Association of Insulin-related Genes Expression with Carcass Weight in Loin Muscle of Korean Cattle (Hanwoo)

한우 등심조직 내 인슐린 조절 유전자의 발현이 도체중에 미치는 영향에 관한 연구

Abstract

The peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) signaling pathway is well known as a candidate pathway related to meat quality in mammals. In particular, there are many studies on the relationship between the PPAR signaling pathway and intramuscular fat. However, recent studies have demonstrated that genes in the PPAR signaling pathway are associated with carcass weight in cattle. Among 48 genes in the PPAR signaling pathway, 16 genes are related to the insulin that regulates the adipocyte glucose metabolism and thus affects body weight. Therefore, we conducted an investigation to try to identify candidate genes associated with the carcass weight and relationships between the expressions of these 16 genes in the loin muscle of Hanwoo (Korean cattle). From regression analysis, the three genes (ACSL6, FADS2, and ILK) showed significant effects with regard to carcass weight (p<0.05). Finally, we analyzed the common regulators of the significant genes from pathway analysis. The significant genes are regulated by insulin as well as D-glucose. These findings show that the differentially expressed genes are possible candidate genes associated with carcass weight in the longissimus muscle of Korean cattle.

PPAR signaling pathway는 지방대사와 지방세포 분화를 조절하는 대표적인 대사회로이기 때문에 가축에 있어서 주로 육질과의 연관성 연구가 진행되었다. 하지만, 최근 들어 육량(체중)과 관련이 있다는 연구결과가 보고되고 있다. 본 논문에서는 PPAR signaling pathway에 존재하는 48개 유전자 중에서, pathway 분석을 통하여 체중에 가장 영향을 주는 인슐린 대사 호르몬에 의해 조절 받는 16개 유전자를 선별하여 거세 한우 20두에서 유전자 발현을 조사하였다. 유전자 발현과 도체중과의 관련성 분석을 위하여 회귀분석을 수행하였으며, 3개 유전자(ACSL6, FADS2, ILK)가 통계적으로 유의한 결과(p<0.05)를 보였다. 마지막으로, pathway 분석을 통하여 한우의 도체중과 관련이 있는 3개 유전자를 공통적으로 조절하는 포도당(D-glucose)이 존재함을 확인하였다.

서 론

현재 한·유럽연합(EU), 한·미 자유무역협정(FTA) 체결에 이어 영연방 3개국(호주, 캐나다, 뉴질랜드) 및 중국 등과 FTA 협상이 진행되면서 수입 쇠고기에 대한 경쟁력 제고를 위해 한우 고기의 육질 고급화 및 육량 증가를 위한 개량을 강화해야 한다는 필요성이 대두되고 있다. 한우의 등급판정에 있어 소 도체의 품질은 육량 및 육질로 평가하며, 육량등급은 도체 중, 등지방 두께, 배최장근 단면적을 측정하여 육량지수를 산정한다. 한우는 육질을 목표로 지난 30여 년간 개량을 통해 근내지방도는 높아졌지만, 상대적으로 육량 등급은 떨어지는 실정이다. 따라서 육질 개선 연구뿐 아니라 육량을 보완할 수 있는 연구가 동시에 진행되어야 할 것이다. 도체중은 근육 또는 결합조직(connective tissue), 체지방(body fat)의 발달에 따라 영향을 받으며, 최종적으로 육량 변화의 요인으로 작용하게 된다. 도체중의 변화는 여러 요인들의 복합적인 영향의 요인이므로, 하나의 원인 유전자를 탐색하는 것보다 특정 대사 회로에 존재하는 유전자군의 변화와 그들의 상호작용에 대한 이해가 필요하게 된다. 이와 같이 최근 연구는 체중에 영향을 주는 대사회로 및 작용기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. Mammalian target of rapamyosin (mTOR) 대사회로의 인산화는 양의 태아 근육 조직의 근원세포(myoblast) 분화 및 2차 근섬유(myofiber) 형성을 저해하게 되고, 골격 근육 단백질 합성을 감소시켜 최종적으로 도체중의 감소를 유발시키게 된다고 보고되었다[38]. 또한, 한우에서 adaptive thermogenesis pathway에 관여하는 peroxisome proliferator-activated receptor-c coactivator-1a (PPARGC1), mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MAP2K6), uncoupling protein 2 (UCP2) 유전자가 등지방 두께 및 배최장근 단면적에 유의한 결과를 보이며 지방과 에너지 대사회로에 관여하여 최종적으로 도체형질에 영향을 준다는 연구가 진행되기도 하였다[34].

