Isolation and Structure Identification of Photosensitizer from Perilla frutescens Leaves Which Induces Apoptosis in U937

들깻잎(Perilla frutescens)으로부터 U937 세포에 apoptosis를 유도하는 광과민성 물질의 분리 및 구조동정

Abstract

In this study, we tried to separate the photosensitizer that induces apoptosis of leukemia cells (U937) from perilla leaves. Perilla leaves (Perilla frutescens Britt var. japonica Hara) are a popular vegetable in Korea, being rich in vitamins (A and E), GABA, and minerals. Dried perilla leaves were extracted with methanol to separate the photosensitizer by various chromatographic techniques. The structure of the isolated compound (PL9443) was identified by 1D-NMR, 2D-NMR, and FAB-mass spectroscopy. Absorbance of the UV-Vis spectrum was highest at 410 nm and was confirmed by the 330, 410, and 668 nm. PL9443 compound was determined to be pheophorbide, an ethyl ester having a molecular weight of 620. It was identified as a derivative compound of pheophorbide structure when magnesium comes away from a porphyrin ring. Observation of morphological changes in U937 cells following cell death induced by treated PL9443 compound revealed representative phenomena of apoptosis only in light irradiation conditions (apoptotic body, vesicle formation). Results from examining the cytotoxicity of PL9443 substance against U937 cells showed that inhibition rates of the cell growth were 99.9% with the concentration of 0.32 nM PL9443. Also, the caspase-3/7 activity was 99% against U937 cells with the concentration of 0.08 nM of PL9443 substance. The result of the electrophoresis was that a DNA ladder was formed by the PL9443. The PL9443 compound is a promising lead compound as a photosensitizer for photodynamic therapy of cancer.

본 연구에서 우리는 들깻잎(Perilla frutescens)으로부터 U937 세포에 대해 apoptosis를 유도하는 광과민성 물질을 분리하기 위해 연구를 시작하였다. 들깻잎은 한국의 대중적인 쌈채소로 바타민, GABA, 미네랄 등이 풍부하다고 알려져 있다. 건조한 들깻잎을 메탄올로 추출하여 다양한 크로마토그래피법을 이용하여 광과민성 물질을 순수 분리하였다. 순수 분리한 광과민성 물질을 PL9443으로 명명하고, 구조동정을 위하여 1D-NMR, 2D-NMR, FAB-mass spectroscopy 분석을 실시하였다. 순수 분리한 PL9443 compound의 흡광도를 측정한 결과 410 nm에서 최대 흡수를 보였고, 330, 410, 680 nm에서 흡수 peak를 나타내었다. PL9443 compound는 분자량 620.7의 pheophorbide a ethyl ester로 동정하였다. 구조동정한 물질은 porphyrin환을 갖는 구조에서 Mg이온이 탈리된 pheophorbide 유도체화합물이었다. PL9443 compound의 처리에 따른 U937 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 광조건에서 apoptosis의 전형적인 현상인 apoptotic body와 소낭구조물이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 PL9443 compound를 0.08 nM로 처리하였을 때 99%의 caspase-3/7 activity가 나타났고, 세포손상 역시 광의존적으로 나타내는 것을 확인하였다. PL9443 compound를 처리하고 광을 조사한 처리구와 광을 조사하지 않은 처리구의 세포로부터 DNA를 분리하여 전기영동을 실시한 결과 광을 조사한 곳에서 DNA ladder현상을 관찰할 수 있었다. 따라서 PL9443 compound는 광의존적 apoptosis 유도에 의한 세포손상을 일으키는 것을 확인하였다.

서 론

광역학 치료(Photodynamic Therapy)는 광감작제(Photosensitizer)를 투여한 후 광감작제를 활성화 시킬 수 있는 특정파장의 빛을 조사함으로써 광감작제가 축적되어 있는 암조직에 손상을 유도하여 괴사를 시키는 치료방법이다[7]. 광역학치료에 의한 세포의 사멸은 Type Ⅰ 반응과 Type Ⅱ 반응으로 나뉘는데, Type Ⅰ 반응은 활성화된 광감작제와 수소원자의 추출작용 또는 전자전달 반응으로 자유라디칼 또는 라디칼 이온이 생성되는 반응이고, Type Ⅱ 반응은 활성화된 광감작제와 산소분자 사이의 에너지 전달반응으로 singlet oxygen이 생성되는 반응이다. 일반적으로 Type Ⅱ 반응이 광역학 치료기전으로 많은 비중을 차지하고 있다고 알려져 있고, Type Ⅰ 반응은 저산소 상태 또는 극성의 환경에서 우세하게 일어나는 것으로 알려져 있다[3]. 현재 사용되고 있는 광감작제는 hematophorphyrin 유도체(HpD)를 근간으로 하는 PhotofrinⓇ과 PhotogemⓇ이 있다. 이러한 HpD류의 광감작제는 주로 종양의 혈관손상을 야기하여 혈행을 정지시킴으로써 간접적으로 세포괴사를 일으킨다. 그러나 HpD는 체내에서 배설되는 시간이 길어 광역학 치료시 광감작제가 완전히 대사될 때까지 빛을 보지 못하는 시간이 길어지는 단점을 가지고 있다[12]. 최근에는 더 좋은 반응성을 가지고 체내에서 빠른 대사를 보이는 광감작제의 개발 필요성이 대두되어 chlorophyll 유도체(CpD)를 이용한 차세대 광감작제를 개발하기 위한 물리화학적 특성과 작용기전에 대한 연구들이 이루어지고 있다[9].

