PCR Technique for Determining Jeju Black Cattle, Hanwoo and Imported Beef

흑한우와 한우 및 수입우를 판별하기 위한 multiplex PCR 기술

Abstract

For the identification of the Jeju black cattle, Hanwoo and imported beef, we performed a multiplex polymerase chain reaction (PCR) associated with microsatellite (MS) and melanocortin 1 receptor (MC1R) gene. The MC1R gene plays an important role in regulation of the melanin synthesis within mammalian melanocytes. MC1R encoded by extension (E) locus was almost fixed with recessive red e allele in the Hanwoo. We estimated that the specific genotypes ($E^+/E^+$, $E^+/e$) of MC1R gene were characteristic genotypes of Jeju black cattle. But the PCR products resulted from using the MC1R gene derived primers only are not sufficient to identify Jeju black cattle from other relatives. We performed two times of successive multiplex PCR to provide a more accurate result for the identification of Jeju black cattle. The results suggest that two types of successive multiplex PCR methods using MC1R gene and Microsatellite derived primer set will be more useful to identification of Jeju black cattle, Hanwoo and imported beef.

본 연구는 현행 한우확인시험법에 이용되는 Microsatellite (MS)와 소의 유전형질 중 품종 판별에 주로 이용되는 Melanocortin Receptor 1 (MC1R) 유전자상의 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)를 분석하여 설계한 Primer를 Multiplex PCR을 활용하여 소의 품종을 판별하였다. MC1R 유전자형은 $E^D$, $E^+$, e형의 3Type으로 나뉘며 $E^D/E^D$, $E^D/E^+$, $E^D/e$, $E^+/E^+$, $E^+/e$, e/e의 6가지 유전자형을 가진다. $E^D$유전자형은 외래종이 지닌 유전자형으로 $E^D/E^D$, $E^D/E^+$, $E^D/e$이 이에 속하며, e유전자형은 한우가 지닌 유전자형으로 e/e의 유전자형을 가진다. 흑한우의 경우 $E^D$, $E^+$, e의 모든 유전자형을 가지고 있으나 이는 교잡에 의해 나타난 것으로 보이며 $E^+$유전자형이 흑한우 고유의 유전자형으로 추정되어 본 연구에서는 이에 따라 $E^+/E^+$, $E^+/e$의 유전자형을 흑한우로 분류하였다. 그러나 $E^D$, $E^+$의 경우 단순 PCR기법만으로는 그 판별에 어려움이 있어, MS Maker를 활용한 다형성 분석을 통해 흑한우와 수입우를 판별할 수 있는 새로운 Primer를 설계하였으며, 이를 통해 소의 품종을 판별하였다.

서 론

소의 모색은 품종의 특징을 나타내는 중요한 형질 중 하나로 품종 식별을 위해 대표적인 형질로 이용된다[6, 11]. 우리나라의 재래 소 품종들 역시 모색을 중심으로 황색의 한우, 호반무늬를 나타내는 칡소, 흑모색의 흑우 등으로 구분[4]되며, 이러한 모색의 변이는 흑색과 흰색의 Holstein, 붉은색의 일본화우, 흑색의 Black Angus, 적갈색의 Hereford등의 외래종과 차이를 보인다.

흑한우는 한우의 황모색과는 확연히 구분되는 흑모색을 보이나, 개체나 성장단계에 따라 농도의 차가 관찰되며, 불분명한 호피무늬 또는 갈흑색의 모색등이 관찰되기도 한다.

소에서 모색과 관련하여 많은 연구가 이루어져 왔으며 품종판별에 적용된 유전자는 18번 염색체상에 위치한 melanocortin 1 receptor (MC1R) 유전자로 이 MC1R gene의 연구에서 흑색을 나타내는 dominant allele인 ED, 여러 가지 모색을 나타내는 E+, 동형접합체일 때 적색을 나타내는 frameshift mutation인 e 등의 세 가지 allele이 보고되었다[1, 4, 5].

