Correlation of Gene Expression between Adiponectin and Glucose Transporter 4 in Mouse Adipose Tissue

생쥐 지방조직에서의 아디포넥틴과 포도당수송체-4 유전자 발현의 상관관계

Abstract

Adiponectin has been known to improve insulin sensitivity and elicit glucose uptake via increased glucose transporter 4 (GLUT4) translocation. In the current study, mRNA expression levels of adiponectin and GLUT4 were measured in subcutaneous adipose tissue from C57BL/6 mice fed normal (ND) or high-fat diet (HFD) until 16, 26, 36, 47, or 77 weeks of age starting from 6 weeks of age. Expression levels were also measured in mice with calorie restriction (CR) and in thiazolidinedione (TZD) treated mice. Using quantitative real-time PCR, we demonstrated that GLUT4 expression in adipose tissue significantly decreased in HFD mice groups and increased in CR (p<0.05) and TZD (p=0.007) groups while there was no difference in adiponectin mRNA expression levels between experimental and control groups. General linear regression models were used to assess the association of gene expression levels between adiponectin and GLUT4 and to determine whether adiponectin affects GLUT4 transcription. mRNA expression levels of adiponectin and GLUT4 are significantly associated each other in mice fed a ND (p<0.0001) or HFD (p<0.0001), in groups separated into each age and diet, and CR group (p=0.002), but not in TZD group (p=0.73). These results demonstrated that gene expression of adiponectin and GLUT4 is strongly associated, suggesting that there is a common regulatory mechanism for adiponectin and GLUT4 gene expression and/or adiponectin has a direct role in GLUT4 gene expression in adipose tissue.

아디포넥틴은 이미 합성된 GLUT4의 translocation 증가를 통해 포도당의 세포내 유입을 촉진하며 인슐린 민감도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 장기간(6주령부터 16, 26, 36, 47, 및 77주령까지)의 고지방식이(HFD)를 섭취한 비만 C57BL/6 생쥐와, 칼로리제한(CR) 또는 thiazolidinedione (TZD) 섭취에 의해 인슐린 민감성이 회복된 생쥐들로부터 지방조직을 적출하여 아디포넥틴과 GLUT4 의 mRNA 발현의 변화를 조사하였으며, 선형회귀분석(linear regression analysis)을 통해 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현량 사이의 상관관계를 평가하여 아디포넥틴이 GLUT4 유전자 발현의 전사단계에서도 영향을 미치는지의 가능성을 확인하고자 하였다. 지방조직에서의 유전자 발현량은 TaqMan probe를 이용한 real-time PCR로 정량되었다. 실험결과, 지방조직에서의 아디포넥틴 mRNA발현량은 여러 조건의 생쥐 그룹들 사이에 유의한 변화가 나타나지 않았지만, GLUT4의 유전자 발현량은 HFD군에서는 감소하고, CR군(p<0.05)과 TZD군(p=0.007)에서는 유의하게 증가하는 변화가 확인되었다. 또한, 아디포넥틴과 GLUT4 mRNA 발현량 사이에는 유의한 상관관계를 나타내고 있음이 확인되었다. ND군(p<0.0001), HFD군 p<0.0001), 또는 각각의 주령과 식이별 소그룹, 그리고 CR군(p=0.002) 에서도 두 유전자간의 발현량이 유의하게 연관되어 있었다. 그러나 TZD군(p=0.73)의 생쥐에서는 그 연관성이 사라짐을 관찰하였다. 이는 TZD가 아디포넥틴 유전자 발현에는 영향을 미치지 않지만, GLUT4유전자 발현은 촉진하기에 두 유전자 사이에 유의하지 않은 상관관계로 변화되었음을 시사한다. 이들 결과는 아디포넥틴과 GLUT4의 유전자 발현은 강하게 연관되어 있으며, 두 유전자 발현 조절에 대한 공통적인 작용기전의 존재 가능성 또는 아디포넥틴이 GLUT4 translocation뿐만 아니라 GLUT4의 유전자 발현에도 직접적으로 작용하고 있음을 시사한다.

서 론

비만은 인슐린저항성, 고혈압, 지질대사 이상 등을 포함하는 대사증후군을 나타내며 제2형 당뇨, 심혈관질환, 암 및 호흡기계 질환 등의 합병증 유발 위험성을 높이는 것으로 알려져 왔다[17, 26]. 비만화에 의해 증가하는 지방조직은 단순한 수동적인 에너지 저장고로의 역할을 넘어 대사작용이 왕성한 조직이며 일종의 내분비기관으로 작용하여 음식섭취, 에너지 소모와 지질 및 탄수화물 대사작용, 그리고 면역기능을 조절하는 분자 등 다양한 신호분자를 합성, 분비하는 기관으로 인식이 변화되었다[16, 17, 27]. 지방조직에서 분비되는 많은 신호분자들은 자가분비 및 주변분비 물질로도 작용한다[10].

