Electrochemical Evaluation of the Cherry Peroxidase Embedded Enzyme Electrode for the Determination of Hydrogen Peroxide

체리 과산화효소 고정 과산화수소 정량 효소전극의 전기화학적 고찰

서 론

전압전류법에 사용되는 전극은 용도, 모양 및 크기가 다양하기 때문에 전기화학자들은 전극물질을 화학적으로 개질시킨 전극의 개발에 몰두해 왔다.

효소전극은 제작의 용이성 및 경제성이 우선적으로 고려되어야 한다. 전극에 효소를 고정하는 방법에는 물리적 흡착법,1 스크린 프린팅법,2 졸-겔법,3 기능성 분자와의 공유결합,4 고분자 필름을 이용하는 방식5 등, 다양한 방법들이 있다. 탄소가루에 미네랄오일을 사용하여 전극으로 성형하는 탄소반죽법6도 이런 노력의 일환이며, 전극제작의 경제성이나 전기화학적 정량특성의 측면에서 우수성이 입증되었다. 그러나 탄소반죽은 기계적 물성이 확보되지 않기 때문에 실용화의 조건을 충족시키지 못하는 결점을 안고 있다.

이 문제의 해결을 위하여 본 연구실에서는 톨루엔에 녹인 스티렌 고무(SBR)를 결합재로 사용하여 최초로 효소 전극을 제작하고, 그것의 전기화학적 특성을 고찰하여 보고한 바 있다.7 모든 고무는 대체로 톨루엔에 잘 용해 되며, 전극 제작 후 용매의 빠른 휘발로 인하여 탄소반죽이 기계적 강도와 내마모성을 나타내기 때문에 결합재로서 SBR의 사용은 성공적이었다. 이런 결과를 바탕으로 지금까지 다양한 종류의 합성고무를 사용하여 연구영역을 확장해 왔다.8

여기서는 클로로술폰화 폴리에틸렌(CSM) 고무를 사용하여 전극을 제작하였다. CSM은 Reed-Horn 반응의 생성물로 유연하고 오일 등에 대한 화학적 내성이 좋으며, 쉽게 산화되거나 변성되지 않는 장점이 있다.9

본 실험에서는 이상의 사실들을 고려하여 생활주변에서 쉽게 구할 수 있는 벚나무 잎을 과산화효소원으로, CSM 고무를 결합재로 사용하여 효소전극을 제작하고 전압전류법으로 그것의 전기화학적 정량특성을 조사하였다.

다른 식물전극과 마찬가지로 벚나무 전극으로부터 얻은 Hanes-Woolf 도시는 좋은 직선성을 보여 주었다. 이것은 전극에 고정된 벚나무 과산화효소가 정상적으로 촉매력을 발휘하고 있음을 보여주는 것이다. 또 0.5보다 작은 대칭인자는 전극반응 속도가 전극전위의 작은 변화에 민감하게 감응하는 만족스런 결과였다. 이런 실험적 사실들은 우리의 생활주변에서 쉽게 구할 수 있는 벗나무 과산화효소가 HRP를 대체할 수 있음을 말하여 주는 것이다. 이 논문은 그 내용을 보고하고 있다.

 

실 험

시약 및 기구

호모게나이저로 균일하게 분쇄된 벚나무 잎 조직을 효소원으로 사용하였다. 전극물질은 흑연가루(Fluka, Anal. N. 378326/1 21698, ≤0.1 mm)였으며, 이것의 결합재는 톨루엔(Sigma-Aldrich, HPLC grade, ≥99.9%)에 녹인 CSM (Denki Kagaku Mitsui C.) 용액이었다. 기질로 35% 과산화수소(Junsei Chem. Co. Ltd.,)를, 전자 매개체로 페로센(ferrocene, Sigma, F-3375)을 사용하였으며, 지지전해질은 NaCl(Shinyo pure Chem. ≥95.5%)이었다. 순환전압전류 그림은 Ag/AgCl(BAS MF 2052) 기준전극과 Pt 대전극(BAS MW 1032)이 장착된 BAS Model EPSILON(Bioanalytical System, Inc., U. S. A.)를, 일정전위 전류측정은 Kipp & Zonen X-t 기록계가 연결된 EG&G Model 362 (Princeton Applied Research, U. S. A.)를 주로 이용하였다. 데이터의 시뮬레이션은 Origin 7(ExpDec 1 & Boltzmann fit)을 이용하였다.