GeneBank에 등록된 소 염기 서열을 기초로 한우, 흑한우, Holstein, Black Angus종의 MC1R 염기서열을 분석한 결과 Holstein, Black Angus종에서는 ED, 한우에서는 e형이 관찰되며, 흑한우에서는 ED, E+, e 모든 형태가 관찰된다. 흑모색이 주인 흑한우의 MC1R 유전자형은 세 가지 대립인자 ED, E+,e에 의해 ED/ED, ED/E+, ED/e, E+/E+, E+/e, e/e의 6가지로 구분되나, ED 대립인자는 한우, 칡소, 갈모화우에서는 전혀 관찰되지 않아 외래품종과의 교잡에 의해 형성된 것으로 추정되며[11], E+가 흑한우 MC1R 유전자의 기본형인 것으로 추정하고 있다[2, 4, 8, 10, 11].

이러한 대립형질을 토대로 다양한 한우육 판별법이 보고되었는데, 주로 PCR-RFLP을 이용한 방법으로, 이전의 RAPD (random amplified polymorphic DNA)나 SCAR (sequence characterized amplified regions) 방법에 비하여 정확하고 안정적인 분석 결과를 얻을 수 있으나, PCR 이후 제한효소 처리과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있다[4].

최근 한우와 수입육의 판별의 경우 MC1R의 e/e 동형접합자를 확인하는 염기결실 돌연변이의 확인으로 Real-Time PCR을 이용한 방법들이 고안되고 있다. 반면 ED, E+ allele의 확인은 PCR-RFLP법을 이용하고 있으며 제한효소의 처리로 전기영동시 고농도의 gel을 활용해야하며 인지서열에서 불확실한 band들이 출현하는 단점이 있다[4, 6, 7, 9]. 또한, 현재 우리나라에서 적용되고 있는 한우 생산이력추적제용 MS marker는 여러 개의 유전자들을 동시에 다중 증폭(multiplex PCR)하여, 효소의 차등 증폭양상을 나타내어 data의 일부가 상대적으로 낮은 수준으로 검출되거나 관찰되지 않는 결과를 초래하기도 한다[2, 3, 4].

이에 우리나라의 재래 소 품종들과 외래 소 품종의 구분에 있어 높은 정확도와 중요한 유전자 표지인자로 이용되고 있는 MC1R gene의 ED, E+ allele를 명확하고 신속히 구분해 낼 수 있는 실험기법이 필요하여 본 연구를 수행하였다.

 

재료 및 방법

공시재료

본 연구에서 사용된 제주흑한우(117두)와 한우(1210두)는 농협중앙회 축산연구원에서 보관중인 genomic DNA를 제공받거나, 모근을 제공받아 genomic DNA를 분리하였다. 그리고 수입우 sample은 시중에 유통되고 있는 수입육우 및 육우 중 미국산 20두, 호주산 20두, 호주산 흑우 5두, 보리소 5두로 부터 확보하였다.

Total genomic DNA 추출

소의 모근 및 육조직을 1.5 ml tube에 넣고 200 μl의 핵산해리 혼합액(TL buffer, Navibiotech, Korea), 10 μl의 RNase A (20 mg/ml), 20 μl의 Proteinase K (20 mg/ml)를 넣고 55℃ 항온수조에서 1시간 반응시킨 후, 100 μl의 단백질 침전용액 (PP buffer, Navibiotech, Korea)을 넣고 얼음 위에서 5분간 반응시켰다. 이후, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 단백질을 침전시킨 후 상층액을 새 1.5 ml tube에 옮겨 iso-propanol과 1:1이 되도록 혼합한 뒤, 12,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 추출된 DNA는 70% 에탄올로 세척 후 건조하여 순수한 3차 증류수 50 μl에 용해하여 사용하였다.