들깻잎(Perilla frutescens Britt var. japonica Hara)은 동남아시아가 원산이며 재배작물로 들여와 농가에서 흔히 재배하는 귀화식물로 1년생 초본이다. 식용, 약용으로 쓰이고 잎과 씨를 식용하며 기름을 짜내고 민간에서 강장, 해수, 소화, 충독, 음종 등에 약으로 쓰인다. 한의학에서 들깻잎은 한기에서 오는 감기를 없애주고, 열을 내리게 하여 열 감기에 좋은 식품으로 알려져 있으며, 체한 기운이 있는 사람이나 구토, 설사를 하는 사람에게 좋다고 하였다[11]. 들깻잎의 영양성분으로는 칼슘, 칼륨, 인, 마그네슘 등의 미네랄과 아미노산, 비타민 A, B2 및 α-linolenic acid 등이 다량 함유되어 있다[8]. 현재 연구되어진 들깻잎의 생리활성으로는 들깻잎 열수추출물에서 분리한 luteolin의 항염증 및 항알러지 효과[5], 항산화 및 항돌연변이 효과[19], 들깻잎에서 동정된 phytol과 eicosatrienoic acid의 위암 세포에서의 암세포 성장 억제효과[8, 15], 메탄올 추출물의 항돌연변이 효과와 과산화지질 생성 억제작용[16], 들깻잎 에탄올 추출물로부터 분리한 triterpene acid의 항염증 및 항암효과[18], 들깻잎으로부터 분리한 rosmarinic acid의 유행성결막염 저해효과 및 항알러지 효과[4, 22] 등이 있다.

본 연구는 들깻잎의 용매추출물로부터 광역학 활성을 확인하고, 광과민성 물질을 순수분리하여 광감작제 개발을 위한 연구자료로 이용하고자 한다.

 

재료 및 방법

시약 및 기기

들깻잎으로부터 광과민성물질을 분리하기 위해서 open column chromatography는 normal phase silica gel (230~400 mesh, Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였으며, thin layer chromatography (TLC)는 TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 물질의 분리도를 확인하기 위해서 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography (HPLC), Waters, New Castle, USA) 분석을 실시하였고, 구조 동정을 위하여 핵자기공명분광기(nuclear magnetic resonance, NMR)는 Agilent 600MHz (600MHz Agilent NMR System, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 측정하였으며, NMR용 CDCl3은 Sigma Aldrich 제품을 사용하였다. 그리고 분자량 측정을 위해서 FAB-MS (JMS 700, Jeol, Tokyo, Japan) 분석을 하였다.

세포배양에 사용한 배지는 RPMI 1640을 사용하였으며, FBS (Fetal Bovine Serum) 그 외 trypsin-EDTA는 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였고, penicillin-streptomycin은 Sigma Aldrich (St. Louis MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 세포배양은 MCO-18AIC (SANYO, Osaka, Japan) 배양기를 이용하였다. 세포관찰은 IX51 inverted microscope (Olympus Corporation of the Americas, Inc., Central Valley, PA)를 이용하였으며, cell viability와 caspase assay 측정은 Glo-MaxTM Multi microplate multi reader (Promega, USA)를 사용하였다. 양성대조군으로 사용한 ADCL은 actinomycin D (Sigma-Aldrich, USA)와 colcemid (Sigma-Aldrich, USA)를 각각 0.1 mM의 농도로 제조하여 1:1로 혼합한 후 2 μl/well 농도로 처리하였다.

물질추출

들깻잎은 서늘한 그늘에서 건조시키고, 분쇄기로 분쇄한 후 중량 기준 10배량의 methanol을 넣어 150 rpm으로 3시간 동안 진탕 추출하여 정치시킨 후, filter paper (5C, 110 mm, Advantech, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 추출은 3회 반복 추출하였으며, 여과액은 진공농축기(Rotary vacuum evaporator, EYELA N-1000, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하고 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.

