Ethanol Extracts of Citrus Peel Inhibits Adipogenesis through AMPK Signaling Pathway in 3T3-L1 Preadipocytes

진피 에탄올 추출물의 AMPK signaling pathway를 통한 3T3-L1 지방전구세포의 adipogenesis 억제에 관한 연구

Abstract

Citrus peel (CP) is used as a traditional herb with diverse beneficial pharmacological activities, such as anti-inflammatory, anti-oxidant, and anti-allergic effects. However, the anti-obesity effects of citrus peel are poorly defined. The aim of this study was to evaluate ethanol extracts of citrus peel (EECP) for its adipocyte differentiation and adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes. The aim of this study was to evaluate an EECP for its adipocyte differentiation and adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes. Treatment with EECP significantly suppressed the terminal differentiation of 3T3-L1 preadipocytes in a dose-dependent manner, as confirmed by a decrease in lipid droplet number and lipid content and an accumulation of cellular triglyceride. EECP exhibited potential adipogenesis inhibition and downregulated the expression of pro-adipogenic transcription factors, such as sterol regulatory elementbinding protein-1c (SREBP-1c), peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), CCAAT/enhancerbinding proteins α (C/EBPα) and C/EBPβ, and adipocyte expressed genes, such as adipocyte fatty acid binding protein (aP2) and Leptin. In addition, EECP treatment effectively activated the AMP-activated protein kinase (AMPK) signaling pathway; however, compound C, a specific inhibitor of AMPK, significantly reduced the EECP-induced inhibition of adipogenesis. Taken together, these results indicate EECP showed strong anti-obesity effects through the AMPK signaling pathway, and further studies will be needed to identify the active compounds that confer the anti-obesity activity of EECP.

본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정에서 진피 에탄올 추출물(ethanol extracts of citrus peel, EECP)이 유발하는 항비만 효능에 대해서 조사하였다. 3T3-L1 세포의 생존율 및 증식에 영향을 미치지 않는 농도의 EECP를 처리하였을 경우 지방세포에서 특징적으로 나타나는 lipid droplet의 형성과 triglyceride의 생성도 억제되는 것으로 나타났다. EECP가 유발하는 지방세포로의 분화억제에는 PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 SREBP-1c 등과 같은 adipogenic transcription factors의 발현억제가 관여하는 것으로 나타났으며, 그 결과로 aP2 및 Leptin과 같은 adipocyte expressed genes의 발현도 억제되는 것으로 조사되었다. 또한 EECP는 AMPK 및 ACC의 인산화를 유발하였으며, AMPK 억제제인 Compound C를 이용하여 AMPK의 활성을 억제하였을 경우 EECP에 의한 AMPK의 인산화와 adipogenic transcription factors의 억제현상이 회복되었다. 이상의 결과에서 EECP는 AMPK signaling pathway를 통하여 항비만 효능을 가진다는 것을 알 수 있었으며, 향후 비만 예방 및 억제와 관련된 기능성 소재로서의 진피의 활용 가능성을 제시한 것으로서 그 가치가 매우 높을 것으로 생각된다.

서 론

비만(obesity)은 유전적 요인, 환경적 요인, 식습관, 생활습관 및 개인의 건강상태 등과 같은 다양한 원인에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있으며, 특히 음식물 섭취와 에너지 소비 사이의 불균형에 의하여 유발되는 비정상적인 체내 에너지대사 조절에 의한 지방의 과다 축적으로 발생하는 대사성 질환이다. 최근 세계 비만 인구의 증가 추세를 살펴보면 2005년에는 4억 명이었지만 2015년에는 7억 명에 이를 것으로 추산되며, 한국의 경우에도 식생활의 서구화 및 생활환경의 변화 등으로 인하여 성인 비만 인구가 1998년에는 26.0%에서 2001년 29.2% 및 2009년 31.3%로 점차 증가하고 있으므로 비만 예방 및 치료제에 관한 수요 또한 급증하고 있는 실정이다[23, 25].