Multiplex PCR Primer의 설계

한우와 흑한우, 수입우 판별을 위하여, MC1R 유전자의 유전자형 ED, E+, e형의 대립유전자를 이용하였다. e형의 경우 ED형, E+형과 유전자형 분석시 Guanine 염기 결실이 발생하여 비교적 쉽게 PCR기법으로 그 판별이 용의하나, ED형과 E+형의 유전자형의 경우 C → T로 치환된 단일 SNP구성으로 PCR 기법만으로 그 판별에 어려움이 있다(Table 2.). 따라서 기존한우 생산이력추적제로 활용되고 있는 MS marker를 이용하여 흑한우와 수입우의 유전형을 분석하고 두 그룹간의 차이를 보이는 MS marker Primer를 활용하여 새로운 primer를 설계하였으며, (주)코스모진텍에 합성을 의뢰하였고 그 primer 조합들은 Table 1과 같다.

Table 1.The used PCR primers in his study

Table 2.Sequence alignment of MC1R alleles

본 실험에는 6가지의 primer를 사용하였으며, 모든 PCR 반응의 Control이 되는 NV_CON primer set와 MC1R 유전자의 guanine 염기 결실시에 증폭되지 않는 NV_HW primer set, 그리고 수입우에서는 두군데의 유전자에 작용하여 398bp와 457bp의 band를 증폭하나 흑한우에서는 한군데의 유전자에 작용하여 398bp band만 증폭시키는 NV_JBC primer set으로 구성하였다.

PCR에 의한 육우의 판별

PCR 반응을 위해 PCR Premix (NV Hot start Taq polymerase premix (2X), NAVI BioTech)를 사용하였으며, template DNA 1 μl, 10pmol의 forward, reverse primer 1 μl씩을 첨가후 멸균증류수로 20 μl가 되게 조정하였다. Primer의 조성은 목적에 따라 달라지며 한우와 수입우(흑한우 포함)의 판별은 NV_CON, NV_HW의 primer가 사용되었고, 흑한우와 수입우 판별은 NV_CON, NV_JBC의 primer로 1차, NV_CON, NV_HW의 primer로 2차의 두단계로 PCR을 실시하여 판별하였다. 증폭은 T100TM Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)를 사용 하였으며, 수행은 1차 Primer로 조합된 Premix sample은 95℃에서 5분 후, 95℃ 30초, 63℃ 30초, 72℃ 45초를 35cycle을 수행한 뒤 72℃에서 5분간 반응 후 완료하였다. 증폭된 PCR 산물은 2% agarose gel에 전기영동하여 증폭된 DNA 크기를 확인하였다. 2차 Primer로 조합된 Premix sample도 동일한 조건으로 PCR을 실시하였으며, 총 2회의 PCR을 수행하였다.

 

결과 및 고찰

결과의 분석

본 연구에서는 총 2회에 걸친 순차적인 PCR 분석을 수행하였다. 한우 및 흑한우, 수입우 중, 흑한우의 가능성을 판별하는 1차 PCR과 판별된 결과 중 적은 확률로 포함된 한우를 판별하기 위한 2차 PCR로 나뉘며, 2차 PCR의 경우 한우(흑한우 미포함)와 수입우의 구별을 위한 PCR로 활용 가능한 것을 확인하였다.

1차 PCR의 결과는 Fig. 1로 모든 sample에서 control인 800bp band가 확인된다. 한우의 경우 추가적으로 398bp band가 공통적으로 관찰되고, 일부 한우에서는 457bp band (lane 1, 3)가 추가적으로 관찰된다. 흑한우의 경우 398bp band와 일부 흑한우에서 292bp band (lane 7, 9, 10)가 추가적으로 관찰되며, 수입우(수입우)에서는 398bp band와 457bp의 band가 관찰된다. 457bp band가 관찰된 sample의 경우 흑한우가 아니므로, 457bp band가 없는 sample 만을 선별하여 2차 PCR로 한우만을 선별, 한우 및 흑한우로 판별 할 수 있다.

Fig. 1.Multiplex PCR with Hanwoo and Jeju black cattle, and Imported beef. PCR products as seen on 2% agarose gel under UV illumination. Lane M ; 100bp DNA ladder(Bioneer, Korea), Lane 1~5 ; Hanwoo, Lane 6~10 ; Jeju black cattle, Lane 11~16 ; Imported beef. Jeju black cattle is not a 457bp Band.