비만에 의한 지방조직의 기능장애로 염증성 사이토카인의 분비증가와 아디포넥틴(adiponectin)과 같은 인슐린 민감도를 증가시키는 adipokine들의 분비가 감소되는 경향을 나타내기도 한다[24]. 아디포넥틴은 1995년 Scherer 등[28]에 의해 인간의 혈장에서 처음 발견되었으며 혈당의 세포로의 유입을 도우며 지방산을 산화시키는 일련의 과정을 증가시켜 인슐린 민감도를 증가시키는 역할을 한다[13, 29, 34]. 비만과 체질량지수 (BMI) 는 혈청 아디포넥틴 농도와 부적상관관계(negative correlation)에 있는 것으로 보고되었으며[3, 4, 33], 저준위의 혈청 아디포넥틴 농도는 인슐린저항성, 심혈관질환, 및 전신 염증상태의 위험도를 높인다고 보고되었다[20, 38]. 따라서, 아디포넥틴을 실험동물에 주입하면 당대사를 개선하고 혈장 중성지방 농도를 감소시키는 것으로 보고되었다[8, 37]. 그러나, 아디포넥틴에 의한 대사작용의 영향과 작용기전이 일관되거나 명료하지는 않다. 즉, 혈장 아디포넥틴 농도로 사람에서의 체중증가를 예측할 수 없었으며[32], 비만모델 실험동물들에서 농도변화가 없거나 증가하기도 하였다[2, 5, 7, 21].

혈당의 세포 내 이동은 주로 당수송체(glucose transporter)에 의한 촉진확산에 의해 일어나는데, 인슐린에 의해 조절되는 당수송체인 glucose transporter 4 (GLUT4) 는 주로 골격근과 지방조직에서 발견되며, 전신 포도당 대사에 주요한 기능을 수행한다[14]. 지방조직에서의 GLUT4 유전자 발현은 전신인슐린 민감성에 영향을 미치는 것으로 확인되었으며 GLUT4 유전자 발현 이상은 인슐린저항성의 첫 단계로 여겨진다[23].

기존의 연구들에서 아디포넥틴은 근육세포[19, 31, 36] 와 지방세포[35]에서의 포도당 세포내 유입을 증가시킨다고 알려졌으며, AMP kinase 의존적 기전으로 포도당의 세포내 유입을 조절하는 것으로 제안되었다[31, 36]. 아디포넥틴은 GLUT4 translocation을 증가시키는 방법을 통해 포도당 세포내 유입을 촉진하는 것으로 알려져 왔으나[6], Fu 등은 GLUT4 translocation의 증가뿐만 아니라 GLUT4 mRNA 발현 증가에 의해서도 포도당 유입을 촉진시킨다고 보고하였다[9].

따라서, 본 연구에서 매우 긴 기간 동안의 고지방식이 섭취와 비만화 후의 식이제한 또는 약물섭취를 통한 인슐린 민감도의 회복에 의한 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현의 변화를 관찰하고, 아디포넥틴이 GLUT4 translocation 촉진뿐만 아니라 GLUT4의 유전자 발현의 전사단계에서도 영향을 미치는지의 가능성을 확인하고자 이들 유전자 발현 변화와 두 유전자 발현의 상관관계분석을 수행하였다.

 

재료 및 방법

실험동물

수컷 실험용 생쥐(C57BL/6)를 4주령에 구입하여(Hyochang Science, Daegu, Korea) 2주 동안 적응기간을 거친 후 6주령 때부터 일반식이(normal diet, ND; fat 4 kcal%, Rodent NIH-31 Open Formula Auto, Zeigler Bros, Inc, Gardners, PA, USA)로 사육한 ND군과 고지방식이(high-fat diet, HFD; fat 45 kcal%, Feedlab Korea Co, Ltd, Korea)로 비만화를 유도한 HFD군으로 나누어 사육하였다. 물과 식이를 자유로이 먹이면서 온도는 23±3℃, 습도는 55∼65%이며 12시간 lightdark cycle로 조정된 동물실험실에서 사육하였다. 각 그룹(n≤10)의 생쥐들을 16주, 26주, 36주, 47주, 또는 77주령이 될 때까지 장기간 사육한 후 희생하여 실험대상 조직 적출에 사용하였다.

