Organic Solvent Stable Lipase from Pseudomonas sp. BCNU 171

Pseudomonas sp. BCNU 171이 생산하는 유기용매 내성 리파아제

Abstract

An organic solvent stable lipase from solvent-tolerant Pseudomonas sp. BCNU 171 had an optimal pH of 8 and an optimal temperature of 37℃. This crude extracellular lipase from BCNU 171 exhibited increased stability in the presence of various types of solvents at high concentrations (25%, v/v). The lipase stability was found to be highest in the presence of xylene (137%), followed by toluene (131%), octane (130%), and butanol (104%). Overall, BCNU 171 lipase tended to be more stable than immobilized commercial lipase (Novozyme435) in the presence of organic solvents. Furthermore, BCNU 171 lipase maintained about 90% of its enzyme original activity in the presence of NH₄⁺, Na⁺, Ba²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, and Ca²⁺ion and significantly increased its enzyme activity in the presence of various emulsifying agents. Thus, the organic solvent stable lipase from Pseudomonas sp. BCNU 171 could be usable as a potential whole cell biocatalyst and for synthetic applications of enzymes for industrial chemical processes in organic solvents without using immobilization.

유기용매 내성 Pseudomonas sp. BCNU 171 균주가 생산하는 유기용매 내성 리파아제의 최적활성은 pH 8과 37℃로 나타났다. BCNU 171 균주가 생산하는 세포외 리파아제는 고농도의 다양한 유기용매하에서 안정성이 증가하는 것으로 나타났다. 리파아제의 안정성은 xylene (137%) 첨가시 가장 높은 것으로 확인되었고, toluene (131%), octane (130%) 그리고 butanol (104%) 순으로 안정성이 높은 것으로 나타났다. 전체적으로 대부분의 용매에서, 상용 고정화 효소(Novozyme 435)와 비교하여 효소안정성이 높은 것으로 나타났다. 나아가 NH₄⁺, Na⁺, Ba²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺및 Ca²⁺의 존재하에서 약 90%로 효소 안정성을 유지하였으며 다양한 유화제 첨가시에는 현저하게 안정성이 증가하였다. 그러므로 Pseudomonas sp. BCNU 171의 유기용매 내성 리파아제는 잠재성이 높은 whole cell 생물촉매로서 사용가능 할 것이며, 고정화 하지 않고도 유기용매에서의 공업적인 화학공정에서 효소를 이용한 합성에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

서 론

리파아제는 글리세롤과 장쇄 지방산의 ester 결합의 가수분해 및 합성을 촉매하는 효소로 식품, 화장품, 의약품, 바이오디젤 및 섬유화학산업 등 분야에서 다양한 응용이 가능하다. 특히 미생물 기원 리파아제는 유기용매에 대한 안정성, 넓은 기질 특이성, 높은 입체특이성 및 보조 인자를 요구하지 않는다는 점에서 생물공학적으로 잠재력이 뛰어나다[7]. 현재 다양한 생물공학 산업에서 사용되고 있는 리파아제의 70%는 진균과 세균 유래로, Candida rugosa, Thermomyces lanuginosus, Rhizomucor miehei, Burkholderia cepacia 및 Pseudomonas alcaligenes 리파아제 등은 세제, 식품 소재, 펄프 및 제지 산업 등에서[4, 6, 7], P. aeruginosa, B. cepacia, Bacillus subtilis, Achromobacter sp., Serratia marcescens 및 C. antarctica B 기원의 리파아제는 유기화학 관련 산업에서는 촉매제로 광범위하게 사용되고 있다[5, 12].

Pseudomonas sp. BCNU 171은 기연구에서 유기용매 내성 균주로 고농도의 benzene, toluene, ethylbenzene 및 xylene 등 유기용매에 내성이 뛰어남을 보고한 바 있다[2]. 따라서 본 연구에서는 Pseudomonas sp. BCNU 171 균주가 생산하는 리파아제의 whole cell 리파아제로서의 활용가능성을 알아보고자 다양한 유기용매와 금속이온에 대한 효소 안정성을 검토하여 보고하고자 한다.

 

재료 및 방법

리파아제 생성 확인

유기용매내성 세균Pseudomonas sp. BCNU 171의 리파아제 생성여부는 기질로서 동물성 지방인 tributyrin (1%, w/v)과 1.5% tween 80을 첨가한 LB agar배지에서 37℃, 3일 배양 후, 리파아제에 의해 기질이 분해되면서 생기는 투명환을 관찰함으로써 확인하였다.

