황련해독탕(黃連解毒湯)이 외열 스트레스(화사(火邪))에 의한 동물모델에서 c-fos 발현에 미치는 영향 연구

The Effect of Hwangryunhaedok-tang on the c-fos Level in Mice Exposed to Heat Stress

Abstract

Objectives: Hwangryunhaedok-tang (HH) is a representative heat clearing multiherb prescription. We evaluated the protective effect of HH against heat stress exposure in mice. Methods: Six weeks old ICR mice were used for this study. After $43^{\circ}C$ heat stress for 15 minutes, we evaluated the changes of motor activity and c-fos expression level to determine the proper heat stress and evaluation time. The subjects were divided into 4 groups (1. control group, 2. heat stress group with normal saline, 3. heat stress group with administration of 100 mg/kg, and 4. heat stress group with administration of 1000 mg/kg). After oral administration of HH once a day for 3 days, 2, 3, 4 groups were exposed to $43^{\circ}C$ heat stress for 15 minutes. Then, we evaluated the motor activity for 120 minutes and analyzed the c-fos expression using western blot. We investigated the effect of HH and its ingredients on c-fos expressions after heat stress. The mice were administrated HH, Scutellariae Radix, Coptidis Rhizoma, Phellodendri Cortex, and Gardeniae Fructus for 3 days. After one hour of last treatment, the mice were exposed to heat stress at $43^{\circ}C$ for 15 min. After two hours, the hypothalamus was dissociated and lysed to measure c-fos expression. Results: After oral administration of HH for 3 days, motor activity was recovered insignificantly. 100 mg/kg HH treatment reduced the c-fos expression after heat stress but insignificantly. Among the ingredients of HH, Coptidis Rhizoma and Scutellariae Radix treatment groups significantly reduced the c-fos after stress. Conclusions: These results show that Hwangryunhaedok-tang may be effective to reduce the heat stress response.

I . 서 론

한의학에서 병이 오는 다양한 원인 중에서 “寒暑燥濕風火”의 六氣는 매우 중요한 의미를 갖는다. 그 중에서도 劉河間은 “火熱”이 제일 중요하다고 주장하여, 辛凉解表의 처방을 처음으로 만들고 사용하였다1). “熱邪”는 여성에게 있어 病因으로 중요한 의미를 갖는다. 그 대표적인 證이 ≪傷寒論≫과 ≪金匱要略≫에서 처음 등장한 熱入血室證으로, 여성의 월경과 관련된 월경전증후군, 갱년기 증후군과 밀접한 연관이 있으며2), 산후감염, 골반염, 자궁내막염 등과도 상호 참조할 수 있다3).이러한 熱邪를 유발할 수 있는 외부적, 내부적 원인은 여성의 면역기능과도 관련이 된다. 노 등4)은 이런 溫熱자극을 주는 환경과 附子理中湯의 溫熱之劑가 면역 증진 효과가 있는지에 대한 연구를 진행하기도 하였지만, 火熱은 病因으로 접근하여 熱邪에 대한 寒冷한 처방이 미치는 영향에 대해 이번 연구를 진행하였다.

黃連解毒湯은 黃連, 黃芩, 黃白, 梔子로 구성되어 있어서, 부인과 영역에서도 많이 사용되는 대표적인 寒冷한 처방이다. 이 처방은 일체의 實熱火毒이 三焦에 있는 증상들을 치료하는 효과와 각종 熱病에 활용된다5). ≪東醫寶鑑≫에서도 黃連解毒湯 및 連繫方은 外科질환, 火熱病, 眼科, 傷寒病등의 20개 영역에서 사용되었고, 부인과 영역에서도 四物湯과 합방하여 崩漏를 다스리고, 安胎하거나, 姙娠惡阻, 帶下 등에서 많이 활용되는 대표적 처방이 된다6). 黃連解毒湯은 약리학적 연구에서도 解熱, 鎭痛, 鎭靜, 腸管의 弛緩作用이 확인되었다7). 급성기 뇌경색 환자에 대한 경동맥 혈류량의 호전과 고지혈증에 대한 개선 효과8), 뇌허혈로 인한 인지결함 개선 효과9), 궤양성 대장염의 손상된 조직 회복과 염증 감소의 효과10), 아토피 피부염에 대해서 표피 수분증발 억제 및 과민반응 감소효과11), 우울증 동물모델에서 우울성향을 감소시키는 효과12), 원인 불명열에 대한 치료 효과13) 등이 보고되고 있다. 갱년기 환자에게 黃連解毒湯을 투여하여서 加味逍遙散과 비슷한 정도의 갱년기 증상의 개선을 보였다14). 이처럼 黃連解毒湯이 여성에 있어서도 熱로 인한 병들에 대한 유효한 효과는 다양한 연구들에서 확인 할 수 있었다.