세포배양

실험에 사용한 혈액암세포 U937은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB30052Ⓡ)으로부터 분양 받았으며, 암세포 배양을 위해 90% RPMI 1640, 10% FBS에 1%의 penicillin-streptomycin이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2조건 하에서 배양하였다. 세포성장에 따른 과밀도 현상을 방지하기 위하여 세포의 생육정도를 관찰하면서 계대배양을 실시하여 적정 세포 수를 유지하였다.

세포 형태 변화

암세포에 들깻잎 추출물과 분리과정의 회수물질들을 처리하여 광을 조사한 것과 조사하지 않은 것으로 암세포에 대한 광역학적 세포독성을 형태적 변화로 관찰하였다. 활성을 조사하기 위하여 세포 수를 2×105 cells/ml로 조정하고, 48 well plate에 0.2 ml씩 첨가하고 24시간 배양하여 안정화를 시켰다. 처리할 물질은 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma Chemical Co., USA)에 용해시켜 100 mg/ml 농도가 되게 조절한 다음, 각 well에 다양한 농도로 처리하였으며, DMSO 최종농도는 0.5% 이하가 되도록 하였다. 광역학 활성을 조사하기 위하여, 추출물을 처리하고, 4시간이 경과한 후에 광을 처리하는 plate에는 형광등을 이용해 10분간 조사시키고, 광을 조사한지 12, 24시간 후에 phase-contrast microscope를 이용하여 변화된 세포주의 형태적 특징을 관찰하였다. 암조건의 plate는 물질을 처리한 후 계속 암상태로 배양한 후 12, 24시간 후에 동일한 방법으로 현미경 관찰을 실시하였다.

광과민성 물질 분리

광역학 활성을 나타내는 광과민성 물질을 순수분리하기 위하여 추출물을 먼저 silica gel open column을 실시하였다. 들깻잎 추출물은 hexane, hexane:ethylacetate (EtOAc) (1:0→5:4), MeOH 순으로 용매의 극성을 높여가면서 순차적으로 용출하여 105개의 분획물을 얻었으며 물질분리 pattern을 확인하기 위하여 TLC를 실시하고 Rf값이 유사한 것을 그룹으로 하여 9개 그룹으로 나누어 회수하였다. Column 분획물로부터 광역학 활성을 갖는 물질을 순수분리하기 위하여 활성을 조사해가며 2번의 open column chromatography와 1번의 thin layer chromatography로 물질을 순수 분리하였다. 순수분리하기까지 각 단계별로 얻어진 물질을 U937세포에 처리하여 광역학 활성을 확인하고, 활성이 나타나는 그룹을 다음 단계에 이용하였다. 순수 분리한 물질의 광역학 활성의 조사는 48 well plate에 세포 수를 2×105 cells/ ml로 조정하고, well 당 0.2 ml씩 첨가하여 12시간 배양한 다음, 처리할 물질을 DMSO에 용해시켜 1.7, 3.2 nM 농도로 각각 처리하였다. 분리한 물질의 순수한 정도를 조사하기 위하여 TLC와 HPLC분석을 실시하였으며, HPLC 분석용매는 MeOH과 EtOAc를 이용한 gradient program으로 실시하였다. Injection은 MeOH 100% 조건으로 하여 5분까지 EtOAc를 20%까지 상승시키고, 20분까지는 EtOAc를 80%까지 상승시켰으며, 22분까지는 EtOAc가 100% 되게 EtOAc농도를 점차적으로 증가시키며 분석을 실시하였다. 순수도가 확인된 물질은 구조동정을 위한 기기분석을 실시하였고, U937세포에 광역학 활성을 양적인 상관관계에 따라 조사하였다.

물질 구조분석

순수 분리한 광과민성 물질의 구조분석을 위하여 물질을 CDCl3에 녹여 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR)과 2D-NMR (Homo-Cosy, HSQC, MBC)를 실시하고, FAB-mass spectroscopy 분석을 실시하여 분자량을 측정하였다.

Caspase assay

Caspase 활성화가 apoptosis 유도에 중요한 현상으로 caspase 활성을 Caspase-Glo 3/7 assay system (Promega, USA)를 이용하여 측정하였다. 세포를 배양한 다음 세포 수를 2×105 cells/ml로 조정하여 96 well white plate에 0.1 ml씩 첨가하고 4시간동안 배양하였다. 순수 분리한 PL9443 물질을 DMSO에 용해시켜 각 well에 0.04, 0.08, 0.17, 0.32 nM의 농도로 처리하였으며, 각 well에 DMSO 최종농도가 0.5%이하가 되게 하였다. PL9443 물질을 처리하고 4시간이 경과한 후에 광조건의 plate에는 광을 10분간 조사시키고, 암조건의 plate는 물질을 처리한 후 계속 암상태로 배양하였다. 광을 조사한 후 6시간 배양을 한 96well white plate에 배지량과 동량의 Caspase-Glo solution을 혼합하여 상온에 1시간 반응을 시키고, Glo-MaxTM Multi microplate multi reader (Promega, USA)로 측정하였다.