조효소액 조제 및 리파아제 활성 측정

조효소액 조제는 LB broth 배지에 전배양한 균주를 접종하고 37℃에서 24시간 진탕 배양한 뒤, 15분간 원심분리(10,000 × g)하여 상층액을 membrane filter (0.22 μm)로 필터한 후 사용하였다. 리파아제의 활성은 Winkler와 Stuckmann의 방법을 참고하여, 조효소액 100 μl와 기질로 50 mM p-nitrophenyl palmitate (pNPP) 10 μl에 0.1 M Tris-HCl (pH 8) 완충액 900 μl를 첨가하고 37℃에서 5분간 반응시킨 후 410 nm에서 흡광도를 측정하였다[15]. Macroporous resin에 흡착되어 있는 상용 고정화 효소(CalB)인 Novozyme 435를 대조군으로 사용하여 비교하였으며[9], pNPP 에서 1분 동안 1 μmol의 p-nitrophenol (pNP)을 생산하는데 관여하는 효소의 양을 1 unit으로 하여 효소활성을 계산하였다.

pH 및 온도에 대한 리파아제의 안정성 조사

pH에 대한 안정성은 0.1 M sodium acetate, 0.1 M potassium phosphate 및 0.1 M Tris-HCl 완충액을 pH 4-10 범위로 조제하여 30분간 반응시킨 후 효소 활성을 측정하였고, 온도에 대한 안정성은 30-70℃ 범위의 온도조건에서 0.1 M Tris-HCl (pH 8) 완충액을 사용하여 반응 시킨 후 잔존 활성을 측정하였다.

유기용매 및 금속이온에 대한 리파아제의 안정성 조사

조효소액과 9종의 25% 유기용매를 각각 3:1 비율로 첨가하여 35℃에서 150 rpm으로 2시간 및 10일 반응시킨 후 잔존 효소활성을 확인함으로써 조사하였다[10]. 또한 조효소액에 1 mM 농도의12종의 금속이온, 6종의 유화제 및 킬레이트제를 각각 첨가하여 37℃에서 1시간 전반응시킨 뒤 pNPP를 첨가하고 5분간 반응시킨 후 잔존 효소활성을 측정하였다[8].

 

결과 및 고찰

유기용매 내성 리파아제를 생성하는 Pseudomonas sp.

고농도 toluene에 대한 내성이 뛰어난 Pseudomonas sp. BCNU 171은 LB agar 배지에서 toluene 분해 산물로 추정되는 형광의 노란색 물질을 생성하며 증식하였고, lipase 생성확인 배지에서 콜로니 주변에 투명환이 관찰되어 효소를 분비하는 것으로 확인되었다(Fig. 1).

Fig. 1.Photograph of Pseudomonas sp. BCNU 171 colonies on LB agar with toluene (A) and on LB agar with 1% tributyrin and 1.5% tween80 (B).

pH 및 온도에 대한 리파아제의 안정성

다양한 pH 범위에서 효소의 활성을 조사한 결과, pH 8일 때 5.87 U/ml로 활성이 가장 높게 나타났으며, pH 6-9에서도 상대활성이 80-90% 이상으로 높게 유지되었다. Novozyme 435 (1 mg/ml)는 pH 8에서 4.91 U/ml로 높은 활성을 보였으며, pH 7과 9에서 상대활성이 약 90%로 유지됨이 확인되었다(Fig. 2).

Fig. 2.Effect of pH on lipase stability (bar) and activity (line). The remainig activity was measured after incubation at 37℃ for 30 min with the substrate at various pH values. The remaining activity (5.87 U/ml) at pH 8 was taken as 100%.

또한 온도에 따른 효소 활성은 37℃에서 4.87 U/ml로 높게 나타났고, 50℃까지 상대활성이 90% 이상으로 유지되었다. Novozyme 435는 37℃에서 효소활성이 5.90 U/ml였으며, 30-50℃에서 90% 이상의 상대활성을 보였다(Fig. 3). Pseudomonas sp. BCNU 154와 Pseudomonas sp. LST-03은 37℃, pH 5-8 범위에서 효소 안정성이 높았으며[3, 10], Pseudomonas sp. M-37은 55℃, pH 9 [1], Pseudomonas sp. AG-8은 45℃, pH 8 [13] 조건에서 안정성이 높은 것으로 보고하였다. Pseudomonas sp. BCNU 171이 생산하는 유기용매 내성 리파아제는 pH 5-9로 넓은 범위에서 상업화된 효소보다 안정하였으며, 37℃와 50℃에서 안정성이 유지되는 것으로 나타났다.