Fig. 2는 2차 PCR의 결과로써, 한우는 800bp band만 확인되나, 흑한우는 423bp band가 하나 더 확인되어 이를 특이 Marker band로 확인할 수 있다. 또한 상기의 2차 PCR 조건은 흑한우 외의 수입우와 한우의 판별(Fig. 3) 또는 한우와 교잡우(먹우)에도 이용할 수 있음을 확인하였다(Fig. 4). 따라서 본 연구에서 설계한 Primer를 이용한 Multiplex PCR법이 쉽고 빠르게 원하는 결과를 도출할 수 있음을 알 수 있었다.

Fig. 2.Multiplex PCR with Hanwoo and Jeju black cattle. PCR product as seen on 2% agarose gel under UV illumination. Lane M ; 100bp DNA ladder(Bioneer, Korea), Lane 1~3 ; Hanwoo, Lane 4~8 ; Jeju black cattle. 423bp Band is identified in Jeju black cattle.

Fig. 3.Multiplex PCR with Hanwoo and Imported beef. PCR products as seen on 2% agarose gel under UV illumination. Lane M ; 100bp DNA ladder(Bioneer, Korea), Lane 1~8 ; Hanwoo, Lane 9~16 ; Imported beef. 423bp Band is identified in Imported beef.

Fig. 4.Multiplex PCR with Hanwoo and Mukwoo. PCR products as seen on 2% agarose gel under UV illumination. Lane M ; 100bp DNA ladder, Lane 1~16 ; Hanwoo, Lane 8 ; Mukwoo.

 

고 찰

본 연구는 육안으로 식별이 불가능한 도축된 고기에서의 DNA를 활용하여 각 쇠고기의 품종을 확인하는데 그 목적이 있다. 각 sample에서 채취한 genomic DNA는 기존에 밝혀진 MC1R 유전자 상의 ED, E+, e형의 유전형으로 비교적 뚜렷한 차이를 보이는 한우품종과 그 외 품종간의 분석이 가능한 Primer Set을 설계하였으며, MC1R상의 유전자에서 분석이 어려운 흑한우 품종은 MS Marker를 활용한 유전형분석을 통해 흑한우 품종과 수입우 품종간의 분석이 가능한 Primer Set을 설계하였다.

각 Priemr Set 판별비율은 한우와 수입우 판별율은 97%, 흑한우와 수입우 판별율은 83%에 이르렀으며, 한우와 흑한우의 판별율은 98%에 이르렀다. 각 판별율은 한우품종 200두, 흑한우품종 117두, 수입우 품종 50두의 genomic DNA를 활용하여 측정하였다. 결과적으로, 본 연구에서 개발한 Primer를 활용할 경우 기존의 한우 품종 판별 기술인 PCR-RFLP법이나 [7, 8], 한우확인시험법으로 활용되고 있는 MS Maker를 이용한 분석법[6]에 비해 쉽고 빠르게 한우 품종과 수입우 품종의 판별이 가능하며, 새로운 한우 품종인 흑한우도 수입우와 판별이 가능하다. 또한 두 Primer Set을 모두 활용할 경우, 한우와 흑한우와의 판별도 가능하여 3가지 소 품종에 대한 분류가 가능할 것으로 판단된다.

그러나 본 연구에서 개발된 Primer의 경우 흑한우와 수입우간의 판별율이 흑한우와 한우간의 판별율에 비해 비교적 낮은 것을 확인할 수 있다. 이는 기존의 보고된 논문의[11] 내용에 따라 현재의 흑한우 품종 중 일부가 과거 Angus, Holstain 등 다른 흑색 품종으로부터 도입되었을 것으로 판단되며, 이에 따라 MC1R 유전자형 분석을 보조할 유전자형으로 agouti signaling protein (ASIP) 유전자형에 대한 연구가 이루어지고 있으나[2], 모색의 변화에는 핵심적인 역할을 하지 않는 것으로 밝혀져 대체할 새로운 유전자형의 탐색이 요구된다.