대장암세포주 HT29에서의 Treculia africana 추출물의 항산화 및 항암 활성 분석

Anti-oxidative and Anti-cancer Activities of Treculia africana Extract in Human Colon Adenocarcinoma HT29 Cells

Abstract

Treculia africana Decne는 빵나무종으로 뽕나무과, Treculia 속에 속하는 식물로서, 이 식물의 다양한 부위에서 추출한 물질은 항염증, 항균등의 효과를 가지고 있어 백일해의 치료등 다양한 질환에서 민간요법으로 사용되어 왔다. 하지만 정확한 생리활성에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 T. africana Decne 메탄올추출물(META)을 사용하여 항산화능 및 인체 대장암 세포주인 HT29에 대한 항암활성에 관하여 분석하였다. DPPH radical scavenging activity를 통해 분석한 결과, META의 IC₅₀가 4.53 μg/ml로 강력한 항산화능을 보유하 였음을 확인하였다. 또한 META 처리에 의해 HT29의 생존율이 감소함과 더불어 IC₅₀가 66.41 μg/ml로 강력한 세포사멸효과를 나타냈다. META 처리에 의해 HT29의 subG1 세포비율 및 Annexin V⁺ 세포의 비율이 증가하고, DAPI로 염색된 apoptotic body가 증가하였다. 또한 apoptosis 관련 단백질인 Fas, Bax, cytochrome c의 발현이 증가하였으며, 이는 caspase 3, 8, 9를 활성화 시켜 최종적으로 PARP가 분해되어 apoptosis가 유도되었음을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 META는 강한 항산화 활성과, 대장암세포에서 apoptosis 유도에 의한 높은 항암활성을 보유한 물질임을 확인하였다.

Treculia africana Decne, a breadfruit species, is native to many parts of West and Tropical Africa. The breadfruit belongs to the family Moraceae and is one of the four members of the genera Treculia. The crude extract of T. africana has been used in folk medicine as an anti-inflammatory agent for various ailments, such as whooping cough. In this study, we evaluated the anti-oxidative and anti-cancer activities of the methanol extract of T. africana Decne (META) and the molecular mechanisms of its anti-cancer effects in human colon carcinoma HT29 cells. The META exhibited anti-oxidative activity through a DPPH radical scavenging capacity and inhibited cell growth in a dose-dependent manner in HT29 cells. META treatment induced apoptosis of HT29 cells, showing an increase in the percentage of both SubG1 cells and Annexin V-positive cells and the formation of apoptotic bodies in a dose-dependent manner. META-mediated apoptosis was associated with the up-regulation of the death receptor FAS and Bax and a decrease in the Bcl-2 expression. META-treated HT29 cells also showed the release of cytochrome c from the mitochondria into the cytosol, activation of caspase-3, caspase-8, and caspase-9, and proteolytic cleavage of poly ADP-ribose polymerase (PARP). These findings suggest META may exert an anti-cancer effect in HT29 cells by inducing apoptosis through both intrinsic and extrinsic pathways.

서 론

우리나라 통계청에서 발표한 2012년 사망원인통계 자료에 의하면 3대 사망원인은 암, 심장 질환, 뇌혈관 질환으로 총사 망자의 47.1%를 차지하고, 그 중 암은 30.4%로 가장 높은 사망률을 나타낸다고 보고하였다. 특히 2011년 암등록 통계에 따르면 대장암은 서구사회에서 높은 암 발병률과 이로 인한 사망률로 인해 전체 암 중에서 3위를 차지할 정도로, 일반적으로 ‘선진국형’ 암으로 인식되어 왔으나 우리나라에서도 점차 생활방식이 서구화 됨에 따라 대장암의 발병률이 점차 늘어가고 있다. 따라서 대장암의 발병 요인에는 유전적 요인 뿐 아니라, 서구화되는 식생활과 스트레스, 불규칙한 생활습관 등 환경적요인 또한 크게 작용하는 것으로 생각된다[12, 31, 33]. 또한 대장암은 다른 암들에 비해 초기증상을 찾기 힘들어 발병에 앞서 예방이 필요한 것으로 사료된다[21, 29, 30]. 이러한 대장암의 치료방법으로는 수술요법, 방사선요법, 면역요법, 화학요법이 주로 사용되고 있으나, 현재의 화학요법은 암세포 외에 정상세포까지 파괴시키는 부작용을 가진다. 따라서 최근에는 암세포 특이적 독성을 가지며 부작용이 적은 천연물질을 찾고자 하는 노력이 계속 시도되고 있으며, 암의 치료와 예방에 효과적인 새로운 신약개발을 위한 다양한 분자기전 연구가 활발히 이루어지고 있다[4, 25].

