Development of Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) for Detection of Vibrio alginolyticus

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)법을 이용한 Vibrio alginolyticus의 신속 진단법 개발

Abstract

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), a PCR-based diagnostic method, is based on autocycling strand displacement DNA synthesis in the presence of exonuclease-negative Bst DNA polymerase under isothermal conditions. With the help of four specific primers that recognize six different sequences of a target DNA, LAMP has high specificity in pathogenic identification in a short time. Hence, in the present study, LAMP is used as a diagnostic tool in the identification of the most dreadful aquatic pathogenic species, Vibrio alginolyticus, and to develop species-specific LAMP primers and optimization of LAMP reaction conditions such as annealing temperature, elongation time, and other PCR chemical concentrations, including MgSO₄, dNTPs, Betaine, and Bst polymerase. The optimized LAMP primers were also checked for specificity with other Vibrio species, which showed that the designed primers were very specific to V. alginolyticus After the first introduction of a species name like this one, the first part (“Vibrio” in this case) should be abbreviated to only the first letter.only. These are usually the most harmful pathogens of the Vibrio species that appear in shrimp and crabs. The results also revealed that the LAMP assay could be 10-fold more sensitive than conventional PCR in detecting V. alginolyticus. This could be the first report on using a rapid and highly sensitive technique, the LAMP assay, in the effective diagnosis of the pathogenic bacteria V. alginolyticus, which could help in the early detection of diseases, particularly in aquaculture.

LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification)법은 PCR를 기반으로 등온에서 autocycling 가닥 변위 DNA 합성에 의존하며, Bst polymerase를 사용하여 진단하는 방법이다. 이것은 대상 DNA의 여섯 개의 배열을 인식하는 4개의 특정 primer의 도움을 받아 단시간 안에 병원체를 식별하는 높은 특이성을 지니고 있다. 본 연구에서는 LAMP로 수생에서 위험한 병원체인 Vibrio alginolyticus의 특별한 LAMP primer를 제작하였으며, 신속한 진단을 위해 MgSO₄, dNTP, Betaine, Bst polymerase의 최적 반응 조건의 특이성 및 기존의 PCR보다 10배 정도의 민감하다는 것을 확인하였다. 또한, 디자인 되어진 LAMP primer가 다른 Vibrio 종들 중 오직 V. alginolyticus에서만 반응한 것을 확인 할 수 있었다. 본 논문에서는 병원체 세균인 V. alginolyticus의 빠르고 민감한 효과적인 진단으로 양식 질병들을 조기에 발견할 수 있도록 개발하였다.

서 론

Vibrio 종은 보통 새우(Litopenaeus vannamei)나 게(Craps)류에 나타나는 가장 해로운 병원체로 알려져 있으며, 양식 산업에 있어 막대한 경제적 손실을 일으킨다[5, 10]. 그 중 Vibrio alginolyticus는 호염성 세균으로 고농도의 염분을 필요로 하며, 그람 음성 세균으로 알려져 있다[2, 4, 11, 12]. 인체에는 귀에 염증을 일으킨다고 보고 되어져 있으며, 수중에서는 기회감염성 병원체로 높은 사망률의 원인이다[1, 8]. 이것은 초기 해양에서 Vibrio parahaemolyticus와 유사한 세균으로 발견되었으나, 많은 연구로 인해 V. alginolyticus로 명명되었다[3]. 어류내 주요 증상은 체색흑화, 궤양 및 체표의 발적으로 알려져 있다[6]. 이러한 병원체는 수산 양식 발전에 있어 해를 끼치고 있으며, 생물공학적 지식이 부족한 양식 어민들에게 있어 난해한 점이 많다. 따라서, 양식 어민들이 쉽게 적용할 수 있도록 감수성 및 특이성을 지닌 분자 진단학적 방법인 Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)를 접목시켰다. LAMP는 2사슬 DNA, 4개의 primer, DNA polymerase 기질 등을 동일 용기에 넣어 일정온도(섭씨 약 65℃) 하에서 증폭에서 검출까지 원스텝으로 실시할 수 있다[8]. 따라서 본 연구에서는 신속하고 높은 정확성 및 간편성을 갖춘 분자기법 중 하나인 LAMP를 이용하여 해산 어류 양식어종 중 가장 많은 비중을 차지하는 넙치의 세균성 질병인 Vibrio alginolyticus 신속진단법을 개발하고자 하였다.

