Enhancement of β-1,3-Glucanase Activity by Sequential δ-Sequence Mediated Integration in Saccharomyces cerevisiae

출아효모에서 연속적 δ-sequence 삽입유도에 의한 β-1,3-glucanase 활성 증가

Abstract

Beta-1,3-glucanase is widely used in various biotechnological and industrial processes, with over-production required to enable versatile utilization. We examined the overexpression of ${\beta}$-1,3-glucanase (EXGA) from Aspergillus oryzae using ${\delta}$-sequence-mediated integration. We constructed $pRS{\delta}$-exgA and $pRS{\delta}K$-exgA plasmids for integration of the EXGA gene into various chromosomes of Saccharomyces cerevisiae. These plasmids contain the ADH1 promoter for constitutive expression, a signal sequence (exoinulinase signal sequence [INU1 s.s]) for secretory production, and a ${\delta}$-sequence for integration of ${\beta}$-1,3-glucanase. The $pRS{\delta}$-exgA plasmid was transformed into the S. cerevisiae $BY4742{\Delta}exg1$ strain, and ${\beta}$-1.3-glucanase was stably overexpressed and secreted. Another plasmid, $pRS{\delta}K$-exgA, was introduced into the S. cerevisiae $BY4742{\Delta}exg1$ (YKY082) strain, and overexpression of ${\beta}$-1,3-glucanase was examined by inducible integration under geneticin selection. The activity of ${\beta}$-1,3-glucanase increased in accordance with a rise in the geneticin concentration, with 0.8 mg/ml of geneticin suitable for overexpression of ${\beta}$-1,3-glucanase. Subsequently, $pRS{\delta}K$-exgA was repeatedly transformed for sequential ${\delta}$-integration. The activity of ${\beta}$-1,3-glucanase reached about 0.063 unit/ml/$OD_{600}$, 0.095 unit/ml/$OD_{600}$, 0.131 unit/ml/$OD_{600}$ and 0.165 unit/ml/$OD_{600}$ by the first, second, third, and fourth round of integration, respectively. According to the increase in the activity of ${\beta}$-1,3-glucanase by sequential ${\delta}$-integration, the copy number (integration rate) of the EXGA gene also increased in various chromosomes. These results suggest that recombinant ${\beta}$-1,3-glucanase activity can be sequentially increased by repeated ${\delta}$-sequence integration.

${\beta}$-1,3-glucanase는 다양한 바이오공정에 널리 사용되어지는 효소로서 산업적 이용가치 증대를 위해 ${\beta}$-1,3-glucanase의 대량생산이 요구되어 지고 있다. 본 연구에서는 반복서열 ${\delta}$-sequence에 의한 integration를 통해 Aspergillus oryzae유래의 ${\beta}$-1,3-glucanase (EXGA)의 과발현 유도를 연구하였다. 먼저 효모내의 여러 염색체상에 EXGA 유전자를 integration하기 위해 $pRS{\delta}K$-exgA와 $pRS{\delta}K$-exgA 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드는 유전자의 구성적 발현을 위한 ADH1 프로모터, 분비생산을 위한 signal sequence와 ${\beta}$-1,3-glucanase유전자의 integration을 위한 ${\delta}$-sequence를 포함하고 있다. 먼저 $pRS{\delta}K$-exgA 플라스미드를 $BY4742{\Delta}exg1$ 균주에 형질전환하고, 재조합 ${\beta}$-1.3-glucanase가 안정하게 과발현 및 분비생산됨을 확인하였다. 다음으로 geneticin 선별을 통한 integration 유도와 ${\beta}$-1,3-glucanase 활성과의 관계를 조사해보기 위해 $pRS{\delta}K$-exgA 플라스미드를 $BY4742{\Delta}exg1$ (YKY082) 균주에 도입한 결과, geneticin 농도 증가에 따라 ${\beta}$-1,3-glucanase 활성도 증가되었고, geneticin 농도 0.8 mg/ml가 ${\beta}$-1,3-glucanase과발현에 적합한 농도임을 확인 할 수 있었다. 이어서 $pRS{\delta}K$-exgA 플라스미드는 연속적 ${\delta}$-integration에 의해 효모세포 내에 도입되어, 한번, 두번, 세번 그리고 네번의 integration에 의해 ${\beta}$-1,3-glucanase의 비활성은 0.063, 0.095, 0.131 그리고 0.165 unit/ml/$OD_{600}$로 증가되었다. 또한 연속적 integration에 의해 ${\beta}$-1,3-glucanase의 활성이 증가됨에 따라 다양한 염색체에 도입된 EXGA 유전자의 복제수(integration 빈도)도 같이 증가되었음을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 반복적 ${\delta}$-sequence integration방법을 통해 재조합 ${\beta}$-1,3-glucanase의 활성을 점진적으로 안정하게 증가시킬 수 있음을 제시하였다.