활성산소는 Superoxide(1O2-), hydroxy radical(·OH), 과산화수소수(H2O2) 등, 산소를 포함하고 있는 화학적으로 높은 반응성을 지닌 물질을 일컬으며, 생체 내에서 일어나는 대사과정 중 발생된다[2]. 대부분의 활성산소는 생체 내의 항산화 방어체계에 의해 분해가 되나, 방어체계의 균형이 깨지는 경우, 생체 내 활성산소가 축적되고 이때 축적된 활성 산소로 인한 산화적 스트레스는 세포 구성 성분인 DNA, 단백질 등에 대한 비선택적, 비가역적인 파괴 작용을 하여 암을 비롯한 각종 질병 및 노화의 주원인이 된다고 알려져 있다[3]. 따라서 다양한 생리활성 특히 항암활성을 보유하는 후보 소재의 항산화능 보유 유무의 확인은 매우 중요하다.

Apoptosis는 세포자멸사라고도 불리며, 세포가 여러 요인들에 노출되었을 때 손상된 세포의 제거를 위하여 사용되는 과정으로, 이러한 apoptosis 과정에 이상이 생기면 세포의 암화가 유도된다. 따라서 암세포 제거를 위한 전략 중 하나로 암세포의 apoptosis 유도에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔다[9, 11, 27]. Apoptosis는 세포 위축에 의한 염색질의 응축, apoptotic body 형성 및 DNA 단편화 등의 특징을 보이며, 미토콘드리아를 통한 내인성 경로(intrinsic pathway)와 사멸 수용체를 통하는 외인성 경로(extrinsic pathway)의 두 가지 경로를 통해 유도된다[7, 22, 32]. 이러한 apoptosis는 세포 내 pro-apoptotic Bcl-2 family의 활성화, pro-caspase의 분절에 의한 활성화 및 poly ADP-ribose polymerase (PARP)의 단편화 등 다양한 관련 분자에 의하여 조절된다. 특히 caspases는 세포질내에 존재하는 cysteine proteases의 종에 속하는 단백질로서, 정상적으로 증식 중인 세포에서는 pro-enzyme 형태로 존재하다가 apoptosis 유도 신호에 의해 내인성과 외인성의 경로를 통해 활성화되고, 세포 내 존재하는 PARP등과 같은 표적 단백질에 관여하여 apoptosis의 실행에 중요한 역할을 담당한다[14, 17, 19, 36]. 따라서 최근에는 apoptosis 유도에 의한 항암활성을 보유한 다양한 범위의 식물 추출물 또는 식물로부터 분리한 성분물질들의 분자기전에 관하여 활발하게 연구되고 있다.

Treculia africana Decne는 빵나무종으로 뽕나무과, Treculia 속에 속하는 식물로서 열대지방의 아프리카의 서부쪽에 많이 자란다. 이 식물의 다양한 부위에서 추출한 물질은 항염증, 항균등의 효과를 가지고 있어 백일해의 치료등 다양한 질환에서 민간요법으로 사용되어왔다[1, 28]. 하지만 정확한 생리활성에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 T. africana Decne의 메탄올 추출물을 사용하여 항산화능 및 인체 대장암세포주인 HT29에 대한 항암활성에 관하여 분석하였다.

