지에서 유산균을 배양할 때 GABA의 생성 여부를 알아보기 위하여 원심분리하여 균체를 제거한 후 GABA 함량을 분석하였다. GABA 함량은 HPLC (Waters)를 이용하여 다음과 같은 방법으로 분석하였다. GABA는 phenylisothiocyanate (PITC)를 사용하는 AccQ-Tag로 형광유도체화하였고, 유도체화된 시료는 0.45 μm filter로 여과한 후, Nova-Pak C18 HPLC column (150×3.9mm, Waters)을 사용하여 분석하였다. Column에서 유도체를 용출시키기 위해서 AccQ-Tag Eluent A (0.14 M sodium acetate, 10 mM EDTA, pH 6.4)와 Eluant B (60% acetonitrile, 10 mM EDTA)를 사용하여 binary non-linear gradient 방식으로 분당 1 ml의 유속으로 흘렸다. GABA의 함량은 표준품 GABA 및 L-glutamate 분석 결과와 비교하여 산출하였다.
피부 염증 반응 시험
메밀 및 다시마 함유 유산균 배양물의 피부 염증 완화 효과를 알아보기 위하여, Sheu [17] 등의 방법에 따라 다음과 같이 수행하였다. 실험대상으로는 CD-1 mouse (male & female, 4-6 weeks, Hyochang science, Korea) (승인번호: DEU-R2013-002)를 사용하고, 자극 물질로는 0.05%(w/v, in acetone) 12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate (TPA)액 10 μl를 실험 동물 양귀의 안쪽과 바깥쪽에 처리하였다. 처리 물질로 인해 귀가 두꺼워 지면서 염증반응이 일어난 이후에, 염증을 완화시키는 것으로 알려진 1 mM clofibrate와 메밀 유산균 배양물 또는 다시마 유산균 배양물을 각각 5% 농도로 염증 유발 후 45분 및 2시간째에 귀의 양쪽 면에 cm2 당 20 μl를 처리하였다. 자세한 세포학적 소견을 얻기 위하여 4% formaldehyde에 고정하고, hematoxylin and eosin (H&E) 염색법[9]으로 염색한 다음, 조직 슬라이드를 100배 확대한 사진으로 염증완화를 확인하였다.
세포 안정성 시험
세포를 이용한 유산균 배양물의 안정성 시험은 EZ-cytox cell viability assay kit (Daeillab service, Korea)를 사용하여 수행하였다. 한국세포주은행에서 분양 받은 fibroblast NIH 3T3 세포주를 사용하였고, 10% FBS가 함유된 DMEM에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양한 후, 메밀 및 다시마 함유 유산균 배양물을 적당 농도로 희석하여 첨가하고 다시 24시간동안 배양하였다. 여기에 assay agent를 10 μl 첨가하고 37℃, 5% CO2 항온기에서 2시간 배양한 후 450 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.
결과 및 고찰
곡물 및 다시마 함유 유산균 배양물의 collagen 합성능
다양한 곡물(메밀, 귀리, 참깨, 검은콩, 율피, 현미, 보리, 들깨, 밀) 및 다시마를 이용하여 유산균을 배양하고 그 배양물을 fibroblast NIH 3T3 세포주에 처리하여 collagen 합성능을 시험하였다. 그 결과 메밀과 다시마의 유산균 배양물을 처리한 fibroblast 배양액에서 대조구인 유산균 배양물에 비해 약 2.5배 이상 많은 양의 collagen이 검출되었다(Fig. 1). 따라서 다양한 곡물과 다시마를 포함하는 유산균 배양물 중에서 메밀 및 다시마의 유산균 배양물이 fibroblast의 collagen 합성에 대해 매우 우수한 효과를 가지는 것으로 확인하였다. 이들 결과를 바탕으로 메밀 및 다시마 함유 유산균 배양물의 농도 변화에 따른 fibroblast의 collagen 합성능에 대한 영향을 조사하였다. 각 세포 처리구에 positive control로써 collagen 합성 효과가 우수한 것으로 알려진 genistein (Sigma, USA) [4]과 β-glucan (Sigma) [5]을 각각 다양한 농도로 처리하였고, 메밀 유산균 배양물 및 다시마 유산균 배양물을 각각 0.01%, 0.1%, 0.5%로 처리하여 24시간 배양한 후 배양 상등액에 대하여 collagen 함량을 조사하였다. 그 결과, Fig. 2에서 나타낸 바와 같이 다시마 함유 유산균 배양물을 0.5% 처리한 경우, positive control로 사용한 10 μM genistein 및 0.5% β-glucan을 처리 하였을 때보다 합성되는 collagen 함량이 더 많았고, 메밀 함유 유산균 배양물을 0.5% 처리한 경우에도 β-glucan과 유사한 정도의 collagen이 합성 되는 것으로 확인되었다.
Fig. 1.Effect of the Lb. brevis AR1 fermented broth containing various grains and Saccharina japonica on the collagen synthesis in fibroblasts. Control is the only fermented broth.
Fig. 2.Effect of various concentrations of Lb. brevis AR1 fermented broth containing F. esculentum and S. japonica on the collagen synthesis in fibroblasts.
