Effects of Extracts from Oja on Testosterone Synthesis in Leydig Cells

五子 추출물이 Leydig 세포 내 testosterone 합성에 미치는 영향

Abstract

Traditionally, 5 kinds of fruits with "ja(子)" in their name, including Rubus coreanus, Schisandra chinensis, Lycinum chineuse, Torilidis fructus, and Cuscuta seed, collectively called Oja(五子), are long known to enhance stamina. In the present study, we replaced tosaja with gyeolmyeongja(Cassiae semen ) and examined the effects of extracts from these fruits on andropause. This study investigated the antioxidant effect and testosterone synthesis of Oja water extract on Leydig TM3 cells. To investigate whether hydrogen peroxide induces oxidative stress in Leydig cells, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay, nitric oxide assay, and testosterone assay were performed on mouse Leydig TM3 cells. The results were obtained as follows: Leydig TM3 cells viability was assessed by a modified MTT assay, and the protection effect of Oja water extract against hydrogen peroxide-induced cell oxidative stress were examined by mitochondrial activity. Oja water extract could efficiently protect cytotoxicity induced by H₂O₂. Oja water extract promoted testosterone synthesis. These results suggest that Oja water extract has protective roles and promotes steroidogenesis in Leydig cells through its anti-oxidant action.

서 론

갱년기는 성호르몬의 감소 및 노화로 인한 신체 변화로서 여성의 경우 난소의 에스트로겐 호르몬 감소, 남성은 고환의 테스토스테론 농도 저하가 주된 원인이다. 최근 삶의 질이 높아지고 여성갱년기 뿐 아니라 남성들도 갱년기 증상과 함께 성기능 장애에 대한 관심이 높아져 발기부전 등으로 내원하는 환자가 증가하고 있다. 남성 갱년기의 경우, 대표적 임상증상으로, 테스토스테론 호르몬 감소로 인한 발기부전, 근육량 감소, 체력감소, 복부지방 증가, 골밀도 감소, 피로감, 기억력 감소, 우울감 등 여성 갱년기의 신체증상과 유사하다1-3). 이러한 테스토스테론(testosterone) 호르몬의 생성은 고환 내에 있는 사이질세포(interstitial cell)인 Leydig 세포에서 콜레스테롤을 원료로 하여, 황체형성호르몬의 자극에 의해 여러 스테로이드호르몬의 합성 단계를 거쳐 세포 내 미토콘드리아에서 주로 합성된다4). 대표적인 남성 호르몬인 테스토스테론은 혈관 확장, 생식기능, 성생활 및 근육량과 부피 등을 조절하며 정신적, 생리적으로 중요한 역할을 한다3,5). 10대 후반에서 20대 초반에 최고조에 달하게 되고 이후 노화가 진행됨에 따라 Leydig`s cell의 감소와 기능 저하, 손상으로 인해 합성량은 서서히 감소하여, 신체 내 여러 문제를 야기시키게 된다6). Leydig`s cell 내 테스토스테론 합성량 주요 감소의 원인은 생식샘기능저하증(hypogonadism), 비만, 산화적 스트레스, 생활습관, 환경오염물질, 장시간 컴퓨터 사용 등이 언급되고 있다7-9). 또한 테스토스테론은 사회·물리적, 심리적 요인으로 인한 스트레스와 수면에도 많은 영향을 받으며10,11), 특히 정자의 발생과정에서 생식세포들은 산화 스트레스에 민감한 반응을 보여 항산화 능력이 심각하게 저하될 경우 불임을 유발할 수 있다12).

최근 연구에서 세포 내에 산화적 스트레스 적용 시 많은 양의 반응성산소종(reactive oxygen species; ROS)을 생성하게 하고, 이는 Leydig 세포 내 세포막을 손상시켜, DNA 파괴 및 정자의 세포사멸(apoptosis)를 촉진시킨다13-15). 따라서, 고환 세포의 산화적 스트레스는 일반적으로 불임의 중요한 원인으로 작용하게 된다16). 이러한 Leydig 세포의 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하여, 고환의 기능을 회복시키기 위해 여러 연구들이 진행 중에 있다. 대부분의 환자들은 갱년기 및 성기능 장애에 치료적 접근으로 비수술적 방법을 선호하고 있으며, 제한적인 경우가 많아 한의학적 치료 접근에 대해 많은 연구가 필요한 시점이다. Testosterone의 분비가 부족한 경우 testosterone을 인위적으로 주입, 자연소재 물질을 성분으로 만든 약을 복용하게 하는 등의 방법이 있다17-18). 인체 방어기전으로는 항산화 효소에 의해 활성산소를 제거하는 항산화 방어체계 있는데 이러한 항산화효소에는 Superoxide dismutase, Catalase, Glutathione peroxidase 등이 있으며, 이러한 효소들은 대사과정에 의해 활성산소를 제거하고, 산화적 스트레스를 저하시키기 위해 그 생성이 증가하게 된다19). 최근 홍삼, 풍선덩굴 추출물이 남성 성호르몬 분비를 증가시킨다고 보고된바 있었으나, 아직 까지 Leydig 세포 내 산화적 관련 인자와 남성 호르몬 보호 효능에 대한 한약재 연구는 미흡하다20,21).