서 론

Saccharomyces cerevisiae는 매우 중요한 산업적 미생물로서 현재 바이오에탄올 생산 산업과 제약 산업 등에서 중요한 역할을 수행하고 있다. 특히, S. cerevisiae를 숙주세포로 사용할 경우 부가가치가 높은 단백질이나 효소를 생산하는데 있어서 많은 장점이 있는데, 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 능력과 효모의 물질대사를 조절 할 수 있는 능력이 매우 중요하다고 할 수 있다[14, 18]. 외래 유전자를 효모 내로 과발현시키기 위한 방법으로는 high copy number plasmid인 yeast episomal plasmid (YEp)를 사용하는 것이 일반적이다[2]. YEp는 높은 copy 수로 가장 많이 사용되는 plasmid 이지만, 비선택적 배양조건에서는 종종 유사분열 시 plasmid가 불안정해진다는 단점이 있다[22, 26]. 반면에 yeast integrative plasmid (YIp)는 외래 유전자의 안정적 발현에는 유용하지만, 효모의 genome내로 단 1 copy만 integration되므로 과발현 vector로는 적합하지 않다[14, 26, 35]. 그러므로, YIp를 이용한 외래 유전자의 안정적 과발현을 위해, δ-sequence [4, 10]나 ribosomal DNA (rDNA) [19, 23]와 같은 repetitive chromosomal DNA sequence를 이용하여 과발현시키고자 하는 특정 유전자의 integration 빈도(copy number)의 증가를 유도할 수 있다. 그 중 δ-sequence는 S. cerevisiae retrotransposon Ty의 long terminal repeat으로[5, 26], δ-sequence와 그 homologous는 효모 genome 전체에 걸쳐 분포하고 있으며, 300 copies이상 존재한다고 보고되고 있다(http://www.yeastgenome.org/). 따라서 δ-sequence를 이용한 integration 방법은 전통적이고 일반적인 integration 시스템보다 효모 염색체내로 목적 유전자의 integration copy수를 더 많이 증가 시킬 수 있다는 장점이 있어[17, 24], 실제로 δ-integration vector는 β-glucosidase와 carboxymethylcellulase [4, 21], human β-endorphin [27] 그리고 각종 간염 B 표면 단백질[10]의 발현과 분비에 사용되어져 왔다[14].

본 연구에서는 yeast chromosome VI의 YFLW delta 4 sequence를 사용하여 목적 유전자의 multiple integration을 시도하였다. 본 연구에 사용한 목적유전자로는 laminaran을 분해하는 β-1,3-glucanase를 사용하였다. Laminaran은 갈조류의 다당으로 β-1,3-glucose로 구성되어 있는 polymer이며, exo-β-1,3-glucanase와 endo-β-1,3-glucanase에 의해 glucose로 효율적으로 분해 될 수 있다. β-1,3-glucanase는 β-1,3-glucan 뿐만 아니라 β-1,3-glucoside에서의 β-1,3-glucosidic bond의 가수분해를 촉진시키는 효소로 과일의 glucosidic 전구체로부터 향기로운 화합물의 합성 및 발효 등을 포함하여 바이오공정공학 프로세스에 널리 다양하게 사용된다[8, 25, 29]. 또한 β-1,3-glucanase는 맥주 생산 등에 있어서 맥아의 점성 및 여과 문제의 원인인 β-glucan의 고분자 질량을 감소시켜 정제효율과 정제속도의 증가를 도와주는데 사용되었고[33], 와인 생산에 있어서는 β-1,3-glucanase를 S. cerevisiae에서 과발현시켜 와인의 향미를 증가시키는 데에도 사용되어졌다[7]. 본 연구에서는 Aspegillus oryzae유래의 exo-β-1,3-glucanase를 code하는 EXGA 유전자(ORF 1.3 kb) [30]를 목적유전자로 사용하였다. ExgA orthologs는 Magnaporthe grisea 등의 식물 병원성 곰팡이, S. cerevisiae 등의 yeast, A. oryzae의 Aspergilli 등 다양한 종들에 존재하며, 그 중 S. cerevisiae의 ExgA ortholog는 많은 β-1,3-glucanase를 가지고 있다[11, 13, 30, 31, 34]. 따라서 본 연구에서는 δ-sequence mediated integration 시스템을 이용하여 exo-β-1,3-glucanase (EXGA)의 활성증가를 유도하고, 항생제 농도 및 sequential δ-integration을 통해 exo-β-1,3-glucanase (이하 β-glucanase)의 안정적 과발현 시스템을 확립하고자 한다.

