Effect of Temperature on Growth Rate and Protease Activity of Antarctic Microorganisms

극지 미생물들의 배양온도에 따른 성장률 및 protease activity 영향 연구

Abstract

This study was conducted to investigate the effect of culture temperature on the growth rate and protease activity of Antarctic microorganisms. The Antarctic microorganisms PAMC 25641, 25614, 25719 and 25617 were obtained from the Polar and Alpine Microbial Collection (PAMC) at the Korea Polar Research Institute. These microorganisms were confirmed for the excretion of protease on a plate with skim milk. The identification of microorganisms was carried out using the 16S rDNA sequencing method. PAMC 25641 showed the highest protease activity among the subjects tested, and PAMC 25617 exhibited the highest growth rate. The growth rates of the microorganisms were not affected by temperature, except for PAMC 25617. However, protease activities were increased for all strains in a temperature dependent fashion. These results suggest the possible application of Antarctic microorganisms for the efficient production of low temperature proteases.

본 논문에서는 극지미생물의 저온 활성 protease 생산에 관한 연구를 수행하였다. 먼저 protease를 생산하는 극지미생물인 PAMC 25641, 25614, 25719, 25617을 16s rDNA 염기서열 분석을 이용하여 동정하였다. 그 후, 다양한 온도($5^{\circ}C$, $10^{\circ}C$, $15^{\circ}C$, $20^{\circ}C$)에서의 성장률 및 protease activity, specific activity를 확인하였다. 각 미생물의 온도별 성장률은 대체로 비슷한 경향을 보였으나 25617은 $20^{\circ}C$에서 급격한 성장률 증가를 확인할 수 있었다. 또한, specific activity는 25641이 5, 15, $20^{\circ}C$에서 가장 높은 specific activity를 갖는 것을 확인하였다.

미생물 및 배양 배지

실험에서 사용된 PAMC 25641, 25614, 25719, 25617의 미생물들은 극지연구소(Korea Polar Research Institute, Incheon, South Korea)로부터 분양받았다. 이들 미생물은 PAMC 등록정보에 protease 활성을 갖는 것으로 확인이 되어있다. PAMC 25641, 25614는 Nutrient agar (Becton, Dickinson and Company, USA), Nutrient broth (Becton)을 사용하였고, PAMC 25719는 R2A 배지를 이용하였다. 또한, PAMC 25617은 YM 배지를 사용하였다.

 

미생물 동정

각각의 미생물들은 universal primer인 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')과 1492R (5'-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3')를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다[13]. PCR 결과물은 QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, Venlo, Netherlands)를 이용하여 정제한 후 (주)마크로젠(Seoul, South Korea)에 의뢰하여 16S rDNA 염기서열을 확인한 후 NCBI blast를 통하여 동정하였다.

 

배양 조건

각각의 미생물들은 전배양 한천 배지에 접종하여 15℃에서 7일간 배양하여 사용하였으며, 액체 배양은 50 ml씩 250 ml triangular flask에 넣고 멸균한 후 미생물을 접종하여 각각 5, 10, 15, 20℃에서 150 rpm으로 교반하여 4일간 배양하였다.

 

성장률 측정

각각의 미생물들의 성장률은 UV/Vis spectrophotometer (Mecasys Co., Seoul, South Korea)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배양액을 200 μl 취하여 멸균된 각각의 액체 배지 800 μl에 넣어 5배 희석하여 흡광도를 측정하였고, 멸균된 각각의 액체 배지를 blank로 사용하였다.

 

Protease 활성 측정

Protease 활성 측정은 배양액을 4℃에서 원심분리(14,000 rpm, 10 min)한 후 상등액을 회수하여 50 mM sodium phosphate (Daejung Chemical & Metal Co., Sheung, South Korea) 200 μl에 배양 상등액 100 μl, 기질인 10 mM AAPF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 10 μl, 증류수 690 μl를 혼합하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 60℃에서 20분간 불활성하여 UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였고, 기질대신 증류수를 첨가한 혼합액을 blank로 사용하였다.

Protease의 unit은 extinction coefficient = 8,800으로 하여 다음 식에 의하여 계산하였다.

배양 및 활성 실험은 3차례 반복하여 평균값으로 표시하였다.