PPAR signaling pathway는 핵 호르몬 수용체(nuclear hormone receptor)군에 속하는 Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs)를 중심으로 구성된 지방대사(lipid metabolism)와 지방세포 분화(adipocyte differentiation)에 관여하는 대표적인 대사회로이다[12]. 특히 가축에 있어 육질 형질에 관여하는 후보유전자 탐색 연구로 PPAR signaling pathway에 대한 다양한 연구[8, 28]가 진행되고 있지만, 최근 들어 육질뿐만 아니라 육량에 관여한다는 연구들이 보고되고 있다[11, 26]. PPAR signaling pathway의 최상위 조절인자인 3개 아형(α, δ, γ)은 레티노 산 수용체(retinoic acid receptor, RAR)와 이합체(heterodimer)를 이루어 작용한다. 특히 PPAR gamma는 에너지 대사에서 인슐린의 감수성(insulin sensitivity)을 증가시키는 thiazolidinedione (TZD) 계열에 대한 수용체로써 체내 포도당 이용률을 증가시켜 인슐린 감수성을 향상시키는 역할을 한다[21]. 뿐만 아니라, PPARs 유전자의 발현은 인슐린, 당질코르티코이드(glucocorticoids) 조절에 의해 지방세포 호르몬인 leptin, adiponectin 등을 활성화시켜 에너지 대사를 조절하여 최종적으로 체중 및 체지방의 변화를 유도한다[13, 35]. 이러한 점을 살펴보았을 때, PPAR signaling pathway는 사람뿐만 아니라 가축에 있어 육량 형질을 개량시킬 수 있는 후보 유전자군 및 그에 대한 유전자간 상호관계를 밝힐 수 있는 유용한 대사회로라고 판단된다.

본 연구는 소의 PPAR signaling pathway에 관여하는 48개 유전자를 대상으로 Ᵽpathway 분석을 통해 체중 조절에 중요한 역할을 담당하는 인슐린과 연관성을 보이는 16개 유전자를 선정한 후 한우 집단 20두를 대상으로 유전자 발현 양상과 육량 형질을 대표하는 도체중과의 관련성을 살펴보았다. 유전자의 발현량과 도체중과의 관련성 분석결과 3개의 유전자 Acyl-CoA synthetase long-chain family member 6 (ACSL6), Fatty acid desaturase 2 (FADS2), Integrin-linked kinase (ILK)가 도체중과 관련성이 확인되었으며, 이러한 결과는 향후 한우 육량 형질 개량을 위한 좋은 후보 유전자로 활용될 수 있을 것으로 보인다.

 

재료 및 방법

공시재료

유전자의 발현양상과 도체중과의 관련성 분석을 위하여 국립축산과학원에서 생산한 한우 고급육 생산용 배합사료를 사용하여 동일한 조건으로 사양된 28~30개월령의 거세 한우 20두를 활용하였다. 동물실험은 축산과학원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인(승인번호 8552)하에 수행되었다. 유전자 발현분석을 위한 시료는 도축 후 30분 이내에 왼쪽 도체의 12-13번째 갈비뼈 사이의 등심육을 채취하여 액체질소로 급속 냉동 한 후 사용 전 까지 -70℃에 보관하며 사용하였다(Table 1).