 

재료 및 방법

시험균주

실험에 사용된 표준 균주는 한국미생물보존센터 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에서 분양 받았다. 본 실험에서는 Vibro alginolyticus KCCM 40513과 Vibrio campbellii KCCM 40864, Vibrio furnisii KCCM 41679, Vibrio icthyoenteri KCCM 40870, Vibrio fluvialis KCCM 40827, Vibrio harvey KCCM 40866, Vibrio vulnificus KCCM 41665, Vibrio cholerae KCCM 41626을 사용하였다. 각각의 균주는 MB(Marine Broth, Difco., USA)와 TSB (Tryptic Soy Broth, Difco., USA)에 배양조건에 따라 24시간 배양하였다.

DNA 추출

각각의 균주는 MB와 TSB를 사용하여 배양조건에 따라 Vibrio alginolyticus 외 8균주의 DNA는 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer., USA)를 사용하여 추출하였다. 각각의 균주는 MB와 TSB를 사용하여 배양 조건에 따라서 24시간 동안 배양시켰다. 다음 1.5 ml e-tube에 배양액 0.5 ml 넣어 12,000 rpm으로 5분간 원심 분리시켜 침전되어진 균체를 회수하였다. 실험은 제작사의 지시에 따라 진행하였다. Lysozyme 0.04 ml (10 mg/ml) 첨가하고 37℃, 1시간 동안 반응시키고 80℃에서 10분간 반응시켜 정지 후, 진행하였다. TL (Tissue Lysis buffer) 0.2 ml, Proteinase K 0.02 ml 넣고 votexing 후, 60℃에서 1시간 동안 반응 시키고, GC (Binding buffer) 0.2 ml 넣고 60℃에서 10분 동안 반응 시켰다. 다음 Isopropanol 0.1 ml 첨가시킨 후, Binding column tube (2 ml tube)에 옮겨 8,000 rpm에 1분간 원심분리 시킨 후, Binding을 새로운 Binding column tube (2 ml tube)로 옮긴 후 W1 (Washing buffer 1)을 첨가하여 8,000 rpm 1분간 원심분리 하고 W2 (Washing buffer 2) 0.5 ml 첨가 후 8,000 rpm 1분간 원심분리 시켰다. 그리고 완벽한 washing을 위해 12,000 rpm에 1분간 원심분리 후 Binding column (1.5 ml tube)에 옮기고, EL (Elution buffer) 0.2 ml 첨가 한 후, 상온에서 1분간 반응 시킨 뒤, 8,000 rpm에서 1분간 원심분리 하였다(Bioneer., USA). 분리 되어진 DNA 는 −20℃에 저장하고 실험에 사용하였다.

LAMP primer 제작

LAMP 분석을 위해 Vibrio alginolyticus의 sigma 인자인 rpos gene (Genbank accession number: FJ358498.1)을 template sequence로 사용하여 LAMP primer designing software인 primer Explorer (https://www.primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)를 이용하여 V. alginolyticus 특이 LAMP용 primer를 디자인 하였다[9]. 4개로 구성되어진 primer set은 대상 sequence의 특정 6개의 영역을 인지하는 outer primer와 inner primer로 이루어져 있다. LAMP의 FIP primer sequence는 loop를 형성하는 부위인 TTTT spacer로 합하여 제작되었다. BIP primer도 마찬가지로 V. alginolyticus sequence의 상보적 염기서열을 sequence의 TTTT spacer 부위로 합하여 제작하였다. 또한 F3과 B3 primer는 inner primer의 바깥쪽으로 각각 위치하도록 설계하였다. 이 primer들은 Bioneer사(Korea)에 주문 의뢰하여 제작하여 나타내었다(Fig. 1).