일반적으로 비만은 adipogenesis 과정에 의한 triglyceride의 축적 또는 지방세포의 증식 및 분화에 의하여 지방세포의 비대 및 과형성이 유발됨으로서 나타나는 지방조직의 축적에 의하여 유발된다[12, 26]. 지방세포는 지방을 합성하고 저장하는 역할 이외에 다양한 호르몬, cytokines, 성장요소들을 분비함으로서 glucose 대사 및 에너지 항상성 유지에 있어서 중요한 내분비 조절자로 작용한다[11, 31]. 하지만 과도한 지방조직의 축적은 전체 중성지방 및 저밀도 콜레스테롤의 증가 및 고밀도 콜레스테롤의 감소를 유발하여 심혈관계 질환 및 고혈압의 발생률을 증가시키고, 인슐린 저항성을 증가시켜 제2형 당뇨병의 위험을 증가시키며, 다양한 종류의 암의 발생 가능성을 증가시킬 뿐 만 아니라 이상 지질 혈증 및 담석증 등과 같은 만성 질환의 발생 가능성을 증가시키는 위험 인자로 알려져 있다[10, 30]. 이러한 비만을 치료하기 위하여 많은 사람들이 선택하는 약물요법에 사용되는 비만치료제의 경우에는 음식물 흡수 억제제 및 식욕 억제제 등이 대부분을 차지하고 있으며, 두통, 심한 갈증, 변비, 불면증 및 심계항진 등과 같은 여러 가지 부작용이 나타나고 있으므로 안전성과 유효성이 입증된 치료제 개발의 필요성이 시급한 실정이다[24]. 따라서 안전성이 확보된 천연물로부터 항비만 효능을 보유한 소재의 발굴과 함께 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

AMP-activated protein kinase (AMPK)는 에너지 균형을 조절하는 중요한 조절자 및 에너지 센서로서 catalytic α subunit과 regulatory β 및 γ subunit이 hetero-trimeric complex로 구성되어 있는 serine/threonine kinase이다. AMPK 활성화는 에너지 소모에 의하여 증가된 세포 내 AMP에 의한 AMP/ATP ratio 증가에 따라 AMPK의 γ subunit에 AMP가 결합함으로서 α subunit의 Thr172 인산화에 의해 유발되며, 또한 serine/threonine protein kinase로서 종양억제인자로 알려진 LKB1 및 세포 내 AMP/ATP 비율의 변화와 관계없이 세포질 내의 Ca2+ level의 변화에 의하여 활성화되는 CaMKK β에 의하여 유발된다[9, 14, 28, 36]. 활성화된 AMPK는 gluconeogenesis 억제 및 근육세포의 GLUT4 양을 증가시켜 근육으로 포도당 이동을 증가시키는 작용을 할 뿐만 아니라 지방산 합성 효소인 fatty acid synthase (FAS) 및 acetyl CoA carboxylase (ACC)와 콜레스테롤 생합성 제한효소인 HMG-CoA reductase의 억제를 통한 체내 지질 생성을 조절함으로서 지방 세포의 adipogenesis 과정을 조절하는 것으로 알려져 있으므로 비만예방 및 치료를 위한 약물 타겟으로 많은 연구가 이루어지고 있다[6, 22, 35].

진피(陳皮, Citrus Peel)는 운향과에 속하는 상록 소교목인 귤(Citrus unshiu Markovich)의 성숙한 과실의 과피를 건조시킨 것으로서 단백질, 당질, 식이섬유와 함께 비타민이 풍부하며, 예로부터 매스꺼움, 소화불량, 해수, 가래제거, 이뇨작용에도 효과가 있어 예로부터 한약재로 많이 사용되어져 왔다[27]. 최근 연구에 따르면 진피에는 flavonoid, alkaloid, lignin, monoterpenoid, sesquiterpenoid, triterpenoid 등 다양한 기능성 성분을 함유하고 있으므로 소화기 자극, 소화촉진, 항산화작용, 항균작용, 순환기계 질병 예방, 면역 증강작용, 모세혈관 강화 등과 같은 효능이 있는 것으로 보고되고 있다[15, 29]. 또한 진피에 다량으로 함유되어 있는 hesperidin 및 naringin 등과 같은 flavonoids는 암세포의 증식억제 및 모세혈관 수축을 통한 고혈압 예방 효과를 가지고 있을 뿐 만 아니라 혈액 내 LDL 콜레스테롤 저하 및 중성지방 억제 효능이 있는 것으로 보고되고 있다[7, 18, 34]. 현재까지의 다양한 연구에서 볼 수 있듯이 진피는 다양한 약리작용을 가지며, 특히 높은 혈중 콜레스테롤과 중성지방을 저하시키는 효과가 기대되는 기능성 물질이지만 비만억제 작용 및 그에 따른 직접적인 분자생물학적 기전에 대한 연구는 상대적으로 매우 미비한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 진피 에탄올 추출물(Ethanol Extracts of Citrus Peel, EECP)의 항비만 효과 및 그에 따른 생화학적 기전의 해석을 위하여 지방전구세포인 3T3-L1 세포의 생존율과 증식에 영향을 미치지 않는 농도의 EECP가 insulin, dexamethasone 및 IBMX가 혼합된 비만유도인자에 의하여 인위적으로 유발된 adipogenesis 과정에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였고, 이때 adipogenic transcription factors 및 adipocyte expressed genes의 발현변화와 함께 AMPK의 역할에 대하여 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