전극 제작

0.09 g의 페로센을 CHCl3 10 mL에 녹인 후 0.91 g의 흑연가루를 넣어 완전히 혼합한 후, 샬레에 얇게 펴 실온에서 건조시킨다. 이 가루와 1.5% CSM 고무용액을 1:1 (wt/wt)로 합하여 반죽하고, 이것 1 g에 벚나무 잎 조직 0.2 g을 혼입시킨다. 오옴 접촉을 갖는 깊이 1 mm, 직경 6.67 mm의 원형 폴리에틸렌 튜브에 이 반죽을 채우고 시약주걱으로 전극표면을 평면으로 성형하여 작업전극으로 사용한다.10 사용하지 않을 때는 증류수에 담아 4 °C의 냉장고에 보관한다. 이후 이 전극은 체리전극으로 부를 것이다.

 

결과 및 고찰

체리전극은 여러 가지 물질 즉 흑연가루, 전자 매개체로 사용되는 페로센, 효소원인 벚나무 잎 조직, 결합재 CMS 고무로 구성되어 있으므로, 이들 성분 각각의 전기화학적 활성이 검토되어야 한다. 페로센은 전기화학적 가역성이 우수한 물질로서, 전자 매개체로 흔히 사용되는 물질이다. SBR을 결합재로 사용한 계의 경우, 페로센은 +197 mV(vs Ag/AgCl) 부근에서 최대 산화-환원 봉우리를 보여 주었으며, –625 mV에 이르기까지 어떤 활성도 보이지 않았다.11,16 본 실험의 실험전위 영역(−100 ~ −450 mV)은 페로센의 산화-환원 영역에서 크게 벗어나는 것이며, CMS을 이용하여 만든 전극물질의 과전압이 SBR의 것과 크게 다르지 않다고 가정할 때, 페로센은 이 영역에서 이미 환원된 상태로 존재하므로 도체의 역할만을 하는 것으로 볼 수 있다. 따라서 페로센의 전기화학적 행동은 고려 대상에서 배제되어도 무방할 것이다.

CSM 고무와 벚나무 잎 조직은 구성성분을 확인할 수 없는 혼합물이다. 이들이 본 계에서 전기화학적 활성인 화학종을 포함하고, 그것이 전류를 생성할 가능성이 있지만 각각을 확인하는 것은 본 연구의 범위를 벗어난다. 그러나 본 계에서 이것이 문제가 되지 않는 것은 기질첨가 전후의 실험 조건이 동일한 상태에서 기질첨가에 기인한 신호의 차이만을 기질분해에 의한 전류로 간주하기 때문에, 다른 공통적 요인들의 기여는 측정치의 연산과정에서 제거된다.12

Fig. 1은 체리전극의 전기화학적 거동을 종합적으로 보여주는 4분절(a, b, c, d) 순환전압전류 그림이다. 전위주사의 순서는 a, b, c, d의 순이며, a, b는 기질을 가하기 전, c, d는 기질이 가해진 상태에서 얻은 것이다. a는 음전위주사 시 바탕전류가 증가하는 것을 보여주고 있는데, 이것은 계에 기질분해와 무관하면서 근원이 확인되지 않은, 전극 구성성분의 패러데이 전류 및 이중층 충전전류가 존재함을 뜻한다. c의 선상에 있는 화살표는 기질의 추가시점을 나타내는데, 기질이 추가된 직후 증가 경향성은 a와 비교하여 달라지기 시작하는 것을 볼 수 있다. c와 a의 차이는 기질의 유무 밖에 없다. 앞서 언급하였듯이 전극물질에 의하여 생성된 바탕전류는 c와 a에 공통적일 것이므로 c와 a의 차이는 순수한 기질분해에 의한 전류차로 볼 수 있다.

Figure 1.Four-segment cyclic voltammograms showing the difference between the electrolytic solution without (a, b) and with 2.0×10−2 M H2O2 (c, d) in a stirred solution. Initial potential : −100 (mV); switching potential 1 : −450 (mV); switching potential 2 : −100 (mV) ; final potential : −100 (mV); scan rate : 25 (mV/s). Arrow indicates a point of time of substrate addition.