칼로리제한과 thiazolidinedione (TZD) 섭취

장기간의 고지방식이 섭취로 비만화가 유도된 후 칼로리제한(calorie restriction, CR)에 의한 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현의 영향을 알아보기 위해 6주령부터 47주령까지 고지방식이의 섭취로 비만화가 유도된 HFD군 생쥐를 사용하였다. 대조군(con, n=10)은 6주 동안 고지방식이를 자유급식으로 하였으며, CR군(n=10)은 대조군 섭취 칼로리의 70% 해당하는 일반식이로 6주간 사육하였다.

또한, peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARgamma) agonist로써 insulin sensitizer기능을 하는[30] TZD에 의한 영향을 확인하기 위해 47주령까지 고지방식이로 비만화를 유도한 생쥐 그룹에 carboxymethyl cellulose 용액을 vehicle로 사용한 TZD (10 mg/kg body weight) [11]를 2주간 매일 경구 투여하였다(TZD군, n=10). 대조군(n=8)으로 같은주령의 고지방식이 비만생쥐에 vehicle만 경구 투여하여 사용하였다.

cDNA 합성

16주, 26주, 36주, 47주, 77주령까지 일반식이, 고지방식이로 키운 ND군과 HFD군의 생쥐 95마리와 TZD 또는 vehicle투여 생쥐 및 칼로리제한 실험에 이용된 실험군과 대조군의 38마리 생쥐들은 sodium pentobarbital로 마취시키고 흉강을 열어 심장채혈 후 복부피하지방조직(subcutaneous abdominal adipose tissue)등 실험 대상조직을 적출하였다. 적출한 각 생쥐의 지방조직 약 300 mg을 RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. Total RNA추출 과정 중에 DNase I (RNase-free DNase set, Qiagen)를 처리하여 DNA의 오염이 없는 total RNA만 추출하였다. 각 total RNA시료 500 ng을 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit와 96-well GeneAmpⓇ PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 cDNA를 합성하였다.

Quantitative real-time PCR

아디포넥틴과 GLUT4 유전자 및 normalizing gene으로 사용된 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자의 mRNA 발현량을 측정하기 위해 quantitative real- time PCR을 기존의 표준곡선 방식대로 수행하였다[18]. 이를 위해 mouse TaqMan Gene Expression Assays (assay ID: adiponectin Mm00456425_m1, GLUT4 Mm01245502_m1, Applied Biosystems)를 사용하여 Real-Time PCR System 7500 (Applied Biosystems)에서 real-time PCR을 수행하였다. Normalizing gene으로 Mouse GAPDH Endogenous Control kit (part# 4352932E, Applied Biosystems)를 사용하였다. 각각의 plate well에 10 ng의 total RNA에 해당하는 cDNA를 포함하는 반응용액 20 μl에서 측정하였으며, 각각 유전자의 mRNA 발현량은 GAPDH mRNA 발현량으로 나눈 임의적인 상대적인 값(arbitrary relative values) 으로 나타내었다.

유전자 발현량에 대한 실험 데이터는 평균과 표준오차 (standard error of means, SEM)로 결과를 나타내었고, Student t-test로 유의성을 검정하였으며, 선형회귀분석(linear regression analysis)을 통해 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현량의 상관관계를 분석하였다. p<0.05인 것을 유의한 결과라 판단하였다.

 

결과 및 고찰

고지방식이 섭취에 의한 아디포넥틴과 GLUT4 발현양상 및 유전자 발현의 상관관계

기존의 연구보고들에서 생쥐를 이용하여 고지방식이 섭취에 의한 비만화와 지방조직에서의 아디포넥틴과 GLUT4의 발현에 대한 연구가 많이 진행되어 왔지만, 본 연구에서처럼 6주령부터 식이그룹을 나누어 16, 26, 36, 47, 및 77주령 까지 매우 긴 기간 동안 일반식이와 고지방식이로 사육한 C57BL/6 생쥐를 이용하여 이들 유전자의 발현 변화 양상을 비교 조사한 연구는 아직 없었다.