 

재료 및 방법

실험재료

본 실험에서 단백질 분석을 위하여 사용된 PPARγ, C/EBP α, C/EBPβ, SREBP, Laptin, aP2 및 actin 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti- mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 또한 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 위하여 사용된 insulin, dexamethasone 및 IBMX와 지방세포 내 triglyceride 생성을 확인하기 위하여 사용된 Oil Red O는 Sigma-Aldrich (St. Luis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

시료준비

진피 에탄올 추출물인 EECP를 얻기 위하여 흐르는 물로 충분히 세척하고 dry oven을 이용하여 6시간 동안 건조하였다. 건조된 진피 잘게 분쇄한 다음 100 g 당 에탄올 1 l를 첨가하여 60℃, 150 rpm으로 3일간 교반 후 이를 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고 상층액만 분리하였다. 분리된 상층액을 Whatman 필터(No.2)로 걸러내고 감압 농축과정을 통하여 고형성분을 얻어내어 막자사발로 잘게 마쇄하고 밀봉시켜 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 실험 시에는 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 이용하여 100 mg/ml의 농도로 만든 다음 이를 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다.

세포배양

실험에 사용된 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양받은 mouse fibroblast인 3T3-L1 preadipocytes를 사용하였다. 3T3-L1 preadipocytes는 90%의 Dulbecco's Modified EaDCRT Media (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10%의 bovine calf serum (BCS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 및 1%의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.

3T3-L1 preadipocytes의 분화유도

3T3-L1 preadipocytes를 세포 배양용 6 well plate에 분주한 다음 10%의 BCS 및 1%의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 confluent 상태까지 배양하였다. Confluent 상태에서 10%의 fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)가 첨가된 분화배지에서 2일간 더 배양한 후 10 μg/ml insulin, 0.1 μM dexamethasone 및 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)가 포함된 분화배지로 교환하여 2일간 배양하였으며, 그 후 매 2일마다 10 μg/ml insulin이 포함된 분화배지로 교환하였다. 8일간 분화를 유도한 3T3-L1 preadipocytes는 다양한 실험적 분석을 위하여 사용하였다.

Hemocytometer를 이용한 3T3-L1 preadipocytes 생존율의 측정

EECP 처리에 따른 3T3-L1 preadipocytes의 생존율을 측정하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 3T3-L1 preadipocytes를 분주하여 confluent 상태까지 배양한 후 EECP를 적정 농도로 처리하였다. 72시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 phosphatebuffered saline (PBS)를 각 well 당 적정량을 첨가하여 세포를 모았다. 이렇게 모인 세포를 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 각각 1 ml의 PBS와 0.5% trypan blue solution (Gibco BRL)을 첨가하여 2분간 처리한 후 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였다.

MTT assay에 의한 3T3-L1 preadipocytes 성장억제 조사

EECP가 유발하는 3T3-L1 preadipocytes의 성장억제 정도를 확인하기 위하여 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포를 대상으로 배지를 제거하고 성장배지와 희석된 0.5 mg/ml 농도의 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)를 2 ml 씩 분주하고 빛을 차단한 다음 동안 CO2 incubator에서 배양시켰다. 3시간 경과 후 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 DMSO를 1 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 다음 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도립 현미경을 이용한 3T3-L1 preadipocytes의 분화에 따른 형태의 관찰

3T3-L1 preadipocytes가 adipocytes로의 분화에 따른 형태 변화에 EECP가 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 3T3-L1 preadipocytes를 분주하여 confluent 상태까지 배양한 후 EECP를 적정농도로 희석 처리하면서 분화를 유도하였다. 분화가 끝난 후 EECP 처리농도에 따른 형태변화를 도립 현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.