Table 1.Summary statistics of tissue sample for gene expression analysis (Mean ± SD)

총 RNA 추출 및 cDNA 합성

한우 등심 육으로부터 총 RNA의 추출, cDNA의 합성 및 Real-time PCR을 통한 유전자 발현량 분석은 기존에 보고된 방법을 약간 변형하여 아래와 같이 진행하였다[18]. 등심 육으로부터 총 RNA는 TRIzol (Invitrogen Life Technologies, USA)을 이용하여 다음과 같이 진행하였다. 액체질소를 이용하여 곱게 마쇄한 시료 0.1 g에 TRIzol reagent 1 ml를 첨가하여 잘 혼합한 후 10분간 13,000 rpm에서 원심분리한 후 상등액을 취하였다. 얻어진 상등액에 chloroform 0.2 ml를 첨가하고 혼합한 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 다시 상등액을 취하고, 상등액에 동량의 isopropanol 첨가 후 원심분리하여 RNA pellet를 획득하였다. 획득된 RNA pellet은 70% 에탄올을 이용하여 세척한 후 건조하고, DEPC를 처리한 멸균증류수에 녹여 사용하였다. RNA 추출을 위해 사용한 chloroform, isopropanol, 에탄올 및 DEPC는 모두 Sigma 회사의 제품을 사용하였으며, 추출된 총 RNA는 RNeasy MiniElute cleanup kit (Qiagen Co., Ltd., USA)을 이용하여 정제 후 cDNA 합성에 이용하였다.

조직으로부터 추출된 총 RNA는 유전자 발현분석을 위한 cDNA 합성에 이용하였다. 총 RNA 2 μg에 random primer (Promega, USA) 1 μl, 2.5 mM dNTP 1 μl를 첨가하고, DEPC를 처리한 증류수로 총 12 μl가 되도록 하였다. 65℃에서 5분간 변성 후 즉시 얼음 위에서 냉각한 후 5X buffer 4 μl, 0.1 M DTT 2 μl, RNase inhibitor (Promega) 0.5 U 및 reverse transcriptase (SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase, Invitrogen Life Technologies) 1 μl를 첨가하여 42℃에서 60분간 반응시킨 후, 70℃에서 15분간 반응시켜 reverse transcriptase를 불활성화 시킨 후 Real-time PCR의 주형으로 사용하였다.

Real-time PCR을 통한 유전자 발현분석

유전자의 발현양상을 분석하기 위하여 Real-time PCR법을 이용하였다. 시료로부터 추출된 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA 0.2 μg을 주형으로 2X Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, UK)와 각각의 primer set을 이용하여 7500 Real time PCR system (Applied Biosystems)을 통하여 분석하였다. 유전자 분석에 사용된 각 유전자의 primer는 Table 2에 나타내었다. 각 PCR 반응은 95℃에서 10분간 예비 변성한 후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 40회 반복하여 수행하였다. PCR 반응 종결 후 melting curve 작성을 통하여 유전자 증폭의 정확성을 재확인하였다. 유전자 발현량 내부 보정을 위해 4개의 house keeping 유전자 (GAPDH, ß-actin, RPLP0 및 18S rRNA)의 발현을 조사하여 gene-stability 값을 기준으로 가장 안정된 발현을 보이는 2개의 유전자를 선발하였다. 선발된 2개의 유전자 ß-actin과 18S rRNA의 발현량을 이용하여 각각의 유전자 발현량을 보정하였고, 보정된 발현량을 이용하여 통계분석에 사용하였다. House keeping 유전자의 선발 및 발현량 보정은 R의 'SLqPCR' package [19]를 활용하였다.

Table 2.Primer sequences for real-time PCR

통계분석

유전자의 발현량이 도체중에 미치는 영향을 분석하기 위하여 R statistical program의 Ɍregression 모델을 이용하였고, 분석에 사용한 모형은 다음과 같다.