 

재료 및 방법

시료 준비

Treculia africana Decne 메탄올 추출물(Methanol extracts of Treculia africana Decne, META)은 한국생명공학연구원, 해외생물소재 허브센터에서 구입(분양번호; FBM117-096)하여 사용하였으며, methyl alcohol 95.0% GR급을 사용하여 45℃에서 sonicator를 이용하여 3일 동안 반복하여 추출하고 농축후 동결 건조시킨 시료로서 100 mg/ml 농도로 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해하여 -20℃에서 보관하고 세포에 처리 전 배지에 희석하여 사용하였다.

DPPH radical 소거 활성 측정을 통한 항산화능 분석

전자공여능은 항산화작용의 지표로 사용되고 있으며 식물추출물의 항산화능 측정에 많이 사용되고 있다. 전자공여작용 은 인체 내에서 생성되는 프리라디칼의 전자를 공여하여 프리라디칼에 의한 노화와 질병을 억제하는 작용으로 이용되고 있다. 전자공여능 측정은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거법을 이용하여 측정하였다. DPPH는 비교적 안정 한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 식물체의 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기때문에 많이 이용되고 있는 방법이다[13].

META를 농도별(0.51-12.8 μg/ml)로 메탄올에 녹여 준비한 후 96 well plate에 메탄올에 용해된 1.5×10-4 M DPPH 40 μl와 각 시료 160 μl를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시킨 후, microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 free radical 소거활성을 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(IC50)를 계산하였다. 양성 대조군으로는 대표적인 항산화제인 ascorbic acid를 사용하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다. 억제능의 백분율 공식은 다음과 같다.

DPPH radical scavenging activity (%)={1-(A-B)/C}×100 A: sample absorbance 520nm B: color control absorbance 520nm C: control absorbance 520nm

세포배양

본 연구에 사용한 인체 대장암 세포주 HT29, 폐암 세포주 A549, 간암 세포주 HepG2 및 인간 정상 신장세포 HEK293, 마우스 지방전구세포 3T3-L1은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.

암세포 사멸 효과분석

수용성의 tetrazolium salt (WST, water soluble tetrazolium salt)를 이용한 dehydrogenase assay를 이용하여 META에 대한 세포독성을 측정하였다. 3-5×104 cell의 HT29, A549, HepG2, HEK293 및 3T3-L1 세포를 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 다음, 추출물을 농도별로 처리하고 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 이때 대조군은 0.1% DMSO를 처리하 였다. 48시간 배양 후 WST assay reagent (Daeillab, Seoul, Korea)를 well당 500 μl 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복실험을 하여 그에 대한 평균값으로 나타내었으며, 본 실험결과를 바탕으로 이후 적정 처리 농도를 결정하였다.

세포주기변화 분석

HT29 세포에서 META의 세포주기에 미치는 영향을 알아보기 위하여, HT29 세포에 META를 농도 별로 처리한 다음 CycleTEST™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포주기변화를 분석하였다. 먼저 6-well plate에 HT29 세포를 5×105 cell의 농도로 분주하여 부착시킨 후, 추출물들을 다양한 농도로 처리하였다. 48시간 배양 후 세포를 회수하고 PBS로 세척한 다음, ribonuclease A를 실온에서 10분간 처리하고 propidium iodide (PI) 용액을 첨가하여 4℃에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 Flow cytometry(Cell Lab Quanta SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

Annexin Ⅴ 염색에 의한 Apoptosis 관찰

META 처리에 따른 HT29의 apoptosis 유도를 관찰하기 위하여, HT29 세포에 농도 별로 추출물들을 처리한 다음 Muse™ Annexin V & Dead Cell Kit (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 염색하였다. 먼저 6-well plate에 HT29 세포를 5×105 cell의 농도로 분주하여 부착시킨 후, META를 다양한 농도로 처리하였다. 48시간 배양 후 세포를 회수하고 Muse™ Annexin V & Dead reagent 100 μl를 첨가하여 실온에서 20분간 반응한 다음, Muse™ Cell Analyzer (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)로 분석하였다.

