재료 및 방법
실험재료 − 본 실험을 위해 2013년 6월 25일~7월 15일에 국내 3개의 골프장으로부터 잔디 예지물을 제공받았다. 한국잔디 중지 예지물은 경기 남부지역 한 골프장의 페어웨이 깎기 작업 직후 수거하여 실내에서 5~7일 건조한 후 분석에 사용하였다. 고려지 예지물은 경남 소재 골프장 페어웨이 깎기 작업 후 제공받았다. 크리핑 벤트그래스와 켄터키 블루그래스 예지물은 경기 중남부에 있는 골프장의 그린과 티잉그라운드 깎기 후 같은 방법으로 채취하여 분석에 사용하였으며 모든 샘플은 시비와 약제 살포 3~5일 이후 채취되었다. 각 잔디는 제일모직(주) 식물환경연구소 태현숙 박사님의 식물학적 동정을 받았다.
추출물의 조제 − 건조된 4종의 잔디 예지물 각 10 g을 메탄올로 환류냉각 추출 후 진공 농축하여 Zoysia japonica(1.25 g), Zoysia matella(2.1 g), Agrostis palustris(1.31 g)과 Poa pratensis(1.39 g)의 메탄올 추출물을 각각 얻어 실험에 사용 하였다.
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) Radical 소거능 측정 − Ethanol에 녹인 시료 100 μl와 60 μM DPPH 용액 100 μl를 96-well plate에 혼합하여 30분간 실온에 방치시킨후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 free radical 소거효과를 백분율(%)로 나타내었다.20)
Hydroxyl Radical(·OH) 소거능 측정 − Fenton 반응에 따라 10 mM FeSO4H2O-EDTA에 10 mM의 2-deoxyribose solution과 시료를 농도별로 처리한 후, 10 mM의 H2O2를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이 혼합액에 2.8% trichloroacetic acid와 1.0% thiobarbituric acid solution을 각각 첨가하여 20분간 끓이고 식힌 후 490 nm에서 흡광도를 측정 하였다.21)
세포 종류 및 시약 − AGS human gastric adenocarcinoma cell과 RAW 264.7 macrophage cell은 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였고, 배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)과 Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI-1640), fetal bovine serum(FBS), trypsin EDTA 용액은 WelGENE(Gunsan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 항염증 활성 측정을 위한 lipopolysaccharide(LPS), Griess reagent, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,3-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma Chemical Co.(Saint Louis, Missouri, USA)로부터 구입 하였다.
세포 배양 − AGS cell과 RAW 264.7 cell은 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10% FBS가 함유된 RPMI와 DMEM을 각각 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 1~2일에 한번 배양액을 바꾸어 주면서 배양하여 세포분화가 최대에 도달하였을 때 phosphate buffered saline으로 세포를 세척한 후 0.05% trypsin과 0.02% EDTA 혼합액으로 부착된 세포를 분리한 뒤 원심분리 하여 세포를 모은 다음 세포와 배지를 잘 혼합하여 계대배양 하였다.
Cell Viability 측정 − AGS cell과 RAW 264.7 cell이 confluence상태가 되면 24-well plate에 5×104 cells/ml로 seeding하여 2~4시간 37℃에서 배양한 후 세포가 잘 부착되면, AGS cell은 TG 추출물 처리 후 48시간을 배양한다. RAW 264.7 cell은 TG 추출물을 24시간 처리한 후 내독소인 LPS를 처리하였다. 24시간 뒤, 50 μg/ml의 MTT solution을 각 well에 주입하여 37℃에서 4시간 동안 재배양한 후 생성된 formazan 결정을 빛을 차단한 상태에서 DMSO에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정 하였다.22)
NO 생성 측정 − NO 생성량은 Griess reagent를 이용하여 세포 배양 상층액에 존재하는 nitrite의 양을 측정하여 이를 근거로 NO의 생성을 확인하였다. RAW 264.7 cell을 24-well plate에 5×104 cells/ml로 seeding한 뒤 TG 분획물을 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 내독소인 LPS를 24시간 처리한 뒤 상층액 100 μl와 Griess reagent 100 μl의 동량을 섞어 540 nm에서 흡광도를 측정 하였다.