Fig. 1.The partial nucleotide sequence of sigma factor (rpos) gene of V. alginolyticus (GenBank accession number FJ358498.1) used for the LAMP primer design. Nucleotide sequences used for primer design are indicated by boxes and arrows.

PCR primer 제작 및 PCR

PCR primer는 V. alginolyticus 표준 균주의 rpos 유전자 Sequence의 서열을 이용하여 제작하였다(Fig. 2). PCR을 수행하기 위해 primer는 각각 20 pM과 AccuPower PCR premix (1 U Taq DNA polymerase, 250 μm dNTP, 10 mM Tris-HCI, 40 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, stabilizer and tracking dye : Bioneer., USA), template genomic DNA genomic DNA, 총 볼륨 0.02 ml 반응액을 조성하였다[7]. initial denature 94℃에서 5분, denature 94℃ 30초, annealing 50℃ 30초, extension 72℃ 1분으로 총 30 cycle로 반응 시킨 후 last extension 72℃에서 5분간 진행시켰다[9]. 이후 산물은 1×TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (Bioneer, USA)가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동을 실시하여 UV illumination상에서 관찰하였다.

Fig. 2.The partial nucleotide sequence of sigma factor (rpoX) gene of V. alginolyticus (GenBank accession number FJ358498.1) used for the PCR primer design.

LAMP법의 최적 반응 온도 확립

V. alginolyticus-LAMP의 특이적 검출을 위하여 반응 최적 온도를 확인하고자 하였다. 반응액의 조성은 20 pM F3와 B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genomic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment (New England biolabs, Berverly, MA), 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI (pH8.8), 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.4% Triton X-100, New England biolabs, Beverly, MA), 400 μM dNTP (TaKaRa Biotechnology co., Ltd), 1 M Betaine (Sigma-Aldrich Corporation, USA), 6 mM MgSO4 (New England biolabs, Beverly, MA), Distilled water (negative control)로 총 0.025 ml의 반응액이었다[7]. Bst DNA polymerase large fragment는 80℃이상의 온도에서는 불활성을 나타내므로 먼저 95℃에서 5분간 해리시켜 얼음에 넣은 후, 따로 첨가시켰다. 다음 DNA 변형합성을 1시간 동안 진행시키고, 80℃에서 10분간 반응시켜 종료하였다. DNA 변형 합성의 최적 온도 측정은 45.0~70.0℃ 로 지정하여 각각의 등온 조건하에 실시하였다(Fig. 3). 각 LAMP 반응이 끝난 후, 증폭 산물들은 1× TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (Bioneer, USA)가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용한 전기영동 50 V에서 40분간 진행시킨 뒤, UV illumination상에서 관찰하였다.

Fig. 3.Optimum temperature of the LAMP reaction for detection of V. alginolyticus. Lane 1, DNA template in the reaction, amplification at 45℃; Lane 2, amplification at 50℃; Lane 3, amplification at 55℃; Lane 4, amplification at 60℃; Lane 5, amplification at 65℃; Lane 6, amplification at 70℃; Lanes M, 100 bp DNA Marker (Intron biotechnology, Inc., Korea)

LAMP법의 최적 반응 시간 확립

V. alginolyticus-LAMP의 빠른 진단을 위해 검출에 필요한 최소 반응 시간을 확인하였다. 조성은 20 pM F3, B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genomic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment, 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI(pH 8.8), 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.4 % Triton X - 100, New England biolabs, Beverly, MA), 400 μm dNTP, 1 M Betaine, 6 mM MgSO4, Distilled water (negative control)로 총 0.025 ml의 반응액을 조성하였다[7]. 95℃에서 5분간 해리 후, Bst DNA polymerase large fragment를 첨가하여 반응액의 polymerization 시간을 100분, 80분, 60분, 40분, 20분, 0분으로 조절하였다(Fig. 4). 증폭 된 산물은 1× TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer (Bioneer, USA)가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용한 전기영동 50 V에서 40분간 진행시킨 뒤, UV illumination상에서 관찰하였다.