 

재료 및 방법

사용 균주 및 plasmids

Plasmid 구축 및 증폭을 위한 Escherichia coli 숙주세포는 DH5α를 사용하였고, A. oryzae 유래의 EXGA 유전자 발현 및 integration을 위한 효모 숙주세포로는 S. cerevisiae BY4742△ exg1 (MATa ura3-△0 his3-Δ1 leu2-Δ0 lys2-Δ0 exg1::KanMX) 균주를 사용하였다. 또한 EXG1 유전자가 loxP-CgHIS3-loxP cassette로 대체되어 결실된 S. cerevisiae YKY082 (MATa ura3- △0 his3-Δ1 leu2-Δ0 lys2-Δ0 exg1::loxP-CgHIS3-loxP) 균주는 sequential δ-integration을 위한 숙주세포로 사용하였다. 효모 S. cerevisiae에서 EXGA 유전자 발현을 위한 발현 cassette는 구성적 promoter인 ADH1 (alcohol dehydrogenase) promoter와 재조합 단백질의 분비생산을 위해 Kluyveromyces marxianus 유래 exoinulinase signal sequence (INU1 분비서 열) 및 ADH3 terminator를 포함하는 pAInu-exgA plasmid [15]를 사용하여 분리하였다. EXGA 유전자 발현 cassette를 효모염색체 내에 integration하기 위한 vector로는 pRS306 plasmid (YIp vector)를 사용하였고, geneticin농도에 따른 형 질전환체 선별을 위하여 loxP-KanMX-loxP selective marker [9]를 가지는 pBlue-KanMX (pBluscript/loxP-KanMX genegeneloxP) plasmid를 사용하였다. 또한 selective marker 재사용을 통한 sequential integration을 위해 CRE recombinase 유전자를 가지고 URA3 selective marker를 포함하는 pSH47 plasmid [9]를 사용하여 KanMX 유전자를 반복적으로 제거하였다.

재조합 β-glucanase 과발현 plasmid 구축

β-glucanase 유전자의 δ-sequence mediated integration을 위한 기본적인 vector인 pRSδ plasmid를 구축하기 위하여 먼저, YIp type의 pRS306 vector를 XhoI-SalI으로 제한처리 후 self-ligation하여 pRSnSX plasmid를 구축하고, S. cerevisiae BY4742△exg1 균주로부터 δ-sequence를 Delta-1과 Delta-2 primer를 이용해 증폭하여 HindIII-EcoRI로 제한처리 한 단편 (322 bp)을 pRSnSX vector의 HindIII-EcoRI site에 삽입하여 pRSδ plasmid (URA3 selective marker 포함)를 구축하였다. 효모 유래 분비 서열을 이용하여 EXGA 유전자를 구성적으로 발현·분비시키기 위하여 ADH1 promoter 하류에 INU1 signal sequence (INU s.s; 23개 아미노산 잔기로 구성; MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR) 와 EXGA 유전자를 가진 pAInuexgA (8.1kb) plasmid [15]를 사용하였으며, INU s.s와 EXGA 유전자와의 연결 부위의 서열은 5'-AAGAGATCTTTACCCCTTTTG- 3'로서 BglII로 절단하여 연결하면 KRSLPLL의 아미노산 서열을 가지게 되어, 번역 후 분비과정 중 KEX2 protease에 의해 절단되면 mature form의 β-glucanase가 분비 될 수 있다[15]. 따라서 pAInu-exgA plasmid를 SphI 처리하여 ADH1 promoter와 INU s.s를 포함하는 EXGA 유전자 cassette 를 추출하고, 이 단편을 Klenow Fragment (TaKaRa)로 처리하여 pRSδ plasmid의 SmaI site에 삽입하여 pRSδ-exgA plasmid를 구축하였다. 항생제 농도에 따른 integration의 효율 증가 및 반복적인 sequential δ-integration을 위한 pRSδK-exgA plasmid는 pRSδ-exgA의 selective marker인 URA3를 SbfI-NsiI로 제한처리하여 제거한 후 Klenow Fragment (TaKaRa) 처리하여 self-ligation시켜 pRSδ-exgA△URA plasmid를 구축한 후, 여기에 pBlue-KanMX plasmid를 NotI처리하여 나온 loxP-KanMX-loxP (1.5 kb)단편을 pRSδ-exgA△URA의 NotI site에 삽입시켜 pRSδK-exgA (Fig. 1A) plasmid를 구축하였다.