예로부터 오자(五子)는 복분자, 오미자, 구기자, 사상자, 토사자등 자(子)가 들어가는 5가지 약재를 말하며, 이러한 약재 모두 정력을 증강하는데 도움을 준다고 한다. 본 연구는 오자(五子) 중에 토사자 대신 결명자를 이용하여 연구에 사용하였다. 오자의 효능에 대해 丹溪心法에 “治男人精虛無子陽事不擧”라고 수록되었으며22), 이러한 5가지 열매는 腎陰과 腎陽의 부족으로 인한 음손양허(陰損陽虛), 양위조설(陽痿早泄), 남자무사(男子無嗣) 등의 치료에 활용되어 왔다23). 이전의 연구보고에 의하면 五子衍宗丸을 투여 시 흰쥐에서 성호르몬을 증가및 항피로 효과를 나타내었다고 보고되었다24). 이에 오자(五子)가 남성호르몬 합성 및 성기능 저하에도 효능이 있을 것으로 기대하고 그 효과를 규명하기 위하여 오자 혼합추출물을 세포에 처리하여, 세포생존율, nitrite, c-GMP와 testosterone 함량의 활성에 미치는 영향을 관찰하여 오자(五子)의 효능에 대해 알아보고자 하였다.

 

재료 및 방법

1. 시료의 추출

본 연구에 사용된 오자(五子)는 국내산(화순전남생약농업협동조합)으로 복분자, 오미자, 구기자, 사상자, 결명자의 배합비를 2: 2.5 : 2 : 0.5 : 3으로 선정하였다. 전체 1 ㎏을 증류수 5,000 ㎖을 가하여 넣고 환류 냉각기를 장치한 후 95∼100℃ 수욕조에서 12시간 동안 온탕 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치로 농축하고, 이를 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조하여 오자(五子) 열수추출물 36.4 g을 얻었다. 얻어진 열수추출물을 냉동(-80℃) 보관하면서 실험에 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.

2. 세포배양

실험에 사용된 세포주는 TM3(Leydig‘s cell, mouse)로서 America Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 구입하였다. 이 세포주는 고환 내 간질조직(interstitial tissue)에 있는 Leydig cell에 속한다. Leydig cell line은 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 ㎍/㎖), streptomycin(100 ㎍/㎖)이 첨가된 DMEM 배지로 배양되었다. Leydig cell은 75 ㎠ flask(Falcon, USA)에서 충분히 증식된 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(PBS) 용액으로 2회 씻어준 후 50 ㎖ flask 당 1 ㎖의 0.25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid 용액을 넣고 실온에서 1 분간 처리한 다음 trypsin 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착 하여 계대 배양하였다. 탈착된 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 10 ㎖ 부유시킨 다음 새로운 배양용기(50 ㎖ culture flask)에 옮겨 1：20의 split ratio로 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.

3. 세포생존율(MTT assay) 측정

오자(五子)가 Leydig cell의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 Mosmann25) 등의 방법을 응용하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) assay를 이용하여 다음과 같이 실험하였다. 96 well plate에 1 × 105 cells/㎖의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37°C, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 PBS 용액으로 처리하였다. 이후 PBS에 녹인 각각의 시료 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 μg/㎖와 FBS, free DMEM에 녹인 100 μM H2O2을 각각의 well에 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 이후, PBS로 세척한 후 PBS에 녹인 5 ㎎/㎖ MTT 20 ㎕와 FBS free DMEM 200 ㎕을 각 well에 처리한 후 빛을 차단 후 동일한 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후 배양액을 제거하고, DMSO(dimethyl sulfoxide)를 100 μl 처리한 후 37°C에서 2 시간 방치 후 microplate reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 다음 공식으로 계산되었다.