세포독성 assay

세포독성을 측정하기 위한 cell viability assay는 CellTiter-Glo 2.0 assay (Promega, USA)를 이용하여 측정하였다. 세포를 배양한 다음 세포 수를 2×105 cells/ml로 조정하여 96 well white plate에 0.1 ml씩 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 순수 분리한 PL9443 물질을 DMSO에 용해시켜 각 well에 0.04, 0.08, 0.17, 0.32 nM의 농도로 처리하였으며, 각 well에 DMSO 최종농도가 0.5%이하가 되게 하였다. PL9443을 처리하고 4시간이 경과한 후에 광조건의 plate에는 광을 10분간 조사시키고, 암조건의 plate는 물질을 처리한 후 계속 암상태로 배양하였다. 광 조사 후 6시간 배양을 한 96well white plate에 배지량과 동량의 CellTiter-Glo 2.0 reagent를 혼합하여 상온에 10분간 반응을 시킨 후, Glo-MaxTM Multi microplate multi reader로 측정하였다.

DNA 전기영동

Apoptosis가 유도되었을 때 나타나는 특징 중의 하나가 DNA fragmentation 현상이다. DNA fragmentation을 확인하기 위하여 세포 수를 1×106 cells/ml로 조정하고 6 well plate에 1 ml씩 첨가하여 4시간 배양하였다. 순수분리한 PL9443 물질을 DMSO에 용해시켜 각 well에 4.25 nM의 농도로 처리를 하고, 물질을 용해시키기 위해 사용한 DMSO는 각 well에 0.5% 이하가 되게 처리하였다. PL9443을 처리하고 4시간이 경과한 후에 광조건의 plate에는 광을 10분간 조사시키고, 광을 조사한지 6시간 후에 세포를 회수하였다. 암조건의 plate는 물질을 처리한 후 계속 암상태로 배양한 후 6시간 후에 동일한 방법으로 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 원심분리하여 상층액은 버리고 인산완충용액으로 세포를 세척하였다. Lysis buffer (Wizard® SV Genomic DNA Purification system, Promega, USA)를 넣고, ice 위에서 20분간 정치를 시킨 다음 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 회수하였다. 상층액에 RNase A (Ambion, USA)와 proteinase K (Roche, USA)를 각각 첨가하고, 37℃에서 60분간 각각 반응시킨 후 1.6% agarose gel에 전기영동을 실시하여 DNA fragmentation을 관찰하였다.

 

결 과

용매추출물 세포독성

들깻잎을 CHCl3와 MeOH로 추출하여 농축한 다음, 각각의 추출물을 48 well plate에 10, 100 μg/ml의 농도가 되도록 처리하고 광을 조사한 것과 조사하지 않은 것으로 세포독성을 조사하였다. 그 결과 들깻잎의 MeOH 추출물을 처리하고 광을 조사한 곳에서 U937세포는 타원형의 형태를 나타내며, 꼬리를 형성하는 듯한 모양 및 소낭을 형성하는 형태적인 변화가 강하게 나타나는 현상을 관찰할 수 있었다. 반면 물질을 처리하고 광을 조사하지 않은 곳에서는 세포가 물질을 처리하지 않은 곳과 같이 정상적으로 생육을 하여 들깻잎의 MeOH 추출물이 광조사에 의해 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다.

Apoptosis 유도

U937세포의 PL9443 물질에 대한 광역학 활성을 조사하기 위하여 물질을 처리한 후 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. U937세포는 부유세포로 정상적인 생육을 하였을 때 monocyte 형태를 나타낸다. 세포의 형태학적 변화는 현미경으로 200 배율에서 관찰하여 Fig. 1에 나타내었다. Apoptosis를 유도하는 ADCL을 처리한 곳에서 U937세포는 apoptosis의 전형적인 형태인 apoptotic body와 소낭구조물이 형성되는 것을 관찰 할 수 있었다. 그리고 well에 전체적으로 세포가 사멸되면서 형성된 작은 조각들이 부유하고 있는 것을 관찰할 수 있었다. PL9443 물질을 처리하고 광을 조사한 well에서는 apoptotic body와 소낭구조물이 형성되었고 세포가 부분적으로 팽윤하는 현상이 나타났으며, ADCL을 처리한 곳에서도 같은 현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 그리고 PL9443 물질을 처리한 곳은 농도증가에 따라 apoptotic body의 형성도 비례적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 광을 조사하지 않은 조건에서 배양한 well과 물질을 처리하지 않은 control에서는 정상생육을 하는 것을 관찰하였다.