Fig. 1.Schematic diagram of plasmid pRSδK-exgA for expression of β-glucanase (A) and procedure of integration and reusable marker rescue (B).

배지 조성 및 배양 조건

E. coli 형질전환체의 선별 및 증식배지로는 50 μg/ml ampicillin이 포함된 Luria-Bertani (LB) 배지를 사용하였다. S. cerevisiae 균주의 증식 및 β-glucanase 발현 유도배지로는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone and 2% dextrose)를 사용하였으며, 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 필요한 아미노산과 핵산만을 첨가한 SC 배지(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 2% glucose supplemented with the appropriate amino acids and nucleic acids)와 geneticin (G418) 이 포함된 SC+G418 배지를 사용하였다. Uracil (URA3) 영양 요구성 균주의 선별을 위한 배지로는 SC 배지에 1% uracil (2 mg/ml)과 0.1% 5-FOA (5-Fluoroorotic acid)를 첨가하여 사용하였다. 재조합 효모 균주는 10 ml YPD 배지에서 30℃, 190 rpm으로 24시간 배양하였고, 연속적인 integration을 위한selective marker제거를 위해 CRE recombinase 유전자의 발현은 YPD (1%) G (1% galactose) 배지에서 24시간 배양을 통해 유도되었다.

S. cerevisiae YKY082 (BY4742△exg1) 구축을 위한 overlap PCR

Sequential δ-integration을 위한 효모 숙주세포인 YKY082 (exg1 gene disruptant)를 구축하기 위하여 overlap PCR을 실시하였다. PCR의 주형으로는 S. cerevisiae genomic DNA와 pBlue-CgHIS3 (pBluscript/loxP-CgHIS3 gene-loxP) plasmid DNA를 사용하였고, 각각의 DNA는 DNA miniprep method [3] 및 Exprep plasmid mini kit (GeneALL)를 사용하여 추출하였다. 먼저, Exg1-F와 Exg1P-R primer를 사용하여 EXG1 유전자의 5'말단 단편을 증폭하였고, pBlue-F와 pBlue-R primer 를 사용하여 loxP-CgHIS3-loxP 단편을 증폭하였으며, Exg1P-F와 Exg1-R primer를 사용하여 EXG1 유전자의 3'말단 단편을 증폭하였다. 각각의 EXG1-5’ 단편, loxP-CgHIS3-loxP 단편 및 EXG1-3' 단편을 Exg1-F과 Exg1-R primer를 이용하여 overlap PCR을 수행하여 최종적으로 연결하였다. PCR은 94℃에서 5분 전처리 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 58~64℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1~2분간 polymerization을 30 cycles실시하였다. PCR 반응은 PCR Thermal Cycler Dice (TaKaRa)를 사용하여 수행되었다.