AC: absorbance of control, AT: absorbance of tested extract solution

4. 산화질소(Nitric oxide assay) 측정

96-well plate에 1×106 cells/well의 세포를 넣고 37℃ 5% CO2의 조건으로 12시간 배양하여 농도별로 시료를 처리 후 24시간 배양한 후 배지를 회수하여 NO를 측정하였다. 즉 회수된 배지 100 ㎕를 96-well plate에 넣은 후 nitrate reductase cofactor와 nitrate reductase mixture를 첨가하여, 1시간 반응시킨 후 각 well에 4℃에 저장된 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylenthylenediamine dihydrochloride, 2% phosphoric acid)를 첨가하여 최종 반응액을 실온에서 약 10분간 방치하여 발색을 유도하였으며, 540 ㎚에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다26).

5. 테스토스테론(Testosterone) 측정

Hydrogen peroxide와 시료를 처리한 Leydig cell line에서 testosterone level를 enzyme immunoassay kit(assay designs, USA)를 사용하여 측정하였다. 6 well plate에 1 × 106 cells/ml의 cell을 넣고 37°C, 5% CO2 incubator에서 24 시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 PBS 용액으로 처리하였다. PBS에 처리 후 각각의 시료를 농도별 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml와 FBS free DMEM에 녹인 200 μM H2O2을 각각의 well에 동시처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배지 100 μl를 goat anti-mouse IgG microtiter plate(assay designs, USA)에 옮긴다. 그런 다음, testosterone EIA antibody를 첨가 후 1 시간 배양 후 washing 용액으로 세척하였다. 세척 후 stop solution 첨가한 후 반응을 중지하고 405 ㎚에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정한다.

6. 통계처리

실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 21.0 ver. for WindowsⓇ을 사용하였다. 각 측정 시간 및 농도에 따른 군간 유의성 검정은 Student's t-test를 통해 유의성을 분석하였으며, 분석 시 유의수준은 α<0.05로 설정하여 검정하였다.

 

결 과

1. 세포생존율 측정

TM3 cell에 선정한 5가지 복분자, 오미자, 구기자, 사상자, 결명자의 배합비를 2: 2.5 : 2 : 0.5 : 3으로 하여, 오자가 TM3 cell의 성장 및 증식에 미치는 영향을 측정하기 위하여 추출한 오자 추출액의 0 ㎍, 1 ㎍, 10 ㎍, 50 ㎍, 100 ㎍/㎖의 농도별 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 측정하였다. 오자 추출물 0 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도에서 100.00±0.00%, 130.10±16.81%, 133.50±21.18%, 123.84±11.14%, 123.25±11.26%로 세포 생존율이 농도의존적으로 증가하였다(p<0.05)(Fig. 1).

Fig. 1.Effect of water extract of Oja on Leydig TM3 cells. Values were represented as Mean±S.D. *P<0.05 was stsatically significant as determined by indepoendent sample t-test for the mean values different from the control group.

2. H2O2로 유도한 세포독성 억제효과

Leydig TM3 cells에 대한 cell viability 결과에 근거하여 hydrogen peroxide에 의해 유도되어진 세포생존율을 측정하였다. Hydrogen peroxide는 0 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM 농도에 대해 24시간 처리 후 측정하였으며, Leydig TM3 cells에서 99.75±0.61%, 104.53±8.16%, 98.75±12.07%, 94.21± 12.46%, 79.13±8.88%, 76.93±4.89%로 세포 생존율이 농도의존적으로 감소하였으며, 0 μM에 비해 50과 100 μM에서 산화적 스트레스 유도 시 한 감소를 보여 세포 독성을 나타냄을 알 수 있었다(p<0.05)(Fig. 2). 100 μM Hydrogen peroxide에 의해 산화적 스트레스를 유도한 TM3 세포에 대한 오자 추출물을 1, 10, 50, 100 ㎍/㎖을 24시간 처리하여 cell viability을 측정하였다. 99.74±1.11%, 76.93±4.89 %, 80.19±10.20 %, 79.97±6.41 %, 97.03±8.88%, 105.65±7.52%로 Hydrogen peroxide에 의해 유도된 세포독성에 대해 오자 50 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖ 처리 군에서 세포 독성 억제 효과가 나타났다(p<0.05)(Fig. 3).