Fig. 1.PL9443 compound affects morphological changes in U937 cells. Morphological changes in U937 cells induced by treated PL9443 1.7 nM revealed apoptotic body, vesicle formation only in the light irradiation conditions. ADCL of 1:1 mixture 0.1 mM actinomycin D and 0.1 mM colcemid is treated with 2 μl / 0.1 mM / well. Magnification, x200. (A: Control, B: DMSO, C: ADCL, D: PL9443 1.7 nM (Light), E: PL9443 1.7 nM (Dark)).

광과민성물질 순수분리

들깻잎 추출물로부터 apoptosis를 유도하는 물질을 분리하기 위하여 MeOH 추출물을 이용하여 1차 column chromatography를 실시하여 105개의 분획물을 얻었으며, TLC로 분획물의 물질 분리패턴을 확인하여 유사한 Rf값을 지니는 물질들을 9개 그룹으로 회수하여 광역학 활성을 확인하였다. 그 중 PL9 그룹에서 광역학 활성이 나타났으며, 이후 2번의 column chromatography와 1번의 thin layer chromatography를 실시하고, 각 단계마다 활성검정을 실시하여 PL9443 물질을 분리하였다. 분리한 PL9443 compound는 dark green의 색을 띄었고 chloroform에 잘 용해되었다. 분리한 PL9443물질의 순수분리 정도를 TLC와 HPLC로 확인하였다. CHCl3:MeOH (1:30) 전개용매로 TLC를 실시한 결과 Rf 0.45에서 single spot을 확인하였고(Fig. 2A), Methanol과 ethyl acetate gradient system으로 분석한 결과 Rt 9.724 min에서 single peak를 확인하여(Fig. 2B) 순수분리 되었다는 것을 확인하였다. 순수분리한 PL9443 물질로 caspase 3/7 assay, cell viability 및 DNA fragmentation을 확인하였다.

Fig. 2.TLC developing pattern and HPLC analysis chromatogram of purified photosensitizer PL9443. (A) Purified PL9443 compound on a TLC plate (Rf 0.45, Developing solvent: CHCl3 : MeOH (1:30)), (B) Purified PL9443 compound of HPLC chromatogram (Rt 9.724).

Caspase-3/7 activity

Apoptosis의 DNA 가수분해반응은 caspase에 의해 일어나게 된다. PL9443 물질의 처리에 따른 U937세포에서의 caspase-3/7 활성을 조사한 것은 Fig. 3에 나타냈다. U937세포에 PL9443을 0.08 nM의 농도를 처리하고 광을 조사한 처리구에서 양성대조군인 ADCL과 같은 99.9%의 caspase 활성을 보였다. 반면 PL9443 물질을 처리하고 암조건에서 배양한 처리구들은 물질을 처리하지 않고 세포만 배양하거나 DMSO만을 처리한 대조구와 동일하게 caspase 활성이 나타나지 않았다(Fig. 3). PL9443물질을 0.17 nM의 농도로 처리한 곳에서는 0.08 nM 농도로 처리한 곳보다 caspase 활성이 감소하였으며, 0.32 nM 농도로 처리한 곳에서는 caspase 활성이 나타나지 않았다. 0.32 nM 농도로 처리한 곳에서는 물질의 농도가 높아 세포손상이 빠른 시간에 일어났으며, 세포의 파괴와 효소의 불활성화로 활성이 낮게 나타난 것으로 추측된다. PL9443 물질을 처리하고 암조건에서 배양한 처리구에서는 대조구와 동일하게 caspase 활성이 나타나지 않았다.

Fig. 3.Caspase-3/7 activation in U937 cells. Cells were treated with photosensitizer PL9443 (0.04, 0.08, 0.17, 0.32 nM) for 4 hr, irradiated with light for 10 miniutes or kept in dark, and further incubated for 6 hr. Add equal volume of Caspase-Glo 3/7 reagent to each well. Incubate at room temperature for 1 hr. Measure the luminescence. Highest caspase-3/7 activity when treated at the PL9443 0.08 nM in the light irradiation condition.