효모 형질전환 및 sequential δ-integration을 위한 reusable marker 제거

pRSδ-exgA 및 pRSδK-exgA plasmid를 S. cerevisiae 염색체 내로 형질전환 하기 위하여 각각의 plasmid를 δ-sequence 내의 XhoI 제한효소로 처리하여 선형화 한 뒤, salmon testes 유래의 single-stranded carrier DNA를 사용하는 high efficiency transformation법[6]을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환체는 SC 배지 및 SC+G418 배지에서 선별되었다. 또한 연속적 δ-integration을 통한 형질전환을 위해서는 반복적인 selective marker의 사용이 가능해야 하므로 selective marker의 재사용을 위해 반복적으로 selective marker를 제거할 필요가 있다. 따라서 pRSδK-exgA plasmid가 형질전환된 BY4742 △exg1/pRSδK-exgA 균주의 KanMX marker를 재사용하기 위하여 CRE recombinase 유전자를 가지고 있는 pSH47 plasmid를 도입하였다. Galactose에 의해 발현이 유도되는 CRE recombinase에 의해 loxP 사이의 자발적인 recombination이 일어나면 KanMX 유전자는 염색체내에서 제거(pop-out)되고, 사용된 pSH47 plasmid는 5-FOA배지의 사용으로 쉽게 효모균주에서 결실 될 수 있다. 그런 다음 다시 pRSδK-exgA plasmid를 재형질전환하는 방법으로 연속적인 integration을 가능하게 했다(Fig. 1B).

재조합 β-glucanase 의 정성적 및 정량적 효소 활성 측정

각각의 효모 형질전환체에 대하여 높은 β-glucanase활성을 가진 형질전환체를 선별하기 위해 plate assay를 수행하였다. β-glucanase의 plate assay를 위해 MUG (4-Methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside) (Fluka Analytical, USA) [12, 32]가 기질로 사용되었고, YPD 평판배지에서 자란 형질전환체에 0.04% MUG을 1 ml 분주 한 후 37℃에서 10분간 반응시켜 UV상에서의 발광으로 분비활성을 확인하였다. 세포외로 분비된 β-glucanase의 정량적 효소 활성 측정은 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)법을 이용하여 분석 하였다[1, 20]. 효소 활성 측정을 위해 1% laminaran (Sigma, UK)을 기질로 사용하였으며 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) 100 μl에 효소용액 (배양상등액) 10 μl를 첨가하여 40℃에서 20분간 반응시킨 후 DNS용액을 첨가하였다. 3분간 boiling한 뒤 ice에 5분간 cooling후에 SDW 600 μl를 첨가하여 흡광도 550 nm에서 측정하였다. 이때 효소의 활성은 1% laminaran을 이용하여 40℃에서 1분당 1 μmole의 glucose를 생산하는 효소의 양을 1 unit로 정의하였으며 표준적정곡선으로 0.2% glucose를 사용하였다. 또한 INU s.s를 사용하여 분비시킨 재조합 β-glucanase의 세포내의 활성은 전체 활성의 5% 미만(분비효율 96%이상)[15]이므로 세포내의 활성은 따로 측정하지 않았다.

Copy number 분석

δ-integration을 통해 효모 염색체 내로 삽입된 EXGA 유전자의 copy number를 조사하기 위해 숙주세포 BY4742△exg1와 각각의 형질전환체들의 genomic DNA을 DNA miniprep method [3]를 이용하여 추출하고 PCR의 주형가닥으로 사용하였다. PCR시 전체 양을 50 μl로 맞추어 10~100 ng의 genomic DNA를 1 μl 첨가하였고, 0.1 μM primer를 각각 1 μl 첨가하였다. Copy number 측정을 위한URA3와 EXGA 유전자의 증폭을 위해 URA3-F와 URA3-R, exgA-F와 exgA-R primer set을 사용하였고, internal control 유전자인 CNE1과 FUR4 유전자의 증폭을 위해 CNE1-F와 CNE1-R, FUR4-F와 FUR4-R primer set를 사용하였다. Oligonucleotides의 리스트 및 서열은 table 1에 나타내었다. 전기영동 후 각각 signal intensity는 Scion image (http://www.scioncorp.com/) program을 이용하여 비교 분석하였다[16].