Fig. 2.The change of cell viability by various concentration of hydrogen peroxide in TM3 cells. Values were represented as Mean±S.D. *P<0.05 was statically significant as determined by independent samplet-test for the mean values different from the control group.

Fig. 3.The protective effect of water extract of Oja on hydrogen peroxide-induced cytotoxicity in TM3 cells. Values were represented as Mean±S.D. *P<0.05 was statically significant as determined by independent sample t-test for the mean values different from the control group. **P<0.05 was statically significant as determined by independent sample t-test for the mean values different from the H2O2 treated group.

3. 산화질소(Nitric oxide) 합성에 미치는 영향

Leydig TM3 cells에 대해 세포 내 생성되는 산화질소의 양을 측정하였다. 산화적 스트레스 유도 시 세포 내 NO 생성이 3.88±0.59 μM에서 5.61±1.03 μM로 유의하게 증가하였다(p<0.05). 오자 열수추출물을 1, 10, 50, 100 ㎍/㎖ 첨가한 경우, 5.20±1.35 μM, 4.70±1.14 μM, 4.12±0.50 μM, 3.90±0.68 μM로 나타났으며, 특히 50μM과 100μM에서 NO 생성율이 유의하게 감소하였다(p<0.05)(Fig. 4).

Fig. 4.The change of nitric oxide concentration by various concentration of Oja water extract in TM3 cells. Values were represented as Mean±S.D. *P<0.05 was statically significant as determined by independent sample t-test for the mean values different from the control group.

4. TM3 cell의 testosterone level 변화

100 μM Hydrogen peroxide에 의해 산화적 스트레스를 유도한 TM3 세포에 대한 오자 추출물을 0, 1, 10, 50, 100 ㎍/㎖을 처리하여 testosterone level을 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 10.02±1.16 pg/㎖, 100 μM Hydrogen peroxide을 처리한 군에서는 7.40±1.00 pg/㎖으로 유의한 감소를 보였으며(p<0.05), 오자 1, 10, 50, 100 ㎍/㎖ 처리 시 7.78±1.27 pg/ml, 8.12±0.46 pg/ml, 9.91±1.41 pg/㎖, 11.74±2.06 pg/㎖으로 오자 처리한 군 중 50, 100 ㎍/㎖에서 유의하게 증가하였다(p<0.05)(Fig. 5).

Fig. 5.The change of testosterone concentration by various concentration of Oja water extract in TM3 cells. Values were represented as Mean±S.D. *P<0.05 was statically significant as determined by independent sample t-test for the mean values different from the control group.

 

고 찰

일반적으로 전통의학에 기반하여 성기능 장애 치료에 대한 약물이나 건강기능식품 개발에 주력하고 있는 실정이다. 갱년기 증상으로 인한 성기능 장애는 정신적 스트레스와도 밀접한 연관성이 있어, 한의학의 경우 신체적 요인과 정신적 요인까지 고려하는 특징으로 한의학적인 치료가 기존 양방의학에 비해 비수술적 방법으로 환자에게 접근하기가 더욱 용이할 것으로 사료되며27), 이에 성기능장에 대한 한의학적 체계적 연구가 적극적으로 이루어질 필요가 있다. 따라서 본 연구는 오자(五子)가 라이디히 세포 내 산화적스트레스에서 NO 제거와 testosterone 합성에 어떠한 영향이 있는지 검토하고자 하였다.

오자(五子)는 복분자, 오미자, 구기자, 토사자, 사상자, 여실자, 결명자 등의 자(子)로 끝나는 열매를 의미한다. 구성 약재인 복분자는 탄수화물, 유기산, 기타 미량 성분 등이 들어 있고, 유기산으로 는 Malic acid, Tartaric acid, Isocitric acid, Astragalin, Isoquercitrin 등이 들어 있으며, 비타민 C를 다량 함유하고 있다. 색소성분으로는 폴리페놀, 안토시아닌 등을 함유하고 있으며, 항암, 항산화, 항염 및 항비만 효과를 가지고 있다28,29).

오미자는 Schizandrin, Gomisin, Cirtric acid, Malic acid, β-chamigrene 등을 주요 성분으로 세포 내 염증 및 조직 손상을 개선하는 효과를 보이며30), 구기자는 bataine, Vitamin A, B, physalein, carotene, kukoamine A 등의 성분으로 항산화, 항균활성이 보고되었다31).