Real-time PCR을 이용하여 각 16, 26, 36, 47, 및 77주령의 대조군인 ND군 생쥐와 실험군인 HFD군 생쥐의 지방조직에서 아디포넥틴과 GLUT4의 mRNA 발현량을 조사한 결과, 아디포넥틴 발현량은 ND군과 HFD군 그룹간에 통계적으로 유의한 발현량 차이가 없었다(data not shown). 비만 또는 당뇨의 사람에서 혈장 아디포넥틴 농도가 감소되는 것으로 관찰 [33]되기도 하였지만, 많은 비만 실험동물에서 아디포넥틴이 변화되지 않던가 또는 오히려 증가하는 양상이 관찰되기도 하였다[2, 5, 7, 21]. 본 연구에서 변화 없는 아디포넥틴의 발현은 실험동물 모델에서의 다양한 아디포넥틴 발현양상을 보여주는 한 예가 되고 있다. Marecki등은 고지방식이의 쥐에서 관찰된 아디포넥틴 농도 증가는 전신 인슐린 민감도를 개선할 수는 없지만 어느 정도 유지하려는 반응에 의한 아디포넥틴의 발현 증가라 추측하였다[7].

한편, GLUT4 발현량은 26주령과 36주령에서 ND군에 비해 HFD군에서 각각 35%와 52%씩 감소하는 양상을 보였으나 (p<0.05), 47주령과 77주령의 HFD군에서는 상대적 발현량이 증가하여 같은 주령의 ND군에 유의한 차이점이 없을 정도로 증가하였다[15]. 이와 같이 지방조직에서 아디포넥틴과 GLUT4의 유전자 발현이 각각 다른 양상을 보였지만, 발현량의 상관관계 분석에서는 매우 강하게 서로 연관되어 있음을 확인하였다(Fig. 1). ND군과 HFD군 전체를 이용한 회귀분석(R=0.67, p<0.0001, Fig. 1A) 뿐만 아니라, ND군(R=0.83, p<0.0001, Fig. 1B)과 HFD군(R=0.64, p<0.0001, Fig. 1C)을 각각 따로 분석한 결과에서도 여전히 매우 강한 연관성을 보여주고 있다. 이 결과는 고지방식이 섭취에 의한 비만화의 영향 없이 두 유전자 발현 조절 기전이 긴밀히 연관되어 있음을 시사한다.

Fig. 1.Correlation of gene expression levels between adiponectin and GLUT4 in adipose tissue. Relative gene expressions of adiponectin and GLUT4 are significantly correlated in ND group (B), HFD group (C), and in both groups together (A). ND, normal diet; HFD, high-fat diet.

각 주령 및 식이 그룹에서의 아디포넥틴과 GLUT4의 유전자 발현의 상관관계

모든 주령의 생쥐 지방조직에서의 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현량을 이용한 분석에서 두 유전자 발현의 조절 기전이 매우 강하게 연관되어 있음을 보여주는 결과(p<0.0001, Fig.1)를 얻었지만, 각각의 식이와 각각의 주령별 생쥐그룹에서만의 상관관계 분석에서도 그 유의한 연관성을 유지하는지 여부를 분석하였다(Fig. 2). 이 분석을 통하여 두 유전자 발현조절에 대한 연관성의 강도를 확인하고자 하였으며, 오랜 기간 고지방식이 섭취에 의한 대사이상이 나타나는 HFD군에서의 연관성 유지여부 등을 각각의 조건별 그룹에서 확인하고자 하였다.

Fig. 2.Correlation analyses of gene expression levels between adiponectin and GLUT4 in separate age and diet groups. Relative gene expressions of adiponectin and GLUT4 are correlated each other in ND mice at 16 weeks of age (ND-16w) (A), ND-36w (C), ND-47w (D), ND-77w (E), HFD-16w (F), HFD-36w (H), and HFD-47w (I), but not in ND-26w (B), HFD-26w (G), and HFD-77w (J). ND, normal diet; HFD, high-fat diet.