본 연구는 寒冷한 성질의 대표 처방인 黃連解毒湯의 효능이 전통적 한의학의 寒熱 이론에 따른 활용 효과에 대해서 실험적으로 검증해보고자 하였다. 이에 외열 스트레스를 주어 熱邪가 침입하는 환경을 만들어 그로 인한 변화를 관찰하고, 黃連解毒湯을 경구 투여한 후에 운동성 변화와 스트레스를 받으면 증가되는 것으로 알려진 c-fos의 농도변화를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

 

II . 연구 대상 및 방법

1. 재 료

1) 약 재

본 연구에서 사용한 黃連解毒湯 및 구성 약재의 추출물은 한상용 등의 논문에 발표된 시료와 동일한 것을 사용하였다15). 실험에 사용한 黃連解毒湯의 구성 약제는 경북 안동시 옴니허브에서 구입하였으며, ≪外臺祕要≫에 수록된 1濟의 기본 구성 배합에 따라 아래의 Table 1과 같이 제조 하여 한풍제약에 의뢰하여 추출 후 최종 파우더 형태로 받아 사용하였다. 실험 전까지 -20℃에 보관하였으며, 사용 전 3차 증류수에 추출 시료를 넣어 완전히 용해 시킨 후 사용하였다.

Table 1.Composition of Hwangnyeonhaedok-tang

2) 시 약

본 연구에 사용된 antibody는 anti-rabbit c-fos(Enzo Life Sciences, US), anti-mouse-β-actin(Santa Cruz, USA), anti-rabbit 또는 mouse-horseradish peroxidase(HRP, Assay Designs, USA)를 사용하였으며, protein assay는 BioVision(USA)을 사용하였다. 기타 사용된 모든 시약은 분석 등급 이상으로 Sigma-Aldrich사에서 구입한 것을 사용하였다.

2. 방 법

1) 사 육

본 연구에 사용된 웅성 ICR 쥐 6주령은 Daehan Biolink(Korea)에서 구입하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(22±2℃), 습도(53±3%) 및 명암주기 (12시간)는 자동적으로 조절되도록 하였다. 쥐는 3-5마리씩 나누어 사육하였다. 1주일 적응시킨 후 사용하였다.

2) 조건 설정

본 실험을 수행하기 전 열 자극 조건 및 열 자극 후 변화 확인 시점을 확립하기 위하여, chamber(Jeio Tech, Korea)를 이용한 43℃ 15분 열 자극 후 30분간 직장, 귀, 꼬리, 몸의 체온 변화를 측정하였다. 또한, 열 자극 후 120분간 운동능 차이 및 hypothalamus의 c-fos 발현양 변화를 측정하였다.

3) 투 약

열 자극 전 3일간 黃連解毒湯 또는 구성약재 추출물을 투약하였으며, 마지막 투약 1시간 후 43℃ 15분 열 자극을 가하였다. 黃連解毒湯의 열 자극에 대한 영향 평가 실험은 4개의 군으로 나누어서 진행하였다. 제1군은 대조군으로 아무 처리하지 않았고, 제2군은 열 자극 군으로 식염수를 3일간 1일 1회 경구 투여하였고, 제3군은 黃連解毒湯 100 mg/kg을 투여한 군이며, 제4군은 黃連解毒湯 1000 mg/kg 을 투여한 군이다. 실험군에는 식염수에 용해시킨 黃連解毒湯을 3일간 1일 1회 경구 투여하였다. 3일째 되는 날 제1군을 제외한 2, 3, 4군은 43℃ chamber에 15분간 넣어 열 자극을 가하였다. 黃連解毒湯 구성 약재의 열 자극에 대한 영향 평가 실험은 7개의 군으로 나누어서 진행하였다. 제1군(대조군) 및 제2군(열 자극 군)은 식염수를 3 일간 1일 1회 경구 투여하였다. 제3군(黃連解毒湯 1000 mg/kg 투여군), 제4군(황금 474.9 mg/kg 투여군), 제5군(황련 165.5 mg/kg 투여군), 제6군(황백175.8 mg/kg 투여군) 및 제7군(치자 281.7 mg/kg 투여군)은 식염수에 용해시킨 각 추출물을 3일간 1일 1회 경구 투여하였다. 3일째 되는 날 제1군을 제외한 2, 3,4군은 43℃ chamber에 15분간 넣어 열 자극을 가하였다. 黃連解毒湯 구성 약재의 투여량은 黃連解毒湯 내 구성약재의 비율과 수득률을 고려하여 계산하였다(Table 2). 열 자극 후 120분간 운동능을 관찰하였으며 행동실험 종료 직후 hypothalamus의 c-fos 발현양 변화를 측정을 위해 희생시켰다.