사상자는 Cnidioside, Cnidiol B, Torilin 등의 물질이 함유되어 있으며, 이는 혈관신생 억제 및 종양 성장을 억제하며, 5α-reductase 억제 효과도 보고되고 있다32). 결명자 Kaempferol, Linoleic acid, Emodin, Rubrofusarin, Cassiaside, Oleic acid, carotin 등이 함유되어 있으며, 항산화 효과 및 항균 효과 등이 보고되고 있다33,34).

고환 세포의 산화적 스트레스는 주로 노화, 염증, 방사선, 화학물질이나 독성물질 노출 등이 있으며, 스트레스성 물질은 혈구세포에 의해 생성될 수 있다35). 정자 형성장애 및 남성호르몬 합성 저하에 대해 고농도의 산화적 스트레스와 관련이 있고, 특히 반응성 산소종의 경우 정자의 질이나 생존에도 영향을 미쳐 남성불임의 원인이 될 수 있으며, 산화적 스트레스로 인해 seminal plasma의 염증반응에도 정자형성에 장애를 가져온다36). 본 연구에서도 산화적 스트레스를 유도 시 남성호르몬의 합성이 감소 되는 것을 확인할 수 있었다. 비정상적인 정자의 기능에 대한 증거로, 고환 내 superoxide(O2-), hydroxyl radical(·OH), peroxyl radical(RO-2), hydrogen peroxide(H2O2)의 농도가 높을수록 세포에 손상을 주며, 이러한 물질들이 많을수록 고환 내 세포 노화를 촉진한다37). 또한 최근 고환 내 Caspase 활성화 역시 사정된 정자의 활성도를 감소하는데 관여하는 것으로 나타났다. Nitric Oxide(NO)는 세포막을 쉽게 확산하여 다른 활성산소들과 반응할 수 있는데, 특히 superoxide(․O2-)과 쉽게 반응하여 반응성이 매우 높은 산화제인 peroxynitrite (ONOO-)를 생성한다고 알려져 있다. 오자환은 peroxynitrite(ONOO-) 및 그 전구체인 superoxideanion radical(․O2-)와 NO를 소거시켜 세포를 보호하는 효과를 나타내었으며38), 복분자추출물이 항산화 효과와 관련하여, 간 손상에 있어서도 간보호 효과를 나타낸다고 보고된 바 있다39). 본 연구에서 산화적 스트레스로 유도된 NO의 생성량이 오자(五子) 추출물 처리 시 유의하게 감소하였으며, 이러한 결과는 오자(五子) 추출물이 고환 내 레이디히 세포의 산화적스트레스를 억제 하는 것으로 보여지며, 이러한 산화적 스트레스 억제로 인해, 세포내 호르몬 합성량이 증가됨을 관찰할 수 있었다. 오자(五子) 관련 연구에서, 오자지황음자를 노화 쥐에게 투여한 결과 인체 내 활성산소 생성과 SOD와 catalase를 억제하여, 항산화 효과가 있다고 보고하였다40).

남성갱년기 개선 관련하여 임상에서 치료적으로 조절할 수 있는 약재를 많이 탐색 하고 있으며, 본 연구 결과로 볼 때 라이디히 세포의 산화적 손상에 대해 오자(五子) 추출물이 고환 내 세포의 산화적 손상에서 NO 생성 조절을 통해 테스토스테론 합성을 증가시키는 것으로 생각되어진다. 따라서, 오자(五子) 추출물이 남성 고환내 정자 형성 및 호르몬 대사 기전에 어떤 영향을 주는지는 알아봄으로서 남성 갱년기 개선 관련 소재 개발에 도움이 될 것으로 사료된다.

 

결 론

본 연구는 오자(五子) 추출물을 대상으로 in vitro에서의 남성호르몬 합성 효과를 다음과 같이 확인하였다. 오자는 TM3 세포의 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았으나, 산화적 스트레스 시에 생존율의 유의한 감소를 나타내었다. 이러한 산화적 스트레스에서 오자는 세포 보호 효과를 나타내었으며, 또한 오자(五子) 추출물은 라이디히 세포의 산화적 손상으로 인한 NO 생성을 유의하게 억제하며, 남성호르몬의 합성을 증가시키는 효과를 나타내었다. 이상의 결과들은 오자(五子)의 효능 평가를 위한 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 이와 같은 결과는 향후 오자(五子) 추출물을 이용한 남성 갱년기 개선을 위한 연구의 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.