Fig. 4.Optimum time of the LAMP reaction for detection of V. alginolyticus. Lane 1, DNA template in the reaction, amplification at 0 min; Lane 2, amplification at 20 min; Lane 3, amplification at 40 min; Lane 4, amplification at 60 min; Lane 5, amplification at 80 min; Lane 6, amplification at 100 min; Lanes M, 100 bp DNA Marker (Intron biotechnology, Inc., Korea)

LAMP법의 최적 반응 조건 확립

V. alginolyticus-LAMP의 최적 반응액 조건을 확인하였다. dNTP의 농도는 각각 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 600 mM을 첨가하여 조성함으로써 최적 반응 조건을 확인하였고, Betaine 경우에는 0 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.4 M을 첨가하여 조성하였다. 또한 Mg++의 농도는 0 mM, 4 mM, 8 mM, 12 mM, 16 mM, 18 mM을 조성하였고 Bst DNA polymerase는 4 U, 8 U, 12 U, 16 U, 20 U을 첨가하여 최적 반응 조건을 확립하였다[7].

LAMP법과 PCR법 검출 한계치 비교

V. alginolyticus를 사용하여 MB에서 30℃에서 48시간 배양한 배양액을 연속적으로 희석하여 1.0×101~108 cfu/ml의 농도로 조정하였다. 각 배양액과 희석액에서 1 ml을 취하여 DNA를 분리하고 LAMP와 PCR법을 수행하여 검출 한계 값을 비교하였다[7].

 

결 과

LAMP법의 최적 반응 온도 확립

최적 반응 온도 확립을 위하여 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃에서 1시간 동안 각기 등온 조건하에 LAMP를 수행하였으며, 각 반응들이 끝나고 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, 55℃~65℃의 범위에서 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). LAMP 반응 산물은 전기영동상에서 몇몇의 각기 다른 크기의 DNA band로 나타나는데, LAMP 산물이 몇몇의 inverted-repeat 구조를 구성하기 때문이다[9]. 따라서 LAMP법에 의한 DNA 증폭은 PCR법에 의한 증폭이 특이 DNA band를 나타내는 것과 달리 ladder와 같은 pattern으로 나타난다. 최적 반응 온도는 반복실험을 통하여 63℃로 측정되었다.

LAMP법의 최적 반응 시간 확립

LAMP의 최단 반응 시간을 측정하기 위하여 Bst DNA polymerase를 첨가하여 63℃에서 각각 반응액의 polymerization 시간을 100분, 80분, 60분, 40분, 20분, 0분간 반응 시킨 뒤, 전기영동을 통해 확인하였고 그 결과 최소 40분 이상의 반응 뒤에 전기영동을 통하여 DNA 신장을 확인할 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 5.Optimum deoxynucleotide triphosphate (dNTP) concentration of the LAMP reaction for detection of V. alginolyticus. Lane 1, 0 mM dNTP; Lane 2, 100 mM dNTP; Lane 3, 200 mM dNTP; Lane 4, 300 mM dNTP; Lane 5, 400 mM dNTP; Lane 6, 500 mM dNTP; Lanes M, 100 bp DNA Marker (Intron biotechnology, Inc., Korea)