DAPI 염색에 의한 핵의 형태변화 관찰

META를 처리한 HT29 세포를 회수하여 cytospin (Thermo scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 슬라이드 위에 부착시키고 4% formaldehyde 용액으로 상온에서 10분간 고정한 다음, PBS로 세척 후 0.5% triton X-100으로 상온에서 10분간 permeabilization 시켰다. PBS로 3회 세척한 다음 1 μg/ml의 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액을 이용하여 염색하였다. 차광한 상태로 상온에서 20분간 염색한 다음, PBS로 세척 후 Anti-fade mounting 용액을 사용하여 mounting하고, 형광현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 200배 배율로 핵의 형태변화를 관찰하고 Axio Vision Program을 이용하여 촬영하였다.

Apoptosis 관련 단백질 발현 분석

META의 항암 활성 기전을 밝히기 위해 apoptosis 조절에 관여하는 단백질 발현을 Western blot hybridization으로 분석하였다. 농도별로 META를 처리한 HT29 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후, lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF]를 첨가하여 4℃에서 15분간 반응시킨 다음 sonication 한 후 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 또한 Cytosolic 단백질 추출을 위해서는 sonication 단계를 제외하고 진행하였다[18]. 추출한 단백질의 농도를 Bradford assay로 결정한 후 30 µg의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 항체와 hybridization하였다. Membrane washing 후 Horse radish peroxidase (HRP)가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 적용시킨 다음 chemiluminescence detection system(FluoChem® FC2; AlphaInnotech, San Leandro, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. Fas, FaDD, Bcl-2, Cytochrome c, Capase-3, -8, -9, 및 actin의 일차항체와 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse 등 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였으며, PARP, Bax의 일차항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

통계분석

모든 결과는 mean ± SD (Standard deviation)로 나타내었으며, 분석된 실험 데이터의 통계적 유의성은 대조군과 각 시료처리군의 실험데이터로부터 Student’s t test를 통하여 검증하였다.

 

결과 및 고찰

항산화능 분석

활성산소는 노화, 암, 관절염 등에 직 간접적으로 생체 장애를 일으키는 원인으로 잘 알려져 있으며, 항암활성을 포함한 다양한 생리활성 후보소재의 항산화능의 보유 유무의 확인은 매우 중요하다[3]. 따라서 META의 항산화능을 DPPH radical scavenging activity 측정을 통해 분석하였다. 그 결과 Table 1에 제시한 바와 같이 META의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 억제능이 0.51 μg/ml에서는 25.02%, 2.56 μg/ ml에서는 41.67% 그리고 12.8 μg/ml에서는 96.14%까지 억제시키는 것을 확인하였다. 또한 억제능 50%일 때의 META의 농도(IC50)는 4.53 μg/ml, 양성 대조군인 ascorbic acid의 IC50는 1.61 μg/ml로서 양성대조군과 비교하였을 때, 단일물질이 아닌 여러 물질이 섞여있는 추출물인 것을 감안하면 매우 강력한 항산화 활성을 지니는 것을 알 수 있었다.

Table 1.DPPH radical scavenging activity by methanol extract of Treculia africana Decne