항균 활성 측정 − Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Helicobactor pylori에 대한 TG 추출물의 항균활성을 디스크 확산법을 이용하여 측정하였다. Trypticase soy agar 와 Brucella agar 배지에 각각 E. coli, S. aureus와 H. pylori 균액 100 μl를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 disc paper(ϕ8 mm, Advantec, Japan)를 올리고 시료를 disc paper에 흡수시킨 후, 37℃의 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 다음, 디스크 주위의 생육 저해환(clear zone) 생성 유무를 확인하였다.23)
통계분석 − 대조군과 각 시료들로부터 얻은 실험 결과들은 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험 결과로부터 ANOVA(analysis of variance)를 구한 후 Duncan’s multiple test를 이용하여 각 군의 평균 간의 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
본 연구에서는 잔디 예지물 4종에 대한 항산화, 항균, 항암, 항염증 활성을 측정하여 천연 기능성 소재로서의 사용가능성을 검토하였다. DPPH는 안정한 radical을 가지고 있는 수용성 물질로, 항산화능이 있는 물질에게 전자를 내어 주면서 radical이 소멸되고 고유의 짙은 자색이 없어진다. 비교적 안정적이고 간단하며 재현성이 높아 인체 내의 활성산소에 의한 노화를 억제하는 척도로 널리 사용되는 radical 소거능 측정방법으로 알려져 있다.24) 4가지 TG 추출물을 대상으로 항산화 활성을 알아보기 위하여 DPPH radical 소거 효과를 살펴본 결과, 100 μg/ml의 처리 농도에서 TG-1과 -2는 30%이상의 DPPH radical 소거 효과를 보였고, 그 중 TG-2가 39.41%로 가장 높은 소거효과를 나타내었다(Table I). 유해산소는 DNA에 변이를 일으키는 것 외에도 스트레스 유전인자를 발현시켜 종양의 성장과 진행을 유도하는데, 특히 ·OH radical은 활성 산소종 중에서 가장 독성이 강하고 반응성이 높아 세포와 조직을 쉽게 공격 한다.25) TG 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리하여 ·OH 소거 효과를 살펴본 결과(Table II), 모두 80%이상의 높은 ·OH 소거능을 나타내었고, 특히 TG-1은 90.40%의 가장 높은 소거 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Xu 등(2013)의 연구에서 Zoysia grass가 주요 항산화 효소인 superoxide dismutase, peroxidase와 catalase의 활성을 증가시켜 산화적 스트레스 부터 보호하는 작용을 한다는 보고와 일치하였으며,26) TG-1이 TG-3보다 지질과산화 억제 및 항산화 효소 활성이 높다는 보고와 비슷한 결과를 나타내었다.27,28) 따라서 TG-1과 TG-2가 다른 추출물에 비해 상대적으로 높은 radical 소거능을 보이는 것으로 나타나 항산화 작용에 기여하는 물질이 존재하는 것으로 생각된다.
Table I.1)Ascorbic acid was used as a positive control. Values are mean±SD. a-cMeans with the different letters are significantly different(P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
Table II.1)Ascorbic acid was used as a positive control. Values are mean±SD. a-dMeans with the different letters are significantly different(P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
Table III에서는 15 μg/30 μl와 30 μg/30 μl의 농도로 4종의 TG 추출물을 24시간 동안 처리하여 E. coli, S. aureus와 H. pylori에 대한 항균활성을 측정한 결과를 나타내었다. Disc 확산법을 통해 그람 음성균 중 하나인 E. coli에 대한 4종의 TG 추출물을 처리하여 나타난 생육 억제환은 15 μg/30 μl 농도에서 모두 11 mm를 나타내었고, 30 μg/30 μl 농도에서는 12 mm의 생육 억제환을 나타내어 TG는 E. coli의 생육을 억제하는 항균 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 반면, 대표적 그람 양성균인 S. aureus에 대한 항균활성을 측정한 결과, 15 μg/30 μl 농도에서 TG-4가 10 mm의 억제환을 나타냈으며, 30 μg/30 μl에서 TG-1, TG-2와 TG-4가 각각 13, 12와 12 mm의 생육 억제환을 나타내어 TG-1과 TG-4는 S. aureus에 대한 항균활성이 상대적으로 높은 것을 알 수 있었다. 위염 및 위암 발생의 원인으로 잘 알려진 H. pylori의 항균활성을 측정한 결과, 4가지의 TG 추출물 모두 15 μg/30 μl 농도에서는 효과가 나타나지 않았으나 30 μg/30 μl의 농도에서 TG-1은 9 mm의 생육 억제환을 나타내어 H. pylori에 대한 항균활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 TG-1은 상대적으로 E. coli, S. aureus와 H. pylori에 대한 항균 효과가 높은 것을 알 수 있었으며, 이는 식품에 대한 항균 소재로서 유용하게 활용될 가능성을 가진다고 판단된다.