Gouy와 Chapman은 용액과 금속의 계면에 형성된 이중층이 두 층 즉, 이온이 특수 흡착된 내부 조밀이중층(compact double layer)과 외부 확산이중층(diffuse double layer)으로 구성된 모형을 제안하였다.13 Fig. 2는 정지된 0.1 M NaCl 용액, 즉 기질이 포함되지 않은 용액 중의 체리전극에 –450 mV의 계단전위를 인가하였을 때, 이중층 충전전류가 측정시간에 따라 변화하는 것을 보여주고 있다. 그림에서 볼 수 있듯이 측정기기는 디지털화되어 있으므로, 초기전류(it=0)는 실험적으로 측정될 수 없다. 이것을 얻을 수 없다면 시간상수를 구할 수 없으며, 이것으로부터 도출되는 다른 전기화학적 파라미터들도 구할 수 없다. 여기서 초기전류를 구하고자 한다면, 계단전위 인가 후 얻어진 전류변화의 경향성을 t = 0(s)로 외삽하여 구하여야 한다. 0.100 M, 0.010 M, 0.001 M의 전해질 용액에서 얻은 충전전류의 변화가 Table 1에 주어져 있고, 이것들의 시뮬레이션 방정식이 Table 2에 함께 주어져 있다.

Figure 2.Time profile of the condenser current of the cherry electrode. Step potential: −450 mV (vs Ag/AgCl).

Table 1.Condenser current flow versus time at three electrolyte concentrations. Step potential: −450 mV (vs Ag/AgCl)

Table 2.Relationship between condenser current and step time. y (mA) = A1*exp(−t/t1) + y0.

Table 3은 세 용액으로부터 얻은 실측 시간상수, τ와 Table 2로부터 얻은 it=0 및 위 식으로부터 도출된 Rs와 C, Cd, Ci 및 포함하고 있다. 여기서 Ci는 조밀이중층의, Cd는 확산이중층의 커패시턴스이고, Ci는 Cd와 C의 직류 등가회로 관계식(1/C=1/Ci+1/Cd)으로부터 도출하였다.

Table 3.τ : time constant (obs); C : effective double layer capacitance (×10−4, F); Cd : capacitance of the diffuse double layer (×10−2, F); Ci : capacitance of the compact double layer (×10−4, F)

시간상수는 전해질의 농도가 증가함에 따라 감소하는 것을 볼 수 있는데, 이것은 전해질의 농도가 증가하면서 용액저항이 감소하여 이중층 형성이 용이하게 되는 것이며, 전해질 농도에 따른 it=0의 증가도 용액저항의 감소에 기인한 것으로 볼 수 있다. 또 전해질 이온의 농도 감소에 따른 합성 커패시턴스(C)의 증가는 용액의 유전률의 증가로 설명될 수 있다.

체리전극으로부터 얻은 Table 3의 값들은 수용액에서 일반적으로 얻어지는 값 10−30 μFcm−2보다 대단히 큰 것을 볼 수 있는데, 이것은 탄소가루를 둘러싸고 있는 결합재 고무층에 의한 콘덴서 내부의 유전율 증가에 의한 것으로 볼 수 있다.

Fig. 3은 Fig. 1의 c와 a의 실험조건에 해당하는 전류를 정지된 용액 중에서 선형주사 전압전류법(LSV)으로 얻고, 그것의 차 c~a를 전극전위에 따라 도시한 것이다. 지지전해질은 이동의 영향을 최소화할 수 있고, 정지된 용액이라면 대류의 영향은 무시될 수 있으므로 전기화학반응 속도는 확산에만 의존한다. 확산파는 반응전류가 흐르기 시작하여 최대값에 이르기까지 대체로 S 자형의 모양이다. 그러나 이 과정의 높은 전극전위에서 전해질의 분해에 의한 잡음이 포함된다면, 그 이상의 전위영역은 제한될 수밖에 없다. 그러므로 Fig. 3은 전극반응이 시작되어 패러데이 전류의 봉우리 값에 이르는 S자 형의 일부에 해당한다. 이것을 볼쯔만 방식으로 시뮬레이션한 i-E 함수 관계식은 아래와 같다.