암세포 생존율에 미치는 META의 영향

META가 강력한 항산화 활성을 지니는 것을 확인하였으므로 다음으로 암세포에 대한 사멸효과를 보이는 지 알아보았 다. META를 다양한 암세포, 인체 대장암 세포 HT29, 폐암세포 A549 및 간암세포 HepG2에 처리하였을 경우, 암세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 추출물을 처리한 후 WST assay를 사용하여 세포사멸 효과를 확인하였다. 그 결과 Fig. 1A에 제시한 바와 같이 HT29 세포에서는 50 μg/ml의 META 처리시 뚜렷한 사멸효과를 보였으며, A549 세포와 HepG2 세포는 200 μg/ml의 META 처리시 사멸효과를 보여 암세포에 따라 사멸효과의 정도가 다름을 알 수 있었다. 반면 정상세포인 3T3-L1과 HEK293 세포에서는 추출물의 독성이 거의 없음을 확인하였다. 또한 Fig. 1B에서 보는 바와 같이 A549 세포와 HepG2 세포의 경우 META의 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것을 볼 수 있었으나 50% 사멸효과(IC50) 농도가 각각 217.87 μg/ml와 225.51 μg/ml로 사멸효과가 HT29 세포에 비해 크지 않았다. 반면 HT29 세포의 경우, META 처리농도 25 μg/ml에서부터 세포증식이 억제되었으며, 66.41 μg/ml에서는 50% 사멸효과(IC50)를 보여 세 종류의 암세포주 중 가장 강력한 세포사멸효과를 보였다. 따라서 이 후 실험에는 HT29 세포를 사용하여 META의 항암활성 기전 분석을 수행하였다.

Fig. 1.Effect of META on cell growth in various cancer cell lines. (A) Human colon carcinoma HT29 cells, human lung carcinoma A549 cells, human hepatocellular carcinoma HepG2 cells, human embryonic kidney HEK293 cells and mouse preadipocyte 3T3-L1 cells were treated with various concentrations of META for 48 hr. Cytotoxic effect of META was determined by WST assay. Results are expressed as percentage of the vehicle treated control ± SD of three independent experiments. *, p<0.05, **, p<0.005 compared with DMSO treated cells. (B) IC50 values of human cancer cells are shown.

HT29의 세포형태에 미치는 META의 영향

HT29 세포에 META를 농도별로 처리한 후 세포의 형태 변화를 유도하는 지 확인하기 위하여 위상차 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, Fig. 2에서와 같이 META의 처리 농도에 따라 세포사멸효과에 의해 세포밀도가 점차 감소하였고, 50 μg/ml의 META를 처리하였을 때부터 점차적으로 세포 형태가 불규칙적으로 변하고, 무리를 이루어 자라는 형태가 단일세포형태로 변하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 다수의 부유세포가 관찰되었다. 이러한 결과로부터 META의 처리에 의해 HT29의 세포 형태에 변화가 일어남을 확인하였다.

Fig. 2.Morphological changes by META in HT29 cells. Cells were treated with indicated concentration of META for 48 hr, and then visualized by light microscopy. Magnification, ×100.

META가 HT29 세포의 세포주기에 미치는 영향

세포 주기 중 G1기 및 G2기의 checkpoint 자체의 이상 및 이를 조절하는 상류의 신호전달 시스템의 이상으로 인하여 암세포는 무한 증식이 일어난다[10, 23, 34]. 이러한 이론을 바탕으로 최근에는 암세포의 세포주기를 제어하는 신 물질들을 찾는 연구가 활발히 진행되고 있다[26]. 따라서 본 연구에서는 META 처리로 인하여 감소한 생존율의 이유를 세포주기 변화 분석을 통하여 찾고자 하였다.

HT29 세포에 META를 농도별로 처리한 후 PI 염색을 하여 세포주기의 변화를 Flow cytometry로 분석하였다. 그 결과, Fig. 3에서 보여지는 바와 같이, META 농도의존적으로 Sub G1기의 세포비율이 4.33%에서 27.73%로 증가되는 것을 확인하였다. 반면 대조군에서 16.78%였던 S기의 세포분포는 최고 농도인 200 μg/ml에서는 5.02%로 감소되었다. 또한 G2/M기의 세포비율은 대조군에서 11.63%였지만 점차적으로 감소하여 200 μg/ml의 META 처리시에는 5.11%로 감소되었다. 하지만 G1기는 농도변화에 따라 세포비율의 큰 변화는 없었으나 최고농도에서는 약간 감소하였다. 따라서 이와 같은 결과로부터 META에 의해 HT29 세포의 S기 및 G2/M기의 세포비율이 감소되면서 apoptosis 유발군인 subG1기의 세포분포가 증가됨을 알 수 있었다.