 

미생물 동정 결과

Protease 생산 균주들의 16S rDNA 유전자 정보의 염기서열을 확인한 후, NCBI blast를 통하여 동정해본 결과 PAMC 25641은 Janthinobacterium sp. HC1-2 (GenBank: JF312914.1) 등과 97% 유사성을 보였다. PAMC 25614은 Pseudomonas sp. B-AS-24 (GenBank: JF901704.1) 등과 99%의 유사성 보였다. 또한, PAMC 25719는 Janthinobacterium sp. RHLS19 (GenBank: JX949460.1)와 PAMC 25617은 Rahnella sp. Pv5 (GenBank: JQ522978.1)와 각각 98%의 유사성을 보였다. 정확히 어떤 특정 종과의 연관성은 명확하지 않았다(Table 1).

Table 1.Identification of strains obtained from PAMC 25641, 25614, 25719, 25617 by 16s rDNA sequencing.

 

성장률 확인

본 연구에서는 각 미생물들의 최적생장 온도를 확인하기 위하여 다양한 온도(5℃, 10℃, 15℃, 20℃)에서 4일간 생장을 비교하였다. 다른 균주들과 다르게 PAMC 25617은 다른 온도 조건에서는 평이한 성장을 보였으나, 20℃에서 급격한 성장률 증가 및 maximum growth도 크게 높아진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).

Fig. 1.Effect of temperature on growth of Antarctic microorganisms. (A) PAMC 25641, (B) PAMC 25614, (C) PAMC 25719, (D) PAMC 25617.

위의 미생물들은 모두 5-20℃에서 성장이 가능하였으며, 대부분 20℃에서 가장 잘 성장하였다. 이러한 결과를 볼 때 본 연구에서 사용된 미생물들은 모두 내냉성(psychrotolerant)의 특성을 지니고 있는 것을 알 수 있다[3]. 이것은 대부분의 극지 미생물들이 지닌 특성으로 극지의 극한 환경, 특히 저온의 환경에서 적응, 진화해온 극지 미생물들의 고유한 특징이다[1, 11, 16]. 이전에 발표된 논문들에서도 극지 미생물들에 대한 growth temperature에 대하여 연구가 많이 보고되었다.

Janthinobacterium은 30℃의 온도에서 maximum growth를 갖는 것이 확인되었으며, Pseudomonas 역시 30℃에서 가장 잘 성장하는 것으로 확인되었다. 또한, 두 미생물은 5℃에서도 성장이 가능한 저온적응성 미생물이라는 것 역시 보고되었다[14, 15]. 그 이외에도 여러 종의 극지미생물들이 연구되고 있으며, 대부분의 극지미생물들은 5-30℃의 다양한 온도에서 성장이 가능한 것으로 확인되고 있다[12].

 

Protease 활성 확인

본 연구에서는 저온 활성 효소들 중에 현재 산업적으로 가장 넓은 범위에 이용되고 있는 protease에 관하여 관심을 가지고 연구를 진행하였다.

본 연구에서의 각 미생물들의 protease activity maximum 값을 Unit으로 환산하면 25641, 25617은 38.523 U/L, 16.477 U/L의 값을 가졌으며, 25719는 2.727 U/L, 25614는 17.841 U/L의 maximum 값을 보였다(Fig. 2).

Fig. 2.Effect of temperature on protease activity of Antarctic microorganisms. (A) PAMC 25641, (B) PAMC 25614, (C) PAMC 25719, (D) PAMC 25617.

본 연구에 의해 극지방에서 채취된 4종의 protease 생산균주들을 확인하였고, 그중 높은 활성을 가지며, 효소 활성이 안정적인 균주를 확인하였다. 이에 따라 효소 산업에서 가장 넓은 범위에 이용되고 있는 protease 중 가장 큰 이슈가 되고 있는 저온 활성 protease를 산업적으로 다양한 분야에서 유용하게 이용할 수 있을 것으로 판단된다.

 

요 약

본 논문에서는 극지미생물의 저온 활성 protease 생산에 관한 연구를 수행하였다. 먼저 protease를 생산하는 극지미생물인 PAMC 25641, 25614, 25719, 25617을 16s rDNA 염기서열 분석을 이용하여 동정하였다. 그 후, 다양한 온도(5℃, 10℃, 15℃, 20℃)에서의 성장률 및 protease activity, specific activity를 확인하였다. 각 미생물의 온도별 성장률은 대체로 비슷한 경향을 보였으나 25617은 20℃에서 급격한 성장률 증가를 확인할 수 있었다. 또한, specific activity는 25641이 5, 15, 20℃에서 가장 높은 specific activity를 갖는 것을 확인하였다.