Figure 3.Potential dependence of the biocatalytic current in 2.0×10−2 M H2O2 solution. Other conditions are the same as in Fig. 1.

i (mA) = −0.0019 + 0.7059/[1 + exp(E +0.3945)/0.06052]

여기서 전류는 면적 0.316 cm2의 전극으로부터 얻은 것이며, E는 인가된 전극전위(V)이다. n = 1일 때,14 음전위의 극한치(E → −∞)에서 얻은 한계전류(il,c)는 0.706 mA이며, 이것으로부터 도출되는 질량이동계수, mo (il,c/nFACo*)와 질량이동저항, Rmt (RT/il,cnF)는 각각 1.16×10−3 cm/sec 및 36.4 Ω이다.

Butler-Volmer 식의 Tafel 영역에서 과전압(η)에 대한 전류의 대수관계는 직선성을 보이며, 기울기(−αnf, f =F/RT)와 절편(lni0)으로부터 각각 대칭인자(α)와 교환전류밀도(io)를 도출할 수 있다. Fig. 4는 Fig. 3으로부터 도출한 Butler-Volmer 도시이며, 대체로 직선성을 보여주고 있고, 기울기, −14.1과 절편, −13.5로부터 얻은 대칭인자와 교환전류는 각각 0.36과 1.37×10−6A이다.

Figure 4.Tafel plot of the signal current.

전극전위의 변화에 의한 봉우리 높이의 유효변화는 대칭인자의 크기가 0.5보다 작은 경우에 크다. 생체조직 함유 효소전극의 대칭인자는 대체로 0.5보다 작은 경우가 일반적인데,15 Fig. 4로부터 얻은 체리전극의 대칭인자는 0.5보다 작은 0.36으로, 이 값은 전극감응속도가 전극전위변화에 민감하게 의존함을 뜻하며, 비교적 큰 값에 속하는 것이다.16

Fig. 5의 a는 –450 mV의 일정 전극전위에서 환류중인 전해질 용액 10 mL에 0.1 M H2O2 기질용액 100 μL를 8회 연속적으로 가했을 때 신호가 변하는 것을 보여주고 있다. 환류상태에서 질량이동 속도는 크고, 확산층의 성장이 억제되기 때문에 신호의 포화에 이르는 시간은 급격히 단축된다. b는 검출한계 도출을 위하여 10 mL 전해질 용액에 0.01 M 기질을 추가했을 때 신호에 미치는 잡음의 효과를 보여주는 것으로 5초 이내에 전류신호가 포화되는 것을 보여주고 있다.

Figure 5.Current-time plots caused by the successive increments of 100 μL of 0.1 M H2O2 (a) and by a single addition of 100 μL of 0.01 M H2O2 (b) to 10 mL of electrolytic solution for the determination of detection limit at –450 mV.

정확성(accuracy)만을 고려할 때 전기화학적 방법은 분광학적 방법을 뛰어 넘을 수 없다.14,17 전기화학적인 방법의 검출한계는 콘덴서 전류의 존재 때문에 제한적일 수밖에 없으며, Fig. 5의 b로부터 얻어진 검출한계는 1.0×10−4 M로 우수한 값이라 할 수 없다. 벚나무 잎 조직 및 매개체의 함량, 측정 시 전압, 온도, pH, 등의 인자를 최적화하면 향상될 수 있을 것이며, 이것은 분석의 경제적 비용 및 시료 처리의 신속성을 종합적으로 평가한다면 분광학적 방법에 대한 부족한 점을 보상하고도 남을 것이다.

Fig. 6의 창에 주어진 검정곡선은 Fig. 5a의 누적농도에 대한 신호의 크기로부터 얻은 것이다. 효소전극의 기질농도에 대한 감응의 직선범위는 대단히 좁아서 직선관계부터 쉽게 벗어나는 특징이 있다. 이것은 기질의 분해반응이 여러 단계의 반응일 경우, 효소가 여러 단계 중의 한 단계에만 촉매작용을 할 수 있고, 효소가 여러 동위효소로 구성되어 있을 경우 이들이 각각 다른 속도로 반응에 참여할 수도 있기 때문이다. 또 전극표면에 존재하는 활성 자리의 수가 제한되어 있기 때문에 기질 농도에 직선적으로 감응하지 못하는 것으로 볼 수 있다.