Cell viability

들깻잎으로부터 분리한 PL9443 물질이 세포의 생육에 어떠한 영향을 주는지 살펴보기 위하여 cell viability assay를 실시하여 결과를 Fig. 4에 나타냈다. U937세포의 cell viability 측정은 세포를 분주하고 물질을 처리하지 않은 곳의 cell 생육을 cell viability 100%로 하여 각 처리구들을 비교하였다. Apoptosis를 유도하는 ADCL을 처리한 곳에서는 약 10%의 세포 생존율을 나타내었으며, PL9443 물질을 처리하고 광을 조사한 곳에서는 처리농도에 따라 세포 생존율이 감소하는 것을 볼 수 있었다. PL9443을 0.08 nM 농도로 처리한 곳에서는 약 50%의 세포생존율이 확인되었고, 0.17 nM 농도로 처리한 곳에서는 약 14% 생존, 0.32 nM 농도로 처리한 곳에서는 0.1% 미만의 세포 생존율을 보였다(Fig. 4). PL9443 물질을 처리하고 암조건에서 배양한 처리구에서는 모두 음성대조군인 DMSO 처리구와 유사한 세포 생존율을 나타내었다.

Fig. 4.The growth inhibitory effects of U937 cells when treated with the compound PL9443 (0.04, 0.08, 0.17, 0.32 nM) for 4 hr, irradiated with light for 10 miniutes or kept in dark, and further incubated for 6 hr. Add a volume of CellTiter-Glo 2.0 reagent equal to the volume of cell culture medium in each well. Incubate at room temperature for 10 minutes. Record luminescence. Cytotoxicity appeared concentration dependent only in the light irradiation condition.

DNA fragmentation

Apoptosis가 일어날 때 나타나는 전형적인 현상은 apoptotic body가 형성되고, DNA fragmentation이 일어나게 되는데 necrosis에서도 DNA fragmentation 일부 발생하는 경우도 있다. 세포사멸이 apoptosis에 의한 것인지 necrosis에 의한 것인지를 구분하는 방법에는 물질을 처리한 세포로부터 DNA를 분리하여 전기영동을 실시했을 때 DNA ladder 현상과 caspase 활성이 증가하면 apoptosis에 의한 사멸로 판단한다. PL9443 물질에 의한 세포사멸이 apoptosis인지 necrosis인지 확인하기 위하여 DNA 전기영동을 실시한 결과는 Fig. 5에 나타냈다. 음성대조군인 무처리와 DMSO를 처리한 곳의 세포에서는 DNA ladder 현상을 확인할 수 없었고, ADCL을 처리한 곳의 세포에서는 DNA fragmentation이 일어난 것을 관찰할 수 있었다. PL9443 물질을 처리하고 광을 조사한 처리구에서는 U937 세포에서 ADCL 처리구와 같은 DNA ladder 현상을 관찰하였고, 암조건에서 배양한 처리구는 세포만 배양한 것과 같이 DNA ladder 현상이 나타나지 않았다. 따라서 PL9443 물질에 의한 세포사멸은 광과민성물질의 광역학활성에 의한 apoptosis 유도에 의한 세포사멸이라는 것을 알 수 있었다.

Fig. 5.Detection of DNA fragmentation in U937 cells. Cells were treated PL9443 compound (4.25 nM) for 4 hr, irradiated with light for 10 min or kept in dark, and further incubated for 6 hr. DNA was extracted with lysis buffer, treated with proteinase K and RNase for 1 hr, respectively. Fragmented DNA was elecrophored on 1.6% agarose gel and visualized staining with ethidium bromide. Line Marker using 100 bp size marker.

광과민성물질 구조동정

들깻잎에서 순수 분리한 PL9443물질의 기본 골격을 확인하기 위하여 1H-NMR과 13C-NMR을 실시하였다. 1H-NMR spectrum 결과를 Table 1에 나타냈으며, 4개의 methine기 signal이 8.639 (20-H, s), 9.499 (5-H, s), 9.622 (10-H, s), 8.029 (31-H, q)ppm에 각각 나타나는 것을 확인할 수 있었으며 이는 porphyrin 환을 갖는 화합물들에 특이적으로 나타나는 methane기 signal과 일치하는 것을 확인할 수 있다[1, 10].

Table 1.1H-NMR chemical shift of PL9443 compound (600 MHz, CDCl3)