메밀에 포함 되어 있는 rutin은 인간 fibroblast에서 collagen 합성을 촉진하는 효과가 있는 것으로 알려져 있어[19], 본 연구에서 메밀 함유 유산균 배양물이 fibroblast의 collagen 합성을 촉진한 결과와 일치하였다. 또한, 다시마의 한 성분인 phytoestrogen은 에스트로겐과 유사한 효과를 가지고 있어 피부, 골 및 연골 조직에서 collagen 함량을 증가시키는 것으로 보고되었다[11]. 이것은 본 연구의 다시마 함유 유산균 배양물이 fibroblast의 collagen 합성을 촉진한 결과와 비슷한 양상을 나타내었다.
메밀 및 다시마 함유 유산균 배양물의 GABA 함량
메밀 또는 다시마가 포함된 배지에서 유산균을 배양할 때 균체의 생장곡선에 따른 GABA 생산량의 변화를 조사하였다. Fig. 3의 결과에서 유산균은 다시마 보다 메밀 추출물 함유배지에서 더 빨리 성장하는 것으로 나타났다. GABA 생산량에 있어서는 메밀과 다시마의 함유 배지 모두 대수증식기 말기에 접어드는 42시간 이후부터 GABA를 생산하기 시작하여 정지기인 72시간 만에 4% MSG (213 mM)가 약 180 mM로 전환되어 84.5%의 GABA 전환율을 나타내었다. 이것은 Lb. paracasei NFRI 7415 균주의 GABA 전환율인 60.4%[7]와 Lb. brevis GABA 057 균주의 GABA 전환율인 41.7%[2] 보다 훨씬 높은 GABA 전환율을 나타내어 본 연구에 사용한 Lb. brevis AR1은 GABA 생산에 있어 매우 우수한 성질을 나타내었다. GABA가 인간의 구강 점막 섬유아세포에서 collagen 합성을 촉진하는 것으로 보고된 바[16] 있지만 아직 정확한 작용기전은 밝혀진 것이 없기 때문에 이 부분에 대해서는 앞으로 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.
Fig. 3.Time profiles on the cell growth and GABA production of Lb. brevis AR1 in culture media containing F. esculentum or S. japonica with 4% MSG. Lb. brevis AR1 was cultivated for 72 hr at 30℃. ○, Cell growth in culture media containing F. esculentum; □, Cell growth in culture media containing S. japonica; ●, GABA production in culture media containing F. esculentum; ■, GABA production in culture media containing S. japonica.
메밀 및 다시마 함유 유산균 배양물의 피부 항염증 효과
메밀 및 다시마 함유 유산균 배양물의 피부 항염증 효과를 알아보기 위하여, 재료 및 방법에서 나타낸 바와 같이 CD-1 mouse를 대상으로 피부염증 반응을 실험하였다. 그 결과, TPA만을 처리한 negative control에서는 조직이 상당히 비대해져 있음을 확인 할 수 있었고(Fig. 4A), positive control인 clofibrate 처리군에서는 염증이 완화된 것을 확인하였다(Fig. 4B). 다시마 함유 유산균 배양물의 처리군에서는 clofibrate 처리군과 유사한 정도로 염증이 완화되었고(Fig. 4C), 메밀 함유 유산균 배양물의 처리군에서는 다시마 함유 유산균 배양물 보다는 부족하지만 negative control 보다는 염증 완화 효과가 있는 것으로 확인되었다(Fig. 4D). Kang 등은 유산균을 이용하여 제조한 다시마 발효분말이 세포 내 nitric oxide의 생성능을 억제하여 항염증 활성을 가지는 것으로 보고한 바 있어[4] 본 연구의 다시마 함유 유산균 배양물이 피부에서 항염증 효과를 나타낸 것과 유사한 결과로 확인되었다.
Fig. 4.Effect of anti-inflammatory of Lb. brevis AR1 fermented broth containing F. esculentum or S. japonica. A, Treatment of TPA on mouse skin; B, Treatment of TPA and clofibrate on mouse skin; C, Treatment of TPA and the fermented broth of S. japonica on mouse skin; D, Treatment of TPA and and the fermented broth of F. esculentum on mouse skin.
메밀 및 다시마 함유 유산균 배양물의 세포 안정성
메밀 및 다시마 함유 유산균 배양물의 세포독성을 조사하기 위하여 fibroblast에 배양물을 첨가하고 24시간 배양한 후 세포 생존율을 조사하였다. 그 결과 세포 배양액에서 메밀 또는 다시마 함유 유산균 배양물의 농도가 증가함에 따라 세포생존율은 조금 감소되었지만 10%의 시료를 첨가한 세포 배양액 중에서도 85% 이상의 우수한 세포 생존율을 나타내었다(Fig. 5). 따라서 메밀 또는 다시마 함유 유산균 배양물은 세포에 대한 독성이 없는 것으로 확인되어 화장품 소재로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
Fig. 5.Cell cytotoxicity of Lb. brevis AR1 fermented broth containing F. esculentum or S. japonica. ○, F. esculentum; ●, S. japonica.