Oil Red O 염색 및 정량

색소결합법에 해당하는 Oil red O 염색법은 총 지질을 정량할 때 쓰이는 방법 중 하나로서 지질에만 특이적으로 결합하므로 adipocytes에 생성된 지방 빈도를 파악할 수 있다. 따라서 분화가 유발된 3T3-L1 adipocytes 내에 생성되는 lipid droplet에 EECP가 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 Oil Red O 염색을 실시하였다. 대조군과 각기 다른 농도의 EECP가 처리된 3T3-L1 adipocytes를 대상으로 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음 3.7% formalin으로 1시간 동안 고정하였다. 고정이 끝난 후 60% isopropanol을 이용하여 세포를 세척한 다음 Oil Red O solution을 처리하여 실온에서 20분 간 염색을 실시하였다. 염색 후 Oil Red O solution을 제거하고 증류수로 3회 세척한 다음 염색된 세포를 도립 현미경을 이용하여 관찰하고 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다. 또한 EECP가 유발하는 triglyceride의 생성억제 정도의 정량적 분석을 위하여 100% isopropanol을 이용하여 세포에 염색된 Oil Red O solution을 녹여낸 다음 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 ELISA reader로 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot 분석을 통한 단백질 발현 조사

먼저 상기와 동일한 방법으로 준비된 세포를 대상으로 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 원심분리하여 상층액에 있는 총 단백질을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만들어진 sample을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분자량에 따라 분리한 다음 electroblotting을 실시하여 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시켰다. 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 각각의 1차 및 2차 항체를 처리하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) solution (Amersham Life Science Corp.)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다.

통계분석

모든 실험 결과는 SPSS ver. 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 한 후, Student t-test와 Duncan's multiple range test를 이용하여 p＜0.05 수준에서 검증하였다.

 

결과 및 고찰

3T3-L1 preadipocytes의 생존율 및 증식에 미치는 EECR의 영향

EECP가 3T3-L1 preadipocytes의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 0~5 mg/ml 농도의 EECP를 72시간 동안 처리한 다음 hemocytometer를 이용하여 살아있는 세포의 수를계수하여 비교한 결과는 Fig. 1A에 나타낸 바와 같다. 결과에서 볼 수 있듯이 2 mg/ml EECP 처리군까지는 생존율 감소현상이 크게 나타나지 않았지만 2.5 mg/ml EECP 처리군에서 부터는 점차적인 생존율의 감소가 관찰되었다. 동일한 조건에서 3T3-L1 preadipocytes의 증식에 미치는 EECP의 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. Fig. 1B에 나타낸 바와 같이 EECP가 유발하는 증식억제의 경우에도 2 mg/ml EECP 처리군까지는 증식억제효과가 거의 나타나지 않았지만 2.5 mg/ml의 EECP를 처리하였을 경우 약간의 증식억제효과가 나타나기 시작하여 3.5 mg/ml EECP 처리군에서부터는 증식억제가 강하게 유발된다는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 바탕으로 EECP가 생존율 및 증식에 큰 영향을 미치지 않는 2 mg/ml의 농도까지를 실험 조건으로 설정하여 항비만 효능을 확인하였다.

Fig. 1.Effects of EECP on the cell growth in 3T3-L1 mouse preadipocytes. Cells were treated with the indicated concentrations of EECP for 72 hr. Cell number (A) and viability (B) were determined by hemocytometer counts of trypan blue excluding cells and MTT assay, respectively. Results are expressed as percentage of the vehicle treated control ± SD of three separate experiments (*p<0.05 vs. untreated control).

Lipid droplet 생성에 미치는 EECP의 영향

Lipid droplet은 소포체의 이중막 사이에 triglyceride와 cholesterol ester가 축적되어 층이 나누어지기 시작하면서 만들어지며, 지방이 점점 더 축적되면 ‘lens’ 구조가 나타나게 되고 lipid droplet이 소포체에서 떨어져 나오게 된다고 알려져 있다[2]. 이렇게 생성된 lipid droplet은 phospholipid monolayer와 관련 단백질에 둘러싸여 있는 비활성 소낭으로서 precursor fibroblast에서부터 지방세포로의 분화과정에서 나타나며, PPARγ와 같은 중요한 adipogenic transcription factors에 의해서 조절되는 것으로 보고되고 있다[21]. 성숙한 지방세포에서는 LPL에 의한 triglyceride 유입과 adipose triglyceride lipase (ATGL) 및 hormone sensitive lipase (HSL)에 의한 triglyceride 유출에 의하여 lipid droplet이 유지되며, 이러한 lipid droplet은 비만유발뿐 만 아니라 암, 동맥경화 및 제2형 당뇨병 등과 같은 대사성 질환에도 관련성이 크다고 보고되고 있다[16, 20]. 따라서 EECP가 3T3-L1 preadipocytes가 adipocytes로 분화되는 과정에 나타나는 lipid droplet 생성에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 분화유도 시 EECP를 적정농도로 처리한 다음 Oil red O 염색 전과 후로 구분하여 세포 내 lipid droplet의 생성 정도를 도립 현미경으로 관찰하였다. Fig. 2의 결과에서 알 수 있듯이 EECP를 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우에 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었으나, EECP를 처리하였을 경우에는 처리농도 의존적으로 lipid droplet의 형성이 현저하게 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 EECP는 3T3-L1 preadipocytes에서 adipocytes로의 분화를 억제한다는 것을 알 수 있었다.