Fig. 3.Accumulation of SubG1-phased HT29 cells by META treatment. HT29 cells were cultured and treated with META for 48 hr. Cells were harvested, and then stained with propidium iodide for 10 min and analyzed by flow cytometry. DNA-fluorescence histogram (A) and quantitative data of cell distribution (B) are shown. M1, SubG1 phase; M2, G1 phase; M3, S phase; M4, G2/M phase.

META에 의한 Apoptosis 유도분석

Apoptosis가 유발된 세포에서는 초기에 세포막의 변화를 동반하여, 즉 세포막 점도의 감소, 유동성의 증가, 막 인지질의 비대칭성 소실로 정상적으로 지질 이중막의 내부막에 제한되어 존재하는 포스파티딜세린(PS)이 세포표면으로 노출된다[5, 24]. Annexin V는 이 PS에 친화적으로 결합하는 물질로서 apoptosis가 일어난 세포의 조기 표식자로 널리 사용되고 있다[16].

세포주기분석결과로부터 확인한 META 처리에 의한 SubG1 증가가 apoptosis와 직접 연관이 있는지 분석하기 위하여 Muse cell analysis를 이용하여 annexin V positive 세포의 빈도를 측정하였다. 그 결과 Fig. 4A에서 나타낸 바와 같이 대조군에서의 annexin V positive 세포는 4.35%였으나, META 처리에 의해 농도의존적으로 증가하여 최고농도인 100 µg/ml에서는 84.55%까지 증가하였다. Annexin V 염색결과는 정량화 하여 Fig. 4B에 도식화하였다. Fig. 4B에서 알 수 있듯이 살아있는 세포는 META 농도의존적으로 감소하고, 반면 apoptotic 세포는 점점 증가함을 볼 수 있었다. 특히 early apoptotic 세포(Annexin V+/7-AAD-)가 late apoptotic 세포의 수(Annexin V+ /7-AAD+)보다 더 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 이와 같은 결과는 META에 의해 세포막에 존재하는 포스파티딜세린(PS)이 세포표면으로 노출되었고 apoptosis가 일어났음을 나타낸다.

Fig. 4.Increase of early and late apoptotic cells in META-treated HT29 cells. HT29 cells were cultured and treated with META for 48 hr. Cells were harvested, and then stained with Muse™ Annexin V & Dead Cell Kit for 20 min and analyzed by Muse™ Cell Analyzer. (A) Dot plots represented four independent sections (UL: dead cells, UR: late apoptotic/dead cells, LL: live cells, LR: early apoptotic cells). The X axis shows the intensity of Annexin V fluorescence and the Y axis shows 7-AAD fluorescence. The percentage of each sections are shown in (B).

세포핵 형태 변화 분석

Apoptosis가 일어나면 nucleosome의 linker DNA 부분이 절단되어 단편화가 일어나고 이에 따른 염색질이 응축되어 apoptotic body가 생성되며, 이들은 염색시약에 의해 관찰 가능하다[35]. 앞서 Muse analysis를 통해 추출물의 처리에 따른 apoptotic cell수가 늘어남을 확인하였으므로, 좀더 정확히 세포 핵 내의 변화를 관찰하기 위하여 DAPI 염색을 실시하였다. HT29 세포에 추출물을 농도별로 처리한 다음 DAPI로 염색하고 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과 Fig. 5에서와 같이 0.1% DMSO를 처리한 대조군의 경우와 비교하여 보았을 때 시료 처리 농도가 증가할수록 핵 내 염색체가 농축된 apoptotic body가 증가함을 알 수 있었다.

Fig. 5.Apoptotic morphological changes of HT29 cells by META treatment. META-treated cells were fixed with 4% formaldehyde, permeabilized with 0.5% Triton X-100 and stained with DAPI for 20 min. Stained cells were observed by fluorescence microscopic analysis and imaged using Axio Vision Program. Arrows show the chromatin condensation of HT29 cells by META. Scale bar, 20 μm.