Chlorophyll 화합물은 약 20개의 탄소로 phytyl기를 가지는데 이 phytyl기는 0.5~1 ppm부근에 multiple signal로 나타나는데 PL9443물질에서는 phytyl 기의 signal을 확인할 수 없었으므로 phytyl기가 잘려나간 구조라는 것을 알 수 있었다. Chlorophyll의 porphyrin 환 중심에는 Mg이온이 존재하는데 구조적 결합력이 약하기 때문에 쉽게 탈리가 되면서 NH결합이 형성되어 minus 부분에 - NH signal이 나타나게 된다. 분리한 물질의 1H-NMR spectrum 에서 -1.65 ppm에 signal이 확인되어 Mg이 떨어진 것을 확인할 수 있었다. 31과 32-vinyl carbons에 결합하고 있는 - H은 31 - H (7.98, dd), 32-H (H trans, 6.28, d), 32-H (H cis, 6.17, d)에서 확인할 수 있었고, 7C에 - CH3기가 결합하고 있으면 chlorophyll a유도체이고, -CHO가 결합하게 되면 chlorophyll b유도체가 된다. 1H-NMR spectrum결과 7C-CH3 signal이 3.22 ppm에서 double let으로 나타남으로써 chlorophyll a의 기본구조를 갖는 porphyrin화합물이라는 것을 알 수 있었다. 13C-NMR 결과를 보면 Chlorophyll carbon수는 55개인데 분리한 PL9443물질의 13C-NMR 분석결과 37개의 carbon signal이 확인되어 phytyl기가 떨어져 나간 것이 1H-NMR 결과와 일치하였으며, 30~40 ppm 사이에 나타나는 phytyl기의 carbon signal이 분리한 물질의 spectrum에서 나타나지 않았다. Chlorophyll a의 13C-NMR spectrum에는 131-keto carbon, 133-와 173-carbonyl carbon, 5-, 10-, 20-methine bridge carbon, 175 phytyl carbon, 31과 32-vinyl carbons의 signal이 특징적으로 나타나는 구조이다. 분리한 물질의 13C-NMR chemical shift값(Table 2)을 보면 keto carbon [δ189.556 (C-131)], carbonyl carbon [δ69.59 (C-133), 171.15 (C-173)] methine bridge carbon [δ 93.13 (C-20), δ97.57 (C-5), δ104.45 (C-10)], vinyl carbon[δ128.91 (C-31), δ122.79 (C-32)]의 signal이 보고된 논문들과 동일하게 나타났다[9, 14]. 그리고 광역학활성을 갖는 porphyrin 화합물에는 131-C와 132-C 사이에 lactone구조를 갖는 화합물도 존재하고, 132-C에 - OH기가 결합하는 경우도 있다[9, 14]. 분리한 물질의 spectrum에서 131-C가 189.56 ppm에 132-C는 64.67 ppm에서 signal이 확인되어 lactone 구조가 아님을 알 수 있었다. 1H-NMR spectrum과 13C-NMR spectrum 결과를 종합해보면 chlorophyll a의 기본 porphyrin 환을 갖는 구조에 Mg이온이 탈리되었고, pythyl기가 잘려진 구조를 하고 있는 것으로 확인되었다. 그리고 분리한 물질의 분자량을 측정하기 위하여 FAB-MS 분석을 실시한 결과, PL9443구조에서 -CH2기가 떨어져나간 [M-CH2]+1형태의 607 fragment signal이 확인되어졌는데, HMBC-NMR분석에서 176-H3의 H signal (1.258 ppm)과 175-C signal (60.387 ppm) 사이에 상관관계가 있었고, 175-H2의 H signal (4.123 ppm)은 176-C 및 173-C signal (171.149 ppm)과 상관관계가 확인되어져 ethyl ester구조임을 알 수 있었다. 132-H signal은 1H-NMR에서 6.251 ppm에서 signal을 확인할 수 있었고, HMBC분석에서 14-C, 131-C, 133-C와 상관관계가 확인이 되어져 -OH기가 아닌 -CH라는 것을 확인할 수 있었다. 1D, 2D NMR 및 MS data를 종합해 보면 들깻잎에서 분리한 광과민성 물질은 분자량 620.7의 pheophorbide a ethyl ester로 구조를 동정하였으며, dark green의 porphyrin 화합물이었다(Fig. 6).

Table 2.13C-NMR chemical shift of PL9443 compound (600MHz, CDCl3)

Fig. 6.Structure of purified photosensitizer PL9443 compound. PL9443 compound was determined to be pheophorbide a ethyl ester of C37H40N4O5.

 