Fig. 2.Effects of EECP on the microscopic morphological changes and lipid droplet accumulation of differentiated 3T3-L1 mouse preadipocytes. Differentiation of confluent 3T3-L1 mouse preadipocytes was initiated with MDI (0.5 mmol/l 3-isobytyl- 1-methylxanthine, 0.5 μmol/l dexamethasone, and 5 μg/ml insulin) and maintained DMEM-10% FBS medium (maintenance differentiation medium) in the absence or presence of EECP for 8 days. (A) Differentiating 3T3-L1 cells were visualized by light microscopy. Magnification, ×200. (B) Cells were fixed and stained with Oil Red O to visualize lipid droplets by light microscopy. Magnification, ×200.

Triglyceride 생성에 미치는 EECP의 영향

Glycerol 1분자와 fatty acid 3분자가 ester 결합한 형태인 triglyceride는 중성지방으로 알려져 있으며, 음식물로 섭취하는 지방의 95% 이상을 차지할 뿐 만 아니라 동물의 저장지방의 경우에도 triglyceride 형태로 저장된다[4]. 지방조직에서의 triglyceride의 저장은 chylomicron 및 very low density lipoprotein (VLDL) 등과 같은 triglyceride-rich lipoprotein에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있다[33]. 일반적으로 triglyceride는 포도당과 함께 세포의 중요한 에너지원으로 사용되지만 과도한 음식물 섭취로 인한 여분의 triglyceride는 지방세포에 흡수되고 저장되어 비만의 원인으로 작용할 뿐 만 아니라 다양한 질환의 원인이 되기도 한다[13]. 따라서 EECP가 triglyceride의 생성에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 Oil Red O로 염색된 lipid droplet을 isopropanol로 추출한 후 triglyceride의 함량을 측정하였다. Fig. 3에 나타난 바와 같이 EECP를 처리하였을 경우에는 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 triglyceride의 생성 정도가 점차적으로 감소되었으며, 최고 농도인 2 mg/ml 처리군에서는 약 55%의 triglyceride 생성 억제효과가 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴보면 EECP는 lipid droplet의 형성억제와 연관된 triglyceride 생성억제효과가 있는 것으로 나타났으므로 3T3-L1 preadipocytes의 분화를 억제함으로서 비만 예방에 효과적 일것으로 생각된다.

Fig. 3.Inhibitory effects of EECP on triglyceride accumulation of differentiated 3T3-L1 mouse preadipocytes. Triglyceride contents were determined by Oil Red O staining after treatment of the absence or presence of EECP. The rates of triglyceride contents were measured at λ=500 nm wavelength by the ELISA reader. Data are expressed as the means ± S.D. The results were confirmed by three independent experiments (*p<0.05 vs. MDI only group).