CWij = μ + Expressionj + Agej + eij

여기서, CWij는 도체중, μ는 전체 평균, Expressionj은 각 유전자의 발현량, Ageij는 도축연령(개월) 및 eij는 잔차에 대한 벡터를 나타낸다.

 

결과 및 고찰

본 연구는 소의 육질 및 육량형질과 관련성이 보고된 PPAR signaling pathway에 존재하는 48개 유전자 중에서 체중 조절에 가장 큰 영향을 미치는 인슐린과 관련된 유전자를 선발하고, 선발된 유전자의 발현과 한우 도체중과의 연관성 분석을 위해 진행되었다. PPAR signaling pathway에 존재하는 48개 유전자 중에서 인슐린과 상호작용을 하는 유전자를 선발하기 위하여 Pathway studio (version 6.0, Stratagene, La Jolla, CA) [30]를 활용하였다. Pathway studio는 기존 보고된 문헌을 바탕으로 유전자와 유전자의 상호작용을 추출해주는 소프트웨어로써, 선정된 16개 유전자와 인슐린과의 관련성에 대한 문헌자료는 Table 3에 정리하였다. 선정된 16개 유전자에 대하여 동일한 사양 조건으로 사육된 거세 한우 집단 20두를 대상으로 유전자 발현량을 분석하였고, 발현량과 도체중과의 관련성 분석을 위해 회귀분석을 실시하였다. 그 결과, ACSL6, FADS2 및 ILK 유전자의 발현이 도체중에 있어 유의한 결과(p<0.05)를 보임을 확인하였다(Table 3, Fig. 1).

Table 3.aExpression shown as the mean and standard error (SE) of normalized expression value of each gene within samples. bP value was calculated using the regression analysis.

Fig. 1.The regression plot between gene expression and carcass weight. The x-axis and y-axis represent the carcass weight and the normalized gene expression value, respectively.

Acyl-CoA synthetases (ACS)는 지방대사, 특히 지방산 산화(fatty acid oxidation)에 관여하는 유전자이며, acyl-CoA synthetase long-chain (ACSL)는 1, 3, 4, 5 및 6의 5가지 형태가 존재하는 것으로 알려져 있다. QTL 연구를 통해 ACSL4가 돼지의 oleic acid 함량과 성장에도 관련되어 있다고 보고되었으며[27], ACSL6는 불포화지방산 대사와 관련되어 있다고 보고된바 있다[23]. 현재까지 ACSL에 대한 가축 형질과의 관련성 연구는 부족한 실정이며, 특히 육량 형질에 대한 연구는 아직 보고된 바 없다. 그러나 본 연구에서 유전자들의 발현량과 도체중과의 관련성을 분석한 결과 지방대사에 관여하는 ACSL6 유전자가 도체중과 양의 상관관계가 있음을 확인하였다. 근육의 성장에 있어 ACSL6 유전자의 발현은 glucose 대사에 관여하는 Glucose transporter type 4 (GLUT4) 유전자와 함께 증가됨을 확인하였고[3], myostatin-null (Mstn-/-) 모델을 이용한 유전자 발현 연구를 통해 myostatin 결핍 마우스에서 지방대사에 관여하는 ACSL6 등의 유전자 발현이 증가됨이 확인되었다[37]. 이러한 ACSL6 유전자의 발현 증가는 PPAR signaling pathway의 활성화에 따른 지방산 산화와 밀접히 관련되어 있다고 보고하였다. 일반적으로 myoststin은 근육의 발달에 관련된 유전자로 알려져 있으며, myostatin의 결핍은 조직 내 지방산 산화의 증가를 유도하여 지방의 이용성을 증가시키고, 이로 인해 지방조직 부피의 감소 및 근육량의 증가를 초래하는 것으로 알려져 있다[24, 25]. 또한 사람을 대상으로 한 지방산 산화와 지방축적 및 체중변화에 대한 연구에서 지방산 산화의 감소는 지방의 축적을 증가시키고 체중의 감소를 유발하는 것으로 확인되었다[17]. 이러한 선행 연구 결과들을 종합해 보면 지방 대사, 특히 지방산 산화가 체중과 밀접하게 관련되어 있음을 확인할 수 있으며, 본 연구에서 나타난 ACSL6 유전자의 발현량과 도체중과의 양의 상관관계에 대한 결과를 설명하는 좋은 연구 결과라고 생각된다.