고 찰

광역학 치료의 효과는 수백년 전에 이미 인식이 되었으나 체계적인 개발을 통하여 임상에서 이용하기 시작한 것은 최근의 일이다. 1980년대부터 본격적으로 연구되어 1990년대 들어 캐나다, 독일, 일본 등에서 임상시술이 승인된 이래 미국의 FDA가 1996년에 식도암 치료허가를, 1997년에는 초기 폐암치료에 대해 승인한 바 있다. 또한 폐암과 식도암에서 공인된 치료법으로 승인되었고, 담관암, 자궁경부암, 비뇨기암, 피부암 등과 같은 다양한 암질환에서 이용되고 있다[8]. 광역학 치료에 사용되는 광과민성물질들은 미토콘드리아, 라이소좀, 골지체, 소포체 등 세포소기관에 축적되어 세포사멸을 유도한다[17, 23]. Hematophorphyrin 유도체(HpD)를 근간으로 하는 제1세대 광감작제인 PhotofrinⓇ과 PhotogemⓇ은 종양조직의 침투에 한계가 있고, 체내 배설시간이 길다는 점과 치료 후 피부에 광선과민증을 장시간 유발하는 등의 단점이 있어, 최근에는 더 좋은 반응성을 가지고 체내에서 빠른 대사를 보이는 chlorophyll 유도체(CpD)를 이용한 광감작제가 개발되어 이들의 물리화학적 특성과 작용기전에 대한 많은 연구들이 이루어지고 있다[9, 12]. 또한 porphyrins, chlorins, bacteriochlorins, porphycenes 등의 다양한 광과민성물질이 개발되어 이에 대한 물리화학적 특성과 작용기전에 대한 연구가 이루어지고 있다[21].

본 연구에서 U937세포에 들깻잎(P. frutescens) MeOH 추출물을 처리하고 광을 조사한 처리구에서 세포사멸이 유도되는 것을 확인할 수 있었고, 암조건에서는 물질처리에 따라 세포생육에 대한 영향이 없었다. 이에 들깻잎추출물로부터 광역학활성을 나타내는 물질에 대한 가능성을 확인하였고, 광역학활성을 보이는 물질을 순수 분리하였다. 들깻잎 MeOH 추출물을 3번의 open column chromatography와 1번의 thin layer chromatography를 실시하여 광역학활성을 지니고 있는 물질을 순수 분리하여 PL9443으로 명명하고 TLC와 HPLC로서 purity를 확인한 결과, single spot과 single peak를 확인할 수 있었다. 순수 분리한 PL9443을 U937 세포주에 농도별로 처리하고 세포의 형태변화와 cell viability, caspase activity 및 DNA fragmentation을 광을 조사한 조건과 광을 조사하지 않은 조건으로 실시하였다. 그 결과 세포 형태변화는 세포가 축소되고, 소낭으로 분열화 되는 apoptosis 유도가 주요 세포사멸현상이었으며, 부분적으로는 세포가 팽윤하는 현상도 관찰되어 necrosis 현상도 관찰되었다. Caspase 활성과 DNA단편 등의 결과를 종합해보면 PL9443물질에 의한 세포사멸은 apotosis 유도에 의한 것이 주된 기작으로 판단된다. Cell viability로 세포독성을 확인한 결과는 농도의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. Caspase 활성화는 apoptosis 유도확인에 중요한 인자로 pro-enzyme의 형태로 존재를 하다가 TNF-α 또는 Fas ligand가 수용체에 결합하게 되면 caspase가 활성화 되어 염색체 DNA 분절화를 일으킨다[2, 13]. PL9443을 처리하고 caspase 활성을 조사한 결과에서도 농도의 증가에 따라 활성이 증가하였으며, 광의존적으로 활성이 나타났다. PL9443을 0.04 nM, 0.08 nM, 0.17 nM 및 0.32 nM 농도로 처리한 곳에서는 양성대조군인 ADCL 2 μl/0.1 mM/well 처리하여 완전히 apoptosis가 일어났을 때를 기준으로 비교했을 때 각각 45%, 99.9%, 80%, 8%의 caspase 활성을 나타났다. 0.08 nM의 농도에서 가장 높은 caspase 활성을 보였고, 그 이상의 농도에서는 도리어 caspase 활성이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 0.17 nM 이상의 농도에서 caspase의 활성이 저하되는 것은 높은 농도에 의한 세포사멸이 빠르게 일어나 활성을 조사하기 전에 효소의 비활성화가 일어난 것으로 판단된다. 이는 M. phalerlata의 butanol 추출물을 처리하고 배양시간에 따른 caspase-3, 8, 9의 활성유도에서 특정 시간대에서 가장 높은 caspase 활성을 보인 후 시간이 경과할수록 활성이 저하된 연구결과[6]와 penta-O-galloyl-β-D-glucose의 처리농도에 따른 caspase-1, 3의 활성유도에서 caspase-3의 활성이 특정 농도에서 가장 높은 활성을 보인 뒤 그 이상의 농도에서 활성이 저하되는 것에 대한 연구결과[20]에서 보고한 결과와 동일한 결과였다.

들깻잎 추출물로부터 순수 분리한 PL9443은 분자량 620.7의 Pheophorbide a ethyl ester로서 광을 조사한 곳에서만 apoptosis가 유도되었기 때문에 들깻잎추출물을 광역학적치료에 활용할 수 있을 것으로 본다.