LAMP법의 최적 반응 조건 확립

V. alginolyticus-LAMP의 최적 반응조건을 확립하기 위하여 dNTP, MgSO4, betaine, Bst DNA polymerase의 최적 농도를 구하였다. dNTP의 최적 농도를 확립하기 위하여 각 반응액에 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM의 dNTP를 첨가하여 LAMP를 수행하였고 산물들은 전기영동을 통하여 비교하였다. 그 결과 dNTP의 양이 400 mM에서 500 mM일 때, DNA 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6). MgSO4의 각 반응액에 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM의 MgSO4를 첨가하여 LAMP를 수행하고 산물들은 전기영동을 통하여 비교하였다. 그 결과, 2 mM에서 6 mM일 때 DNA 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 이는 과량의 MgSO4는 LAMP 반응을 저해한다는 것을 확인할 수 있었고 최종적인 농도를 4 mM로 결정하였다(Fig. 7).

Fig. 6.Optimum MgSO4 concentration of the LAMP reaction for detection of V. alginolyticus. Lane 1, 0 mM MgSO4; Lane 2, 2 mM MgSO4; Lane 3, 4 mM MgSO4; Lane 4, 6 mM MgSO4; Lane 5, 8 mM MgSO4; Lane 6, 10 mM MgSO4; Lanes M, 100 bp DNA Marker (Intron biotechnology, Inc., Korea)

Fig. 7.Optimum betaine concentration of the LAMP reaction for detection of V. alginolyticus. Lane 1, 0.0 M betaine; Lane 2, 0.4 M betaine; Lane 3, 0.6 M betaine; Lane 4, 0.8 M betaine; Lane 5, 1.0 mM betaine; Lane 6, 1.4 mM betaine; Lanes M, 100 bp DNA Marker (Intron biotechnology, Inc., Korea)

betaine의 최적 농도 확립을 위하여 각각 0.0 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.4 M을 첨가하여 LAMP를 수행하였다. 그 결과 농도가 짙을수록 ladder pattern이 다양해지는 것을 확인할 수 있었다. 최종적으로 1.0 M betaine을 최적 농도로 결정하였다(Fig. 8). Bst DNA polymerase 최적 농도를 8 U으로 결정하였다(Fig. 9). 따라서 LAMP를 위한 최적 반응 조건으로 총 25 μl를 기준으로 각각 400 μM dNTP, 4 mM MgSO4, 1 M beatine, 8 U Bst DNA polymerase를 LAMP 표준 조건으로 결정하였다.

Fig. 8.Optimum Bst polymerase concentration of the LAMP reaction for detection of V. alginolyticus. Lane 1, 4 U Bst polymerase; Lane 2, 8 U Bst polymerase; Lane 3, 12 U Bst polymerase; Lane 4, 16 U Bst polymerase; Lane 5, 20 U Bst polymerase; Lanes M, 100 bp DNA Marker (Intron biotechnology, Inc., Korea)

Fig. 9.Sensitivity of V. alginolyticus identification by LAMP and conventional PCR. (A) LAMP products (B) conventional PCR products. Lane 1, 1.0×101 CFU/ml; Lane 2, 1.0×102 CFU/ml; Lane 3, 1.0×103 CFU/ml; Lane 4, 1.0×104 CFU/ml; Lane 5, 1.0×105 CFU/ml; Lane 6, 1.0×106 CFU/ml; Lane 7, 1.0×107 CFU/ml; Lane 8, 1.0×108 CFU/ml; Lanes M, 100 bp DNA Marker (Intron biotechnology, Inc., Korea).