FADS2는 포화지방산을 불포화지방산으로 전환하는 효소로, 지방산의 대사뿐만 아니라 세포신호전달기전, 막의 이온 채널 조절 등 다양한 기능에 관여한다고 알려져 있다[4, 21]. Renaville 등의 유전자변이(SNP)와 지방 및 지방산 함량과의 관련성 연구에 따르면, FADS2 유전자 변이는 등심육의 지방 함량 및 arachidonic acid와 관련성이 있다고 보고하였고[33], 리무진 소 근육에 있어 FADS2 유전자 발현이 n-3 long chain polyunsaturated fatty acid (n-3 LC PUFA) 합성에 영향을 미치는 것으로 보고하고 있다[6]. 또한 FADS2 transgenic mice를 이용한 연구에 따르면, 근육 내 linoleic acid 함량이 19% 증가되며, 87%의 arachidonic acid 증가를 확인하였다[5]. 이러한 연구 결과들을 살펴보면, 잘 알려진 바와 같이 FADS2 유전자는 불포화지방산 생합성에 관여하는 주요한 유전자임을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라 FADS2는 최근 연구들을 통해 지방산 함량 등과의 관련성 이외에 도체 형질과 관련되어 있음이 보고되고 있다. Holstein-Friesian cattle을 대상으로 Whole genome association study를 통한 QTL 연구에서 PPAR signaling pathway에 관련된 유전자들이 소의 도체 특성과 밀접히 관련되어 있음을 확인하였고, 이중 FADS2 유전자가 도체중 및 도체 지방함량과 관련되어 있음을 보고하였다[9]. 또한 Zhu 등[39]은 FADS2 유전자 발현조절 영역 내 유전자변이(SNP)가 닭의 성장형질에 밀접하게 관련되어 있음을 보고하였다. 본 연구에서도 FADS2 유전자의 발현이 한우 도체중과 양의 상관 관계가 확인되었으며, 이러한 결과들은 PPAR signaling pathway 내 존재하는 FADS2 유전자가 지방함량 등 육질 형질뿐만 아니라 도체중과 같은 육량 형질과도 관련되어 있음을 나타낸다고 할 수 있다.

육량(yield grade)은 등지방 두께와 양의 상관관계(r=0.67)를 가질 뿐만 아니라[28], 도체중 역시 지방 함량(fat content)과 양의 상관관계(r=0.279, p<0.05)를 가진 것으로 보고된바 있다[16]. 또한 24개월령 앵거스 집단을 대상으로 지방산과 성장, 도체 형질과의 연관성 분석 연구에 따르면, 지방산 조성과 함량은 일당 증체량(r=0.50, p<0.01) 및 도체중(r=0.33, p<0.05)과 양의 상관관계를 가지고 있음이 확인되었다[36]. 이러한 결과로 살펴보았을 때, 육량 또는 도체중과 지방 형질에 관여하는 유전자군은 비슷한 대사회로 내에서 상호조절을 통해 형질을 결정할 것으로 판단되며, PPAR signaling pathway에서 지방산 조성(fatty acids composition)에 관련된 유전자인 FADS2 및 ACSL6 유전자가 근육 내 지방산 함량과 조성뿐만 아니라 도체 형질을 결정하는 등지방 두께, 배최장근 단면적, 체지방 형질을 결정하는 원인 유전자로 작용할 것이라 예측된다.