Table 2.Gavage Doses Based on the Yield of Each Extract

4) Open field test

43℃ 15분 열 자극 후 120분간 운동능을 측정하기 위하여 open field test를 실시하였다. 40×25×18 cm testing chamber 안에 쥐를 넣고 120분간 움직임을 기록하였으며 Viewer 프로그램(Biobserver, Germany)을 이용하여 이동 거리를 자동분석 하였다.

5) Western blot analysis

43℃ 15분 외열 자극 후 경추 탈골하여 뇌조직을 적출 후 hypothalamus를 얼음 위에서 분리하였다. 혈액 등 이물질을 제거하기 위하여 phosphate buffered saline을 이용하여 1회 세척 후 protein assay 용액을 넣어 조직을 분쇄 하였다. 12000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상등액을 시료로 사용하였다. 10% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel에 전기 영동하여 단백질을 분리한 다음 PVDF-membrane에 분리된 단백질을 전사하였다. Tween-20을 포함한 tris-buffered saline(TBST)에 희석한 5% skim milk에 1시간 반응하여 비특이반응을 제거한 후 1차 antibody(c-fos, 1:1000; β-actin, 1:2000)를 넣고 4도에서 12시간 반응시켰다. 그 후 2차 antibody (HRP-secondary, 1:5000)를 넣고 상온에서 1시간 반응하였다. ECL-detection kit를 이용하여 발색한 후 LAS-4000 mini (Fujifilm, Japan)으로 발현량을 확인하였다. 각 반응 중간에 TBST로 15분씩 4회 세척하였으며 단백질은 Bradford 방법을 이용하여 정량하였다.

3. 통계처리

모든 측정값은 mean±SEM으로 표시 하였다. 본 연구의 통계처리는 Graphpad Prism 5.0(USA) 프로그램을 사용하였으며, one-way ANOVA를 이용하여 평균값의 유의성을 5% 미만의 한계로 조사하였다.

 

III . 결 과

1. 외열 스트레스 온도 및 시간 설정

외열 스트레스의 경우 문헌 고찰 결과 40~44℃에서 연구가 이루어 졌으며, 42~44℃는 heat stroke model로 주로 사용된다. 예비 실험 결과, 43℃ 30분 외열 스트레스에서 사망 쥐 발생을 관찰 하였다. 따라서 43℃ 30분 이내 스트레스 조건에서 온도를 측정하며 관찰하였다. 43℃ 외열 스트레스 13분이 지나면서 급격히 컨디션이 악화됨을 관찰하였다. 스트레스 15분 후 직장온도 측정 결과 정상체온보다 약 3.5℃ 상승하였으며, 10분이 경과 후 정상체온으로 돌아옴을 확인 하였다. 귀, 꼬리, 몸통 체온 측정 결과는 외부 온도에 민감하여 포인트 설정에 영향을 미치지 못하였다(Fig. 1).

Fig. 1.Effect of Heat Stress on Temperatures of Mice after Heat Stress.

2. 외열 스트레스에 의한 운동능력 감소 평가 연구

ICR mice에 43℃ 15분간 스트레스를 가한 후, 120분 동안 locomotor activity를 측정 한 결과, 정상군과 스트레스군 사이에 통계적으로 유의한 운동능 차이를 보임을 확인 하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Effect of Heat Stress on Behavioral Impairment Using an Open Field Test.