Figure 6.Hanes-Woolf plot for enzyme kinetics. Inset: the calibration curve elicited from Fig. 5a.

생화학반응의 속도(v)는 효소농도에 비례하지만 기질 농도(s)에 대하여 포화곡선의 형태를 취하므로 Hanes-Woolf 도시(s/v vs s)를 이용하여 효소 의존성을 판단하는 것이 편리하다.

Fig. 6은 검정곡선으로부터 도출한 Hanes-Woolf 도시이다. 좋은 직선성을 보여주고 있으며, 계의 기질분해가 체리조직이 포함하고 있는 과산화효의 촉매작용에 의하여 진행되고 있음을 말하여 준다. 여기서 얻은 최대전류와 Michalis 상수는 각각 1.1×10−6 A 와 5.1×10−3 M이다.

역반응 전류를 측정하고 그것을 정반응 전류와 비교하는 것은 화학반응의 가역성을 판단할 수 있는 간결한 전기화학적 방법이다.18 Fig. 7은 H2O2와 전해질 NaCl의 농도가 각각 1.0×10−2 M 및 1.0×10−3 M인 용액에 전극을 위치시키고, 제1계단 전위 –450 mV에서 1초, 그리고 제2계단 전위 0.0 mV (vs Ag/AgCl)에서 1초 동안 얻은 이중 계단 전압 전류 그림이다. Fig. 1을 참고하면 제1계단 전위와 제2계단 전위는 각각 기질의 환원과 산화가 일어날 수 있는 전위로 볼 수 있다. Table 4는 환원전위 인가시간, tf와 산화 전위 인가시간 tf+τ (τ = 1 sec)에서 측정된 if와 ir를 포함하고 있다. 완전가역계의 경우 –ir/if은 곡선 1−(1−τ/tr)1/2을 따른다. 그러나 Table 4를 그림으로 나타낸 Fig. 8은 측정 초기부터 현격한 차이를 보여주고 있다. tf = 0.001 s에서 −ir/if의 0.25이며, 과정중의 최대값이다. Fig. 1에서 언급하였듯이 계는 많은 양의 바탕전류를 포함하고 있고, 컨덴서 전류를 포함한 모든 상황은 전위가 역전된 후에도 공통적으로 적용될 것이다. 이런 사실을 고려할 때 0.25는 큰 값이라고 평가될 수 없다. 또 과산화수소의 환원생성물이 전해질인, 즉 물이라는 사실을 고려하면, 계에서 물의 산화반응은 없는 것으로 볼 수 있다. 따라서 본 계의 기질분해 역반응은 비가역 반응이라고 할 수 있을 것이다.

Figure 7.Current response of the double step chronoamperometry. Start potential : 0 (mV); first step E : −450 (mV); second step E : 0 (mV); [H2O2] : 0.01 M; [NaCl] : 1.0×10−3 M.

Table 4.The observed currents sampled during the forward (if) and the reversal step (ir) of the double step technique. 1−(1−τ/tr)1/2 is the theoretical value (τ=1 sec)

Figure 8.Working curve illustrating the tendency of Table 4.

 

결 론

CSM 고무를 녹인 톨루엔 용액을 탄소가루의 결합재로 사용하여 탄소반죽을 만든 후, 거기에 파쇄된 벚나무 잎 조직을 혼입시켜 과산화수소 정량 바이오센서를 제작하고, 그것의 전기화학적 특성을 전압전류법으로 살펴보았다. Gouy-Chapman 모형에 근거하여 도출한 전기화학적 파라미터들은 전극의 감응이 정량적이며, 0.36의 대칭인자는 전기화학적 속도론이 인가 전극전위 변화에 대하여 민감한 것을 보여주었다. 또 t100% = 5 s의 감응 포화시간은 지금까지 개발된 전극 중에서 가장 짧은 것이었으며, 작은 –ir/if 값은 기질의 분해가 비가역 반응임을 보여 주었다. 여기에 보고된 일련의 실험적 사실들은 벚나무 조직이 시판되는 HRP의 대체 가능성을 확신하게 하는 것이었다.