Table 1.Oligonucleotide lists and sequences used in this study

EXGA 유전자의 염색체내 integration position분석

S. cerevisiae BY4742△exg1와 형질전환체들의 karyotype (핵형) 및 EXGA 유전자의 염색체내 integration position을 분석하기 위해 pulse field gel electrophoresis (PFGE)와 southern hybridization을 실시하였다. PFGE를 위해 먼저 각 균주의 chromosomal DNA는 Sheehan and Weiss [28]에서 사용된 방법으로 1% low melting agarose (Sigma)를 사용해 DNA plug형태로 만들어 준비하였다. Chromosomal DNA는 CHEFDRIII system (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 0.5x TBE buffer에 1% gold agarose (pulsed field certified agarose; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) gel에서 분리하였다. CHEF gel electrophoresis의 조건은 120°의 angle로 6.0 V/cm에서 15시간 동안 60초의 interval로 switching 후, 6.0 V/cm에서 9시간 동안 90초의 interval로 switching하였다. 전기영동 후 0.5 μg/ml의 ethidium bromide (EtBr)로 염색 후 UV상에서 karyotype을 확인하였다. Southern hybridization을 위해 DNA를 Hybond-N+ membranes (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 transfer하였고 probe DNA는 EXGA 유전자의 PCR 산물을 사용하였다. Probe의 labelling과 signal detection은 ECLTM Direct Nucleic Acid Labelling와 Detection system (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 수행하였다.

 

결과 및 고찰

β-glucanase과발현을 위한 δ-sequence mediated integration

δ-sequence mediated integration을 통해 β-glucanase의 과발현을 유도하기 위해 구축된 pRSδ-exgA plasmid를 uracil 영양요구성 변이주인 S. cerevisiae BY4742△exg1 균주에 형질전환하여 SC (ura-) 배지에 1차 선별하였다. 선별된 형질전환체에 대해 MUG plate assay를 수행한 결과 숙주세포인BY4742△exg1 균주에서는 MUG기질로부터 UV형광이 관찰되지 않았고, 재조합 EXGA 유전자가 발현된 형질전환주에서는 크고 선명한 분해환이 나타나 선별된 형질전환주에서 재조합 β-glucanase가 성공적으로 발현·분비되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 2A). MUG assay를 통하여 선별된 9개 형질전환주의 test tube 배양을 통해 획득한 상등액으로 DNS assay 실시한 결과, 형질전환주 43번에서 0.56 unit/ml의 가장 높은 효소활성을 나타냄을 알 수 있었다. δ- integration에 의해 도입된 EXGA 유전자의 효소활성과 copy number (integration rate)와의 관계를 조사하기 위해 숙주세포인 BY4742△exg1와 효소활성이 높았던 형질전환주 43번의 genomic DNA를 같은 농도로 사용하여 PCR을 실시하였다. 그 결과, internal control인 CNE1유전자로 PCR했을 때에는 BY4742△exg1와 43번 형질전환주의 PCR band가 비슷한 intensity를 보이지만 URA3 유전자로 PCR한 경우 숙주세포인 BY4742△exg1보다 형질전환체에서 band가 더 선명하고 진하게 나옴을 확인할 수 있었다. PCR band intensity 측정을 위해 Scion image program을 이용하여 분석한 결과 internal control인 CNE1 유전자 증폭산물은 숙주세포와 같은 1copy임을 확인할 수 있었고, URA3 유전자 증폭산물은 숙주세포보다 약 6.7배 증가되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).

Fig. 2.The β-glucanase activity was detected by spraying the plates with 0.04% MUG in sodium acetate buffer and incubating for 10min at 37℃ before UV illumination (A). Copy number of a URA3 gene in the host strain and the transformat was compared. The CNE1 gene was used as internal control. Copy number was analyzed by scion image (B). H ; BY4742△exg1; Numbers ; BY4742△exg1/ pRSδ-exgA transformants numbers.