3. 외열 스트레스에 의한 hypothalamus 내 stress 관련 protein: c-fos 측정

외열 스트레스 후, hypothalamus에서 neural activity를 나타내는 c-fos가 꾸준히증가하는 경향을 보임을 확인 하였다. 따라서, 43℃ 15분간의 외열 스트레스 후 120분을 실험 point로 설정 하였다(Fig. 3).

Fig. 3.Effect of Heat Stress on c-fos Expression.

4. 黃連解毒湯의 외열 스트레스에 의한 운동능력 감소 개선 평가 연구

약물 투여 후 43℃ 15분간 스트레스를 가한 후 120분 동안 움직인 거리 측정 결과, 스트레스에 의해 움직임이 둔화되었으며, 黃連解毒湯 약물투여군은 통계적으로 유의미한 결과는 나타내지 않았으나 활발해진 경향성을 보였다(Fig. 4).

Fig. 4.Effect of Hwangryunhaedok-tang on Movement Distance after Heat Stress.

5. 黃連解毒湯의 외열 스트레스에 의한 hypothalamus 내 stress 관련 protein 변화 연구: c-fos expression level 측정

Hypothalamus의 c-fos expression level 측정 결과, 정상군과 스트레스군간 차이는 있으나 스트레스군과 약물군 간에 통계적으로 의미 있는 차를 보이지 않았다(Fig. 5).

Fig. 5.Effect of Hwangryunhaedok-tang on c-fos Expression after Heat Stress.

6. 黃連解毒湯 및 구성약물의 외열 스트레스에 의한 hypothalamus 내 stress 관련 protein 변화 연구: c-fos expression level 측정

Hypothalamus의 c-fos expression level 측정 결과, 정상군과 스트레스군간 차이를 보였으며, 스트레스군과 처방군과도 차이를 보였다. 黃連解毒湯 비교군에서는 황금, 황련 투약군이 黃連解毒湯과 유사한 c-fos level 감소를 보였으나, 군간 통계적 차는 보이지 않았다(Fig. 6).

Fig. 6.Effect of Hwangryunhaedok-tang and its Ingredients on c-fos Expressions after Heat Stress.

 

IV . 고 찰

한의학에서 “熱邪”는 六氣 중 한가지로 病因으로서의 큰 의미를 갖는다. 이러한 火熱病의 치료에 있어서 이동원은 비위의 補益을 위주로, 병변의 양상과 부위에 따라서 養血, 淸熱 등의 치법을 중시하였고, 丹溪는 주로 滋陰을 중심으로, 氣血의 허손, 鬱, 濕熱, 痰 등의 병변에 따라서 치법을 운용하였고, 孫一奎는 정기의 허실, 사기의 소재와 속성으로 치료 방법을 결정해야 한다고 하였다16). 최근중풍 치료에 있어서 主火論에 근거해서 黃連, 黃芩, 石膏, 大黃 등의 寒凉한 성질의 약제가 사용되고 있고17), 일정 수준 이상의 火熱 증상을 나타내는 급성기 뇌경색 환자에게 火熱 증상을 경감시키는 한약을 사용하는 것이 그 운동기능의 회복에도 도움이 된다는 연구도 있었다18). 이처럼 火熱로 인해 발병하는 중풍에 대해서 寒冷한 약제를 이용한 치료와 연구들이 진행되고 있는데, 여성 질환에서도 갱년기, 월경통 등에서도 한열의 변증은 꼭 살펴야 하는 진단과정이다. 월경통을 변증함에 있어서 虛實과 寒熱을 동시에 살펴야 한다19). 한의학에서 寒熱虛實의 변증은 치료방향을 결정하는 중요한 요인이 되는데, 류마티스 환자를 대상으로 한 연구20), 과민성 장증후군 환자의 허실21), 월경통22), 중풍환자의 한열허실 변증지표23), 치매24) 등이 발표되었다. 이러한 질환들은 여성의 월경 및 폐경 후 치매 위험성이 높아지는 현상과 밀접한 연관이 있어, 寒熱 자극에 대한 치료 및 처방에 대한 연구가 필요하다.