LAMP법과 PCR법의 민감도 확인

최적 조건 확립 후 LAMP 검출법의 민감도는 V. alginolyticus 배양액을 연속적으로 희석시켜 1.0×101~1.0×108 CFU/ml의 농도로 조정하여 Bioneer사 Genomic DNA Extraction Kit로 DNA을 추출하여 LAMP와 PCR법의 검출 한계 값을 비교하였다. LAMP 검출 한계 측정 결과 1.0×101 CFU/ml 까지 LAMP를 통해 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. 일반 PCR의 경우 1.0×102 CFU/ml 까지 검출한계를 확인하였다(Fig. 10). 따라서, LAMP 검출법이 일반 PCR법 보다 더 높은 검출한계를 가지며 민감도가 100배 정도 더 높은 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 10.Specificity of rpoS gene for the LAMP detection of V. alginolyticus. Lane 1, Vibrio campbellii KCCM 40864; Lane 2, Vibrio furnisii KCCM 41679; Lane 3, Vibrio icthyoenteri KCCM 40870; Lane 4, Vibiro fluvialis KCCM 40827; Lane 5, Vibrio harvey KCCM 40866; Lane 6, Vibrio alginolyticus KCCM 40513; Lane 7, Vibrio vulnificus KCCM 41665; Lane 8, Vibrio cholerae KCCM 41626; Lanes M, 100 bp DNA Marker (Intron biotechnology, Inc., Korea).

LAMP법 특이도 확인

최적 조건 확립 후 LAMP 검출법을 특이도 V. alginolyticus 표준 균주와 Vibrio종 7개를 사용해 LAMP 검출법의 특이도를 확인하였다. 전기영동을 통하여 확인한 결과, V. alginolyticus 균주는 양성반응을 보였으나, 음성 지표균은 모두 음성반응을 나타내었다. 따라서 LAMP 검출법의 종 특이적인 밴드가 검출되어 특이도가 높은 검출법임을 알 수 있었다(Fig. 11).

 

고 찰

LAMP법은 Bst DNA polymerase를 사용하는 실험방법이다. Bst DNA polymerase는 기존의 중합효소 연쇄반응에 사용되어지는 Taq DNA polymerase와는 달리 5′-3′ exonuclease의 성격을 갖고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 접합 및 신장을 수행한다[9]. 본 연구에서는 V. alginolyticus의 진단 방법으로 LAMP법을 사용하였다. 최적 반응 온도 결과에서는 55~65℃의 범위에서 신장되는 것을 확인하였다. 최단 반응 시간을 측정하기 위해 100분~0분까지 반응 시간을 두고 반응시킨 결과 40분 이상의 반응 뒤에 LAMP 특이 pattern을 확인 할 수 있었다. 최적 반응액 조성에서 dNTP 반응 조건에서는 400 μM에서 500 μM일 때, DNA 신장이 가장 잘 이루어 졌으며, MgSO4 농도에서는 2 mM에서 6 mM 일 때, betaine 최적 농도는 1.0 M, Bst DNA polymerase의 최적농도는 8 U으로 결정되었다.

최종적으로 최적 반응 온도 63 ℃, 반응 시간 80분, dNTP 400 μM, MgSO4 4 mM, betaine 1.0 M, 8 U Bst DNA polymerase을 최적 조건으로 결정하였다. 최적 조건 확립 후 LAMP 검출법을 적용한 민감도와 특이도 실험결과를 살펴 보면 V. alginolyticus와 Vibrio 종 7개 비교 실험한 결과 V. alginolyticus만 종 특이적인 검출이 되어 특이도가 높은 검출법임을 알 수 있었다. LAMP 검출법과 일반 PCR 법의 민감도를 비교해 본 결과 LAMP 검출법의 V. alginolyticus 검출 한계는 101 CFU/ml이었으나 일반 PCR의 경우 102 CFU/ml까지 검출 한계를 갖기에 LAMP 검출법이 일반 PCR법 보다 더 높은 검출 한계를 가지며 민감도가 100배 정도 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 소요 시간에서 PCR법은 3시간 이상 소요되지만 LAMP법은 2시간 이내에 신속한 검출이 가능하였다.

따라서, 본 연구에서 개발한 LAMP 검출법이 다른 분자생물학적 검출법보다 특이도 및 민감도가 매우 높고 신속하고 간편한 진단법으로 실용적이며 잠재적인 가치가 있다고 사료되어진다.