분석의 결과, 소수의 예외 그룹을 제외하고 대부분의 그룹에서 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현의 연관관계를 유지하는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 통계적 유의성을 보이지 않았던 3개의 그룹 중에서 HFD군의 26주령(HFD-26W, Fig. 2G)의 경우에서도 특이한 변이 양상을 보이는 한 마리의 발현데이터를 제외한다면 유의한 상관관계의 결과를 나타내게 된다(R=0.74, P=0.02). 이들 분석의 결과는 지방조직에서의 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현은 주령(노화과정)과 식이 종류에 비의존적으로 연관되어 있으며 이 연관관계는 지속적이며 매우 강한 연관성을 유지하고 있음을 시사한다. GLUT4와는 달리 아디포넥틴은 고지방식이 섭취에 의한 비만화에 따라 평균 발현량이 유의하게 변화하지 않았지만, 각각의 생쥐에서 이들 두 유전자 발현은 매우 밀접한 상관관계를 나타내었다. 이들 결과는 두 유전자의 발현조절에 공통적인 작용기작이 관여하고 있거나 또는 아디포넥틴이 알려진 GLUT4의 translocation뿐만 아니라 직접적으로 mRNA 발현 단계에서 GLUT4 유전자 발현의 조절자로 기능하고 있을 가능성을 시사하고 있다. 아디포넥틴에 의한 GLUT4의 직접적인 유전자 발현의 증가는 Fu등에 의한 실험에서 그 가능성이 타진되었으며[9], 본 연구의 결과는 그 조절기능의 가능성이 높음을 재확인하였다..

CR 또는 TZD 섭취에 따른 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현의 상관관계 변화

칼로리 제한으로 6주간 사육을 거친 CR군에서의 지방조직아디포넥틴 유전자 발현은 대조군에 비해 소량 증가하는 경향을 보였지만 통계적으로 유의한 수준은 아니었다(data not shown). 이에 반해, CR군에서의 GLUT4 유전자 발현은 대조군보다 유의하게 증가(p<0.05)하는 것으로 나타났으며(Fig.3A), CR군에서의 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현은 유의한 상관관계를 유지하고 있음을 보여준다(p<=0.002) (Fig. 3B).이 CR군에 이용된 비만 생쥐는 매우 오랜 기간(41주간) 고지방식이 섭취로 인해 비만화와 대사이상을 갖고 있는 생쥐였지만 기존에 보고된 식이제한에 의한 당대사 개선의 결과를 여전히 동일하게 나타내었다. 즉, 식이제한이 지방세포의 GLUT4 유전자 발현 증가를 통해 포도당 대사가 개선되었음을 보여주는 기존의 연구보고와 일치한다[25].

Fig. 3.Gene expression levels of GLUT4 in adipose tissue from mice in CR group (A) and TZD group (C). A significant correlation of gene expression levels between adiponectin and GLUT4 was found in CR group (B), but not in TZD group (D). ND, normal diet; HFD, high-fat diet; con, control; CR, calorie restriction.

또한 장기간의 고지방식이 섭취에 따른 비만화와 대사특성이 달라진 생쥐가 약물에 의해 인슐린저항성이 개선되었을 때에도 아디포넥틴과 GLUT4의 유전자 발현특성과 두 유전자간의 상관관계가 유지되는지를 확인하였다. 47주령의 HFD군을 TZD를 섭취한 TZD군(n=10)과 vehicle만 섭취한 대조군 (n=8)으로 나누어 2주 동안 TZD섭취에 의한 영향을 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과 유의한 아디포넥틴 유전자 발현변화는 관찰되지 않았으나(data not shown), TZD군에서의 GLUT4 유전자 발현은 47주령의 HFD군(P=0.01)과 또한 vehicle군( p=0.007)보다 통계적으로 유의하게 높은 값을 나타내었다(Fig. 3C). 그러나 아디포넥틴과 GLUT4 유전자 발현에 대한 연관성이 사라지는 상관관계 분석결과가 나타났다(p= 0.73) (Fig. 3D). TZD군에서의 GLUT4 발현 변화와 아디포넥틴 발현과의 상관관계 소실은 기존의 연구들에서 보여준 TZD에 의한 GLUT4 발현 변화의 결과들에서 그 이유를 고찰할 수있다. PPARgamma의 agonist인 TZD가 GLUT4 mRNA발현량을 증가시킨다는 보고가 있으며[1, 12, 22], 이런 GLUT4증가가 아디포넥틴 발현 조절과는 비교적 독립적이라면 본 연구에서의 TZD군의 GLUT4 유전자 발현은 독립적으로 증가되고 반면에 아디포넥틴은 별다른 영향을 받지 않았으며 이들 유전자의 발현 상관관계는 깨졌을 것으로 추측된다.

이들 결과는 고지방식이의 장기간 섭취에 의한 당대사 및 인슐린 민감성 관련 지방세포 유전자의 조절 변화와 아디포넥틴과 GLUT4유전자 발현의 공통 조절작용의 존재에 대한 가능성 또는 GLUT4 mRNA발현에 대한 아디포넥틴의 조절기능의 가능성을 확인하였으며 이들 조절 기전에 대한 추가적인 연구를 위한 기초증거로 활용될 수 있을 것이다.