黃連解毒湯은 대표적인 寒冷한 처방으로 각종 熱病 치료의 대표 처방이다. ≪東醫寶鑑≫에서도 黃連解毒湯 및 連繫方은 外科질환, 火熱病, 眼科, 傷寒病 등의 20개 영역에서 사용되었고, 부인과 영역에서도 四物湯과 합방하여 崩漏를 다스리고, 安胎하거나, 姙娠惡阻, 帶下 등에서 많이 활용 된다8). 黃連解毒湯은 우울증 동물모델에서 우울성향을 감소시키는 효과14), 원인불명 열에 대한 치료 효과15)에서처럼 火熱과 관련된 병들에 대한 유효한 가능성은 보이고 있다. 火熱病은 傷寒이 원인이 되어서 傳變하여서 熱病이 되는 이론이 ≪內經≫에서 언급되어서 寒, 風, 風寒의 邪氣에 집중하였었다면, 후대로 넘어오면서 葉天士는 溫熱病의 원인으로 溫邪를 가장 중요시 하여서 초기에 辛凉輕劑를 사용하여야 하는 이론을 펼쳤었다1). 최근 연구에서 黃連解毒湯은 한의학에서의 熱邪와 밀접한 관련이 있는 염증을 억제하는 효과와 기전에 대한 여러 연구들이 진행되고 있다. 黃連解毒湯은 lipopolysaccharide(LPS)로 유발된 급성염증 모델에서 cytokine(IL-L, IFN-γ)와 전염증성 매개물질들(Nf-κb, MAPKs 및 I-Nos)을 억제하는 효과를 보여서 염증완화 효과와 기전에 대해서 보고되었다25). 박 등26)은 LPS를 뇌실 내로 투여한 생쥐의 혈중 IL-6와 TNF-α의 농도변화를 관찰하였는데, 黃連解毒湯은 두 인자에 대한 유의한 감소는 나타내지 않았다는 연구 결과를 보고하였다. 외부에서 주는 寒熱의 개념에서 실험적으로 그 의미를 알아보기 위한 연구가 진행 되었는데, cold stress를 준 뒤에 혈중에서 스트레스 호르몬 지표로 사용되는 corticosterone의 변화에 대해서 黃連解毒湯은 스트레스 완화 효과를 보였고, 그 구성약제 중 梔子가 thyroxine을 증가시켰고, 黃柏이 corticosterone을 증가시켰다17).

본 연구는 寒冷한 성질의 대표 처방인 黃連解毒湯을 활용하여, 한의학의 寒熱 이론에 따른 활용 효과에 대해서 실험적으로 검증하는 연구 목표를 가지고 설계 되었다. 우선, 외열 스트레스를 주어 熱邪가 침입하는 환경을 만들어 그로 인한 병적인 변화를 관찰하고자 하였다. 동물 모델에서 사망하지 않으면서 병인으로서의 자극의 적정 수준을 결정하고, 그 모델확립한 후에 黃連解毒湯을 경구 투여한 후에 운동성 변화의 회복 정도와 c-fos의 농도변화를 관찰하였다.

외열 스트레스를 유발하는 적정 온도와 시간에 대해서 기존의 문헌을 고찰하여 모델을 설정하기 위한 연구를 하였다. Yang 등27)의 연구에서 43℃에서 mice가 사망하지 않는 결과를 보였고, 이를 바탕으로 40~44℃에서 연구가 이루어 졌으며, 42~44℃는 heat stroke model로 주로 사용된다. 예비 실험 결과, 43℃ 30분 외열 스트레스에서 사망하는 쥐가 발생하는 것을 관찰하였다. 따라서 43℃ 30분 이내 스트레스 조건에서 온도를 측정하며 관찰하였다. 43℃ 외열 스트레스 13분이 지나면서 급격히 컨디션이 악화됨을 관찰하였다. 스트레스 15분 후 직장온도 측정 결과 정상체온보다 약 3.5℃ 상승하였으며, 10분이 경과 후 정상체온으로 돌아옴을 확인 하였다. 이후, ICR mice에 43℃ 15분간 스트레스를 가한 후, 120분 동안 locomotor activity를 측정 한 결과, 정상군과 스트레스군 사이에 통계적으로 유의한 운동능 차이를 보임을 확인 하였고, 외열 스트레스 후 hypothalamus에서 neural activity를 나타내는 c-fos가 꾸준히 증가하는 경향을 보임을 확인하였다. 따라서, 43℃ 15분간의 외열 스트레스 후 120분을 실험 point로 설정 하였다.