Table III.1)−: no growth 2)Penicillin was used as a positive control.
AGS 위암 세포에서 TG 추출물의 세포 증식 억제 효과를 MTT assay를 통하여 검토하였다. MTT는 살아있는 세포에서 물에 녹지 않는 자주색의 formazan crystal로 환원되는데, 이 crystal을 DMSO로 녹여 생성된 양을 흡광도로 측정하는 방법으로, 암 기초연구에서 널리 사용되는 방법 중의 하나이다.29) 100 μg/ml 농도의 TG 추출물을 위암 세포에 처리하여 증식 억제 활성을 살펴본 결과, 4개의 TG 추출물 중 TG-4는 15.01%의 상대적으로 낮은 위암 세포 증식 억제 활성을 나타낸 반면 TG-1은 35.21%로 2배 이상의 위암 세포 성장 억제율을 나타내었으며(Table IV), 앞서 언급한 H. pylori균에 대한 항균활성도 가장 높아 TG-1은 항암활성 물질이 존재할 것으로 추정 되어진다.
Table IV.1)5-FU (10 μg/ml) was used as a positive control. Values are mean±SD. a-dMeans with the different letters are significantly different(P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
대식세포(macrophage)는 외부자극으로부터 항상성을 유지하는 것으로 알려져 있으며 내독소로 알려져 있는 LPS가 대식세포를 자극하게 되면 inducible nitric oxide synthase가 L-arginine으로부터 발현되어 nitric oxide(NO)를 생성한다.30) 또한, 활성화된 대식세포는 tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6, interleukin-1β와 같은 pro-inflammatory cytokines의 증가를 촉진시켜 염증매개물질인 NO와 prostaglandin 등을 분비하고,31) 과다의 NO는 세포 독성 및 조직 손상을 일으켜 염증을 심화시킨다.32) 따라서 본 연구에서는 RAW 264.7 macrophage cell에 LPS를 처리한 후 100 μg/ml 농도의 TG 추출물을 처리하여 세포 생존율과 NO 생성율을 통해 염증 억제효과를 살펴보았다. Table V에 나타난 바와 같이 LPS가 내독소로 작용하여 모든 군에서 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았으나 control군 100% 대비 normal군에서 35.50%의 NO 생성율이 나타난 반면, 4가지의 TG 추출물을 처리한 군에서는 50-59%의 NO 생성율을 나타내어 TG 추출물은 LPS에 대한 NO의 생성을 억제하는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히, TG-1는 50.67%의 가장 낮은 NO 생성율을 보여 상대적으로 염증 반응 억제효과가 높은 것을 알 수 있었다.
Table V.1)AMT (10 μg/ml) was used as a positive control. Values are mean±SD. a-dMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
잔디 예지물의 항산화, 항균, 항암 및 항염증 활성이 우수한 것은 잔디 추출물에 다양한 폴리페놀 및 phytochemical이 존재하기 때문인 것으로 생각되며,33-35) 한국 잔디의 기능성 소재로써의 이용도가 크게 증가할 것으로 기대된다.
결 론
본 연구에서는 국내·외 잔디 예지물의 항산화, 항균, 항암 및 항염증 활성을 in vitro와 cellular system을 통하여 알아보았다. 4가지 TG 추출물 중에서 한국잔디류의 들잔디(TG-1)는 radical 소거 능력이 우수하고, E. coli, S. aureus와 H. pylori에 대한 생육 억제환이 가장 크게 나타났다. 또한, AGS cell에 대한 세포 생장 억제율이 가장 높았으며, RAW 264.7 cell에서 LPS에 대한 NO 생성율이 가장 낮아 다른 종류의 잔디보다 생리활성이 더 우수하다고 판단된다.