항생제 농도에 따른 β-glucanase유전자의 integration 효율 조사

Geneticin 농도에 따른 β-glucanase 유전자 cassette의 integration 효율을 조사하기 위하여 pRSδ-exgA plasmid의 URA3 selective marker를 제거하고 geneticin 내성 유전자인 loxP-KanMX-loxP marker로 대체한 pRSδK-exgA plasmid를 구축하였다. 앞에서 사용한 BY4742△exg1 균주는 EXG1 유전자를 geneticin 내성유전자인 KanMX의 삽입에 의해 EXG1 유전자를 결실시켰으므로 geneticin 농도에 따른 유전자 integration 효율을 조사하기 위한 숙주로는 적합하지 않다. 따라서 EXG1 유전자가 결실된 균주에 pRSδK-exgA를 도입하여 EXGA 유전자의 활성을 조사하기 위해 새로운 BY4742△exg1 균주를 구축하였다. Overlap PCR을 통하여 EXG1 유전자 사이에 loxP-CgHIS3-loxP를 삽입하여 EXG1-CgHIS3-EXG1 단편을 만들고, 이 단편을 BY4742 균주에 형질전환하여 BY4742△exg1::CgHIS3 균주인 S. cerevisiae YKY082 균주를 구축하였다. EXG1 유전자의 결실을 확인하기 위해 Exg1-F 와 Exg1-R primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과, 원래 1.3 kb의 EXG1 유전자가 결실주에서는 2.4 kb로 증폭되어 EXG1 유전자 대신에 CgHIS3가 도입된 EXG1 유전자의 결실(exg1::CgHIS3)을 확인하였다. 또한 MUG plate 활성을 통해 EXG1 유전자를 가지고 있는 BY4742 균주에서는 MUG 분해환을 확인 할 수 있었지만 YKY082 균주에서는 분해환이 보이지 않음을 확인하였다 (data not shown). 구축된 YKY082 균주를 이용하여 geneticin 농도에 따른 활성증가의 유효성을 조사하기 위해 pRSδK-exgA plasmid를 YKY082 균주에 형질전환하고 geneticin 농도에 따른 β-glucanase의 활성변화를 조사하였다. Geneticin 농도 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.8 mg/ml 에서 형질전환주를 1차 선별하고, 선별된 형질전환주를 MUG plate assay하여 분 해환이 큰 균주를 선별하였다. 그리고 DNS assay 를 통하여 β-glucanase 활성 측정을 실시한 결과, geneticin 농도 0.2 mg/ml에서 선별한 균주는 0.45 unit/ml, 0.4 mg/ml에서 선별한 균주는 0.57 unit/ml, 0.8 mg/ml에서 선별한 균주는 0.75 unit/ml로 geneticin 농도 0.8 mg/ml에서 선별한 형질전환주에서 가장 높은 활성을 확인할 수 있었다(Table 2). 다음으로 geneticin 농도를 더 증가시켜 4 mg/ml와 8 mg/ml에서 형질 전환주를 선별하고, 선별한 균주의 효소활성을 측정한 결과 geneticin 농도 4 mg/ml에서는 0.61 unit/ml, 8 mg/ml에서는 0.56 unit/ml의 효소활성을 보였다. Geneticin 농도가 높을수록 효소활성이 높아질 것이라 예상했지만 너무 높은 geneticin 농도는 cell growth에 영향을 주어 β-glucanase의 과발현에는 적합하지 않음을 확인할 수 있었으며, geneticin농도 0.8 mg/ml가 가장 적합한 농도임을 확인 할 수 있었다.

Table 2.Comparison of extracellular β-glucanase activity by various geneticin concentrations in YKY082/pRSδK-exgA transformant