Apoptosis 관련 단백질 발현에 미치는 영향

여러 종류의 신호들이 Fas/APO1 (apoptosis inducing protein 1)과 종량괴사인자 수용체 1(TNFR1, tumor necrosis factor receptor 1)등과 같은 세포 표면의 수용체에 결합하여 apoptosis를 유발할 수 있는데, 이 수용체들은 caspase 효소를 활성화시킨다. caspase는 apoptosis 유발 신호에 의하여 활성화되어 많은 기질 단백질들을 분해함으로써 apoptosis 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[7, 15, 36]. 세포 내 균형이 깨어지고 Bcl-2 family 단백질들의 변화가 생기면 미토콘드리아 막의 전위가 변화되고, 내막에서 cytochrome c가 방출된다. 이는 주위에 있는 caspase-9를 활성화시키고 결국 caspase-9는 caspase-3을 활성화시키면서, 최종적으로 기질인 PARP 단백질이 분해되어 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다[6, 8].

따라서 세포사멸에 관련된 단백질들이 META 처리에 의해 어떤 변화가 있는지 Western blot analysis로 확인하였다. 그 결과 Fig. 6에서와 같이 death receptor인 Fas와 Bcl-2 family 중 pro-apoptotic 단백질인 Bax 단백질이 증가되었고, anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2가 감소되었다. 또한 이러한 단백질들의 변화에 맞추어 cytosolic cytochrome c가 증가됨에 따라 pro-caspase들이 활성화되어 cleaved caspase 3, 8, 9가 증가되었다. 이러한 변화로서 최종적으로 PARP가 분해되고 apoptosis가 일어남에 따라 세포사멸이 이루어짐을 확인하였다. 이러한 결과로부터 META는 미토콘드리아를 통한 내인성 경로(intrinsic pathway)와 사멸 수용체를 통하는 외인성 경로(extrinsic pathway)의 두 가지 경로를 통해 HT29의 apoptosis를 유도한다고 사료된다.

Fig. 6.Modulation of apoptosis-related protein expression in HT29 cells by META. HT29 cells were treated with various concentrations of META for 48 hr. The cellular and cytosolic proteins were then separated by SDS-PAGE, followed by Western blot analysis. Antibodies against FAS, FADD, Bcl-2, Bax and Cytochrome c (A) and against Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 and PARP (B) were used. Actin was used as an internal control.

우리나라 뿐만 아니라 전세계적으로 암 발병률과 사망률이 높아지고 있고, 이에 대해 일반 사람들의 관심도 높아지고 있 다. 하지만 암세포뿐만 아니라 정상세포까지 죽여 부작용이 많은 치료법이 주로 사용될 뿐 암세포에 대해 특이적으로 작 용할 수 있는 항암제가 극히 드물다. 또한 건강에 대한 관심이 늘어나면서 암 치료뿐 아니라 예방에 대한 관심도 높아짐에 따라 합성물질이 아닌 천연물질에서 항암효과가 큰 물질을 찾고자 하는 노력이 계속 시도 되고 있다. 최근에는 브로콜리와 배추에 함유되어있는 Glucosinolates가 암세포 분열을 억제하고 항염증 효과가 있음이 보고되었다[20]. 이와 같이 사람들이 주로 섭취하는 음식에서 뿐만 아니라 여러 자생식물에서 항암효과를 가진 성분을 찾는 연구가 계속되어지고 있다. 따라서 본 연구는 항암효과를 가진 소재 개발을 위해, 자생식물 중 Treculia africana Decne를 메탄올로 추출하여 항산화 효과 및 대장암 세포에 대한 항암기전을 분석하였으며, 그 결과 META가 HT29의 강력한 apoptosis를 유도하였고 이는 항암효과를 가진 소재의 개발을 위한 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다.