Adipogenic transcription factors 및 adipocyte expressed genes의 발현에 미치는 EECP의 영향

Preadipocytes에서 adipocytes로 분화되는 adipogenesis는 세포형태, 유전자 발현 및 호르몬 민감성 등의 변화를 동반하는 복합적인 과정으로서 많은 종류의 adipogenic transcription factors가 관여하는 것으로 알려져 있으며, 특히 분화초기 에는 분화유도인자에 의하여 C/EBPβ 및 SREBP1c의 발현이 유발된다. C/EBPβ의 경우에는 insulin-sensitive glucose uptake와 같은 성숙한 비만세포의 특징을 증가시키는데 관여하는 C/EBPα 및 PPARγ의 발현을 촉진하며, SREBP1c의 경우에는 insulin에 의하여 발현되어 PPARγ의 발현에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다[3, 19]. Adipogenesis의 핵심 조절자로 불리는 C/EBPα 및 PPARγ는 서로 상호작용하여 상승 효과를 나타내어 최종적으로 분화과정을 완성하게 되며, 그 결과로 백색지방세포에서 나타나는 lipid droplet 생성 및 triglyceride의 축적과 함께 세포의 크기 증가 등과 같은 형태적 특징과 더불어 aP2 및 Leptin 등과 같은 adipocyte expressed genes의 발현을 유발함으로서 지방세포의 특징을 지니게 된다[1, 8]. 따라서 본 연구에서는 EECP가 adipogenic transcription factors 및 adipocyte expressed genes의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 단백질 수준에서 확인하였다. 먼저 adipogenic transcription factors의 발현 정도를 확인한 결과 Fig. 4A에 나타난 바와 같이 분화를 유발하였을 경우 PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 SREBP1c의 발현이 현저하게 증가하였지만 EECP 처리에 의하여 농도 의존적인 감소가 유발되었다. 또한 adipocyte expressed genes인 aP2 및 Leptin 경우에도 Fig. 4B에서와 같이 EECP 처리에 의하여 현저하게 감소하였음을 확인하였다. 이상의 결과를 살펴볼 때 EECP는 adipogenic transcription factors의 발현을 억제함으로서 lipid droplet 및 triglyceride 생성 감소와 함께 adipocyte expressed genes의 발현을 감소시킴으로서 지방세포로의 분화를 억제시킬 수 있을 것으로 추정된다.

Fig. 4.Effects of EECP on the levels of adipogenic transcription factors (A) and adipocyte expressed genes (B) expression in differentiated 3T3-L1 mouse preadipocytes. Differentiation of confluent 3T3-L1 mouse preadipocytes was incubated with the absence or presence of EECP for 8 days after initiated with MDI. Cells were lysed and cellular proteins were separated by SDS-polyacrylamide gels and transferred onto nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the indicated antibodies. Proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control.

AMPK 경로가 EECP에 의한 adipogegesis 억제에 미치는 영향

에너지 센서로서 에너지 균형의 조절자인 AMPK는 활성화되면 preadipocyte의 분화를 억제함으로서 비만을 억제하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[17, 32]. 최근 연구에 따르면 AMPK activator인 AICAR 및 많은 종류의 natural compound들은 adipogenic marker인 fatty acid synthase (FAS) 및 adipogenic transcription factors를 억제함으로서 비만세포로의 분화 억제, apoptosis 유발 및 glucose uptake의 증가를 유발하는 것으로 보고되고 있다[5]. 따라서 EECP에 의한 adipogenesis 억제과정에서 AMPK 및 AMPK의 하위단계에서 작용하는 ACC의 발현 변화를 살펴보고 AMPK의 활성을 억제하였을 경우 EECP에 의하여 유발되는 변화에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하였다. 먼저 AMPK 및 ACC의 발현 변화를 확인한 결과 Fig. 5A에 나타난 바와 같이 AMPK 및 ACC의 인산화가 현저하게 증가되는 것으로 나타났으므로 EECP에 의한 adipogenesis 억제에 있어서 AMPK의 활성화가 관여한다는 것을 예상할 수 있었다. 다음으로 Fig. 5B에 나타난 바와 같이 AMPK 억제제인 compound C를 선처리하여 AMPK 경로를 억제하였을 경우 EECP에 의하여 발현이 증가 되었던 pAMPK 및 pACC의 발현이 억제되었으며, EECP에 의하여 발현이 억제되었던 PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ 및 SREBP1c의 발현이 다시 증가되는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 EECP는 3T3-L1 세포에서 AMPK의 활성화를 통한 adipogenic transcription factors의 발현을 감소를 유발함으로서 adipogegesis를 억제한다는 것을 알 수 있었다. 본 연구 결과는 진피의 비만억제 가능성을 제시하는 것으로서 추가적으로 에너지 대사 및 신호전달계 등과 연관된 항비만기전에 대한 생화학적 해석이 필요할 것을 생각되며, 본 연구의 결과는 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료로서의 그 가치가 매우 높을 것으로 생각된다.

Fig. 5.Roles of AMPK signaling pathway on the EECP-induced inhibition of adipogenesis in differentiated 3T3-L1 mouse preadipocytes. (A) Effects of EECP on AMPK and ACC phosphorylation in 3T3-L1 cells. Confluent cells were treated with various concentrations of EECP. (B) Effects of AMPK inhibitor, Compound C, on the levels of adipogenic transcription factors in 3T3-L1 cells. Cells were pre-treated with compound C for 1 hr, and then treated with 2 mg/ml of EECP. On day 8, completely differentiated cells were lysed and cellular proteins were separated by SDS-polyacrylamide gels and transferred onto nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the indicated antibodies. Proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control.