그 다음으로 黃連解毒湯의 외열 스트레스에 대한 영향을 알아보기 위한 연구를 진행하였다. 약물 투여 후 43℃ 15분간 스트레스를 가한 후 120분 동안 움직인 거리 측정 결과, 스트레스에 의해 움직임이 둔화되었으며, 黃連解毒湯 약물 투여군은 통계적으로 유의미한 결과는 나타내지 않았으나 활발해진 경향성을 보였다. 외열 스트레스의 작용 기전에 대해서 알아보기 위해서, Hypothalamus의 c-fos expression level 측정 결과, 정상군과 스트레스군간 차이는 있으나 스트레스군과 약물군간에 통계적으로 의미 있는 차를 보이지 않았다. 다음으로 黃連解毒湯 비교군에서는 구성약물들을 실험한 결과, 황금, 황련 투약군이 黃連解毒湯과 유사한 c-fos level 감소를 보였으나, 군간 통계적 차는 보이지 않았다. 최근 연구에서 c-fos는 neuronal activity의 표지자로 많이 사용되는데, c-fos는 기억력과 학습을 조절하는 기전에 관여 한다28). c-fos는 세포 반응을 매개하는 역할을 한다고 알려져 있는데, 여러 약물이나 스트레스를 포함한 생리적 자극에 의해서 발현되는 인자로 이전에 CMS로 유발된 우울증 모델 연구에서도 黃連解毒湯은 c-fos를 유의하게 감소시키는 이전 연구 결과가 있었다14). 본 연구에서는 외열 스트레스 자극으로 인한 c-fos 상승을 억제 하는 결과를 보인 것이다. 黃連解毒湯의 이런 효과를 확인하기 위해서 그 구성약물들의 c-fos 발현을 비교하였을 때 황련과 황금에서 유의한 변화가 있었다. 황련의 주 alkaloid 성분은 berbeine인데, 이 성분은 중추신경계의 강력한 억제효과를 가지고 있어서 nicotine으로 유발된 locomotor activity를 억제하고, c-fos 발현을 억제하였다29). 황금의 flavonoid인 baicalein은 6-OHDA로 유발된 퇴행성 모델에서 보호효과와 MPTP 신경독성에 대해서도 신경학적 보호효과가 보고되었다30). 이 두 약물이 黃連解毒湯의 열에 대한 운동기능 회복 효과에 주요한 역할을 하고 있음을 알 수 있었다.

이상의 연구에서 黃連解毒湯은 외열 스트레스 자극으로 인한 운동성 저하를 개선시키고, 그 기전에 대한 기초 자료가 될 수 있을 것으로 생각된다.

 

V . 결 론

연구는 寒冷한 성질의 대표 처방인 黃連解毒湯의 효능이 전통적 한의학의 寒熱 이론에 따른 활용 효과에 대해서 실험적으로 검증해보고자 하였다. 이에 외열 스트레스를 주어 熱邪가 침입하는 환경을 만들어 그로 인한 변화를 관찰하고, 黃連解毒湯을 경구 투여한 후 운동성 변화 c-fos의 농도변화를 관찰하여 다음과 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

1. 외열 스트레스 동물 모델 설정을 위해서, ICR mice에 43℃ 15분간 스트레스를 가한 후, 120분 동안 locomotor activity를 측정 한 결과, 정상군과 스트레스군 사이에 통계적으로 유의한 운동능 차이를 보임을 확인 하였고, 외열 스트레스 후 hypothalamus에서 neural activity를 나타내는 c-fos가 꾸준히 증가하는 경향을 보임을 확인하였다. 따라서, 43℃ 15분간의 외열 스트레스 후 120분을 실험 point로 설정하였다.

2. 약물 투여 후 43℃ 15분간 스트레스를 가한 후 120분 동안 움직인 거리 측정결과, 스트레스에 의해 움직임이 둔화 되었으며, 黃連解毒湯 약물투여군은 통계적으로 유의미한 결과는 나타내지 않았으나 활발해진 경향성을 보였다.

3. Hypothalamus의 c-fos expression level 측정 결과, 정상군과 스트레스군간 차이는 있으나 스트레스군과 약물군간에 통계적으로 의미 있는 차이를 보이지 않았다.

4. Hypothalamus의 c-fos expression level 측정 결과, 정상군과 스트레스군간 차이를 보였으며, 스트레스군과 처방군과도 차이를 보임. 黃連解毒湯 비교군에서는 황금, 황련 투약군이 黃連解毒湯과 유사한 c-fos level 감소를 보였으나, 군간 통계적 차는 보이지 않았다.