Sequential δ-integration을 통한 β-glucanase 활성 증가 조사

재조합 β-glucanase의 점진적인 활성 증가에 sequential δ-integration system의 유효성을 조사하기 위해, geneticin 농도 0.8 mg/ml에서 가장 높은 활성을 보인 YKY082/pRSδK-exgA 형질전환주(1st integrant)를 이용하여 반복적 δ-integration을 시도하였다. 먼저 selective marker인 KanMX 유전자를 CRE recombinase를 이용하여 제거하고, pRSδK-exgA plasmid를 재형질전환하여 second round integration을 시도하였다. 형질전환주 56개를 선별하여 MUG plate assay 및 효소활성을 측정한 결과, 1.62 unit/ml의 β-glucanase 활성을 보이는 균주를 확인하였고 이는 첫번째 δ-integration 한 균주(1st integrant)보다 β-glucanase활성이 2.2배 증가된 것임을 확인할 수 있었다. β-glucanase 활성 증가에 따른 EXGA 유전자의 integration 정도를 알아보기 위해 숙주세포인 YKY082 (BY4742△exg1), 1st integrant (YKY082/pRSδK-exgA)와 2nd integrant (YKY082/pRSδK-exgA)의 genomic DNA를 추출하여 EXGA 유전자의 copy number를 조사해보았다. FUR4 primer set와 exgA primer set로 PCR을 수행한 결과 internal control로 사용한 FUR4 유전자는 똑같이 1copy임을 확인할 수 있었고, EXGA 유전자를 증폭시킨 PCR 산물에서는 1copy인 FUR4 유전자와 비교하여 1st integrant가 8.6배, 2nd integrant가 13.8배 copy number가 증가했음을 확인 할 수 있었다(Fig. 3). 이것은 δ-sequence를 이용한 mouse α-amylase와 human β-endorphin 유전자를 integration 한 경우의 copy number가 약 3배에서 5배[27] 증가한 것과 비교하면 항생제를 이용한 형질전환주의 선별을 통해 integration 효율이 증가되었다고 볼 수 있다. 계속해서 반복적인 selective marker 제거와 pRSδK-exgA plasmid를 이용한 형질전환으로 third round integration과 fourth round integration을 시도하였다. 그 결과, 세번째 δ-integration (3rd integrant) 후 β-glucanase활성은 2.10 unit/ml로 두번째 δ-integration 한 균주(2nd integrant)보다 β-glucanase활성이 1.3배 증가했음을 확인할 수 있었고, 네번째 integration(4th integrant) 후 β-glucanase활성은 1.96 unit/ml로 3rd integrant 보다는 β-glucanase활성이 다소 감소했음을 확인하였다. 또한 EXGA 유전자의 copy number는 3rd integrant와 4th integrant 에서 각각 15.1배와 15.9배로 크게 증가하지 않고 비슷함을 알 수 있었다(data not shown). 하지만 각 형질전환주에서 세포농도를 반영한 specific activity를 조사한 결과, 1st integrant에서 0.063 unit/ml/OD600, 2nd integrant에서 0.095 unit/ml/OD600, 3rd integrant에서 0.131 unit/ml/OD600 그리고 4th integrant에서 0.165 unit/ml/OD600의 활성을 보여 sequential integration에 의해 점진적으로 β-glucanase의 활성이 증가됨음을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 3.Active staining of yeast transformants harboring EXGA gene grown in YPD plate. The β-glucanase activity was detected by spraying at the plates with 0.04% MUG in sodium acetate buffer and incubating for 10 min at 37℃ before UV illumination (A). Copy number analyzed by comparing intensity of PCR products. The FUR4 gene was used as internal control (B). Host : YKY082 (BY4742△exg1); 1st Int : first round integrated YKY082/pRSδK-exgA; 2nd Int : second round integrated YKY082/pRSδK-exgA.

Fig. 4.Active staining of yeast transformants harboring EXGA gene. Each yeast strain was grown in YPD and diluted cell suspensions (OD600 =1.0) from each strain were spotted onto YPD. The β-glucanase activity was detected by spraying at the plates with 0.04% MUG in sodium acetate buffer and incubating for 10 min at 37℃ before UV illumination (A). Comparison of β-glucanase specific activity in yeast transformants. Star mark (*) indicated integrant exhibiting high-level β-glucanase activity in each integrant (B). H : YKY082 (BY4742△exg1); 1st Ints : first round integrated YKY082/pRSδK-exgA; 2nd Ints: second round integrated YKY082/pRSδK-exgA; 3rd Ints: third round integrated YKY082/pRSδK-exgA; 4th Ints : fourth round integrated YKY082/pRSδK-exgA.

PFGE와 southern hybridization을 통한 integration position 확인

반복된 δ-integration을 통해 β-glucanase의 활성 증가를 확인하고 실제 integration된 EXGA 유전자의 염색체내 position을 조사하기 위해 PFGE와 EXGA 유전자를 probe로 이용한 southern hybridization을 실시하였다. 그 결과 전 염색체의 다양한 position에서 EXGA 유전자의 integration이 일어났음을 확인할 수 있었고, 특히 XII번, IV번 염색체에서 집중적으로 integration이 일어났음을 확인할 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 5.Confirmation of integration position by PFGE and southern hybridization. EXGA gene was used as probe. H : YKY082 (BY4742△exg1); 1st : first round integrated YKY 082/pRSδK-exgA; 2nd : second round integrated YKY082/ pRSδK-exgA; 3rd : third round integrated YKY082/pRSδ K-exgA; 4th : fourth round integrated YKY082/pRSδK-exgA.

따라서 본 연구에서는 sequential δ-integration 및 항생제를 이용한 형질전환체의 선별을 통해 재조합 β-glucanase유전자의 발현이 점진적으로 증가 될 수 있음을 확인하였고, 염색체 내의 여러 position에 목적유전자를 동시 다발적으로 integration 함으로서 안정적 과발현을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.