ILK는 세포 내에서 세포의 이동, 증식 및 신호 전달 등 다양한 기능을 지닌 유전자로, 근육 발달에 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있다[17]. Huang 등[15]의 근육을 구성하는 근원세포주(C2C12 myoblast) 근육분화유도 실험에서 ILK 유전자의 과발현 유도가 myogenin, MyoD 및 myosin heavy chin 등 근육조직 발생 및 발달에 관여하는 단백질의 발현에 영향을 미치는 것으로 보고하였다[1, 2, 32]. ILK 유전자에 의해 조절되는 myogenin 유전자는 근육발생(myogenesis)에 관여하는 주요 유전자로, myogenin 유전자 결핍 마우스 연구를 통해 myogenin 유전자의 발현이 근육의 양과 직접적으로 관련되어 있으며, 이는 돼지의 도체중량에 영향을 미친다고 보고하였다[10, 22]. 또한 Hannigan 등[14]은 ILK1이 insulin 조절에 관여하며, 근육세포 분화에 관여한다고 보고한바 있다. ILK 유전자가 근육세포 분화에 관여하며, 도체중에 영향을 미치는 myogenin 유전자 발현과 관련되어 있다는 보고는 있으나, 현재까지 ILK 유전자의 연구가 가축의 육량 형질과 관련되어 있다는 직접적인 보고는 없는 실정이다. 그러나 유전자의 발현과 도체형질과의 관련성을 연구한 본 연구에서 한우 집단 내 도체중과 유의한 관련성이 확인하였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 ILK 유전자가 근육조직의 발생 및 발달에 관여하는 다양한 유전자들을 조절하여 근육의 생성 및 성장, 그리고 체중에 영향을 미치는 것으로 판단되나, 앞으로 관련성에 대한 충분한 연구가 진행되어야 될 것으로 보인다.

마지막으로, Pathway Studio 소프트웨어를 활용하여 도체중과 유의한 관련성을 보인 3개의 유전자에 대하여 유전자간 상호작용 분석을 수행하여 공통적으로 유전자들과 관련성이 있는 인자를 탐색하였다. 그 결과 3개의 유전자는 인슐린에 영향을 받고 있는 것 이외에 포도당인 D-glucose라는 저분자 (small molecule)를 공통 조절인자로 공유하는 것을 알 수 있었다(Fig. 2). 포도당은 각 세포들의 에너지원으로 작용하며, 인슐린은 생체 내 근육과 지방조직에서 포도당을 흡수하여 이용할 수 있도록 유도한다. 또한 포도당과 인슐린은 매우 밀접한 관계를 가지고 있으며, 뇌, 췌장, 혈관세포 등에서 대사작용에 매우 중요한 역할을 한다. 인슐린 분비에 따른 간의 포도당 신생(gluconeogenesis) 및 당원분해(glycogenolysis)에 대한 대사 작용은 체중과 직접적인 관계가 있다고 보고되었다[4]. 따라서 인슐린과 포도당과의 상호작용은 3개 유전자 (ACSL6, FADS2 및 ILK)가 인슐린에 의해 조절되며, 포도당 역시 3개의 유전자 발현에 영향을 주는 요소로 작용할 수 있을 것으로 보인다.

Fig. 2.Pathway analysis of the significant genes. The common regulators of the significant genes based on the literatures. Each arrow indicates interactions between genes.

본 논문은 소의 PPAR signaling pathway에 관여하는 48개 유전자 중, 체중 조절에 관여하는 인슐린에 영향을 받는 16개 유전자를 대상으로 한우의 도체중과 유전자 발현에 대한 연관성 분석을 수행하였다. 그 결과 3개 유전자(ILK, FADS2 및 ACSL6)가 통계적으로 유의함을 확인할 수 있었으며, 유전자간 상호작용 분석을 통하여 인슐린 이외에 이들을 공통적으로 조절하는 포도당이 존재함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 향후 한우 육량 형질 개량을 위한 좋은 후보 유전자로 활용될 수 있을 것으로 보인다.