Fig. 3.Effect of temperature on lipase stability (bar) and activity (line). The remainig activity was easured after incubated with the substrate at various temperatures for 30 min in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8). The remaining activity (4.87 U/ml) at 37℃ was taken as 100%.

유기용매 및 금속이온에 대한 리파아제의 안정성

25%의 toluene, octane, butanol 및 xylene을 첨가했을 때 용매를 넣지 않은 대조군에 비해 크게는 136%까지 효소 안정성이 증가하였으며, 9 종의 유기용매에 대해 80% 이상 안정성이 유지되는 것으로 나타났다. Novozyme 435는 4종의 유기용매를 첨가했을 때 110% 전후로 안정성이 증가하였지만 BCNU 171에 비해 대체로 안정성이 떨어지는 것으로 조사되었다(Fig. 4).

Fig. 4.Effects of various organic solvents (25%, v/v) on lipase stability. Lipase stability was tested by measuring the residual enzymatic activity after incubation in the presence of organic solvents in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) for 2 hr. The lipase activity in a non-organic solvent condition was taken as control (100%).

Pseudomonas sp. BCNU 171은 BCNU 154 리파아제와 유사하게 toluene 및 xylene에서 안정성이 높았으며, BCNU 154에 비해 다양한 유기용매에서 안정적이었다[3]. 한편 Pseudomonas sp. S5는 1-octanol 및 cyclohexane 을 첨가하고 30분 반응시 안정성이 유지되었으나, 2시간 반응시에는 효소의 안정성이 떨어지는 것으로 보고되었다[11]. 이에 비해 BCNU 171이 생산하는 리파아제는 toluene과 octane을 첨가한 뒤 10일 동안 배양한 뒤에도 100% 이상으로 효소 안정성을 유지하고 있는 것으로 확인되었다(Fig. 5). 따라서 다양한 유기용매 존재하에서 안정성이 증가하거나 대체로 영향을 받지 않는 것으로 확인됨으로써 비수계 반응을 요하는 산업공정에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 5.Effects of various organic solvents (25%, v/v) on the lipase stability. Lipase stability was tested by measuring the residual enzymatic activity after incubation of enzyme in the presence of organic solvents in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) for 10 days. The lipase activity in a non-organic solvent condition was taken as control (100%).

또한 BCNU 171 리파아제는 NH4+과 Na+을 첨가했을 때 110% 이상으로 효소 안정성이 증가하였고, Ba2+, Hg2+, Ni2+, Cu2+및 Ca2+등에서는 89% 이상 안정성을 유지하였으며, 6종의 유화제 및 킬레이트제를 첨가했을 때는 약 110-190%로 효소 안정성이 증가하였다(Table 1). Pseudomonas sp. BCNU 154, Pseudomonas sp. AG-8 [13] 및 Pseudomonas sp. TK-3가 생산하는 리파아제는 Ca2+과 Mg2+이 첨가된 반응에서 안정성이 증가되었으며, 그 외의 전이 금속이온에서는 강하게 저해받는 것으로 나타났다[14]. BCNU 171이 생산하는 리파아제는 다양한 전이금속과 유화제 존재하에서 효소 안정성이 증가하거나 80% 이상으로 유지하는 것으로 확인되었다.

Table 1.Effect of various metal ions and emulsifying agents on the lipase stability

이상의 결과에서 Pseudomonas sp. BCNU 171 균주가 분비하는 리파아제는Novozyme 435와 비교하여 다양한 pH 범위, 유기용매, 금속이온 및 유화제에서 효소 안정성을 유지하여 잠재적인 whole cell 리파아제로서의 가능성을 확인하였다. 따라서 추가적인 실험을 통해 최적생산조건을 검토하고 안정성과 반응성을 확보한다면 순수 리파아제 분리 및 고정화하지 않고도 환경, 정밀화학 및 바이오디젤 등 광범위한 산업공정에서 응용될 수 있을 것이다.