LC-MS/MS를 이용한 곽향정기산(藿香正氣散) 추출물 중 20종 성분의 함량분석

Quantitative Analysis of the Twenty Marker Components in Gwakhyangjeonggi-san using Ultra-Performance Liquid Chromatography with Mass Spectrometer

  • 서창섭 (한국한의학연구원 한약방제연구그룹) ;
  • 신현규 (한국한의학연구원 한약방제연구그룹)
  • Seo, Chang-Seob (Herbal Medicine Formulation Research Group, Korea Institute of Oriental Medicine) ;
  • Shin, Hyeun-Kyoo (Herbal Medicine Formulation Research Group, Korea Institute of Oriental Medicine)
  • 투고 : 2014.04.01
  • 심사 : 2014.05.27
  • 발행 : 2014.06.30

초록

Generally, Gwakhyangjeonggi-san has been used for treatment of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. In this study, an ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometer method was established for the simultaneous quantification of marker compounds 1-20 in Gwakhyangjeonggi-san water extract. All analytes were separated by gradient elution using two mobile phases on a UPLC BEH $C_{18}$ ($100{\times}2.1mm$, $1.7{\mu}m$) column and maintained at $45^{\circ}C$. The injection volume was $2.0{\mu}L$ and the flow rate was 0.3 mL/min with detection at mass spectrometer. Regression equations of the compounds 1-20 were acquired with $r^2$ values ${\geq}0.9950$. The values of limit of detection and quantification of all analytes were 0.01-2.79 ng/mL and 0.03-8.37 ng/mL, respectively. The amounts of the compounds 1-20 in Gwakhyangjeonggi-san water extract were not detected $-3,236.67{\mu}g/g$. The established LC-MS/MS methods will be valuable to improve quality control of traditional herbal formula, Gwakhyangjeonggi-san.

키워드

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용된 藿香正氣散을 구성하는 13종의 구성 생약은 모두 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 구입하여 동국대학교 이제현 교수(Gyeongju, Korea)로부터 감정 후 사용하였다. 藿香正氣散 구성 생약들의 표본(2012-KE32-1~KE32-13)은 한국한의학연구원 한약방제연구그룹에 보관하였다.

시약 및 기기 −본 연구에 사용된 표준물질인 homogentisic acid, 3,4-dihdroxybenzaldehyde 및 rosmarinic acid는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, (+)- catechin, (-)-epicatechin, spinosin, hesperidin, liquiritigenin, luteolin 및 platycodin D2는 Chengdu Biopurify Phytochemicals(Chengdu, China)에서 구입하였다. Liquiritin, glycyrrhizin 및 6-gingerol은 Wako(Osaka, Japan), platycodin D, honokiol 및 magnolol은 ChemFaces(Wuhan, China) 및 atractylenolide Ⅰ, atractylenolide Ⅱ, atractylenolide Ⅲ 및 imperatorin은 KOC Biotech(Daejeon, Korea)에서 각각 구입하여 사용하였다. 이들 표준물질의 순도는 모두 97.0%이었다. 정량분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J.T.Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 개미산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

Table I.Composition of Gwakhyangjeonggi-san

20종의 성분 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 ACQUITY UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 질량분석기는 ESI source가 장착된 탠덤 사중극자 질량분석기(ACQUITY TQD LC-MS/MS, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 Waters MassLynx software(version 4.1, Milford, MA, USA)를 사용하여 수집 및 처리하였다.

藿香正氣散 물 추출물 조제 − Table I과 같이 구성되는 藿香正氣散 물 추출물을 조제하기 위하여 13종 한약재 약 5.0 kg(33.75 g×148)을 분쇄한 후 10배수의 물을 넣어 초고속진공저온추출기(Cosmos 660, Kyungseo Machine Co., Incheon, Korea)를 이용하여 100℃에서 2시간 전탕 한 후 표준체(No. 270, 53 μm, Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 이용하여 여과한 후 동결건조기(PVTFD100R, IlShinBioBase, Dongduchun, Korea)를 사용하여 동결 건조하였다. 동결 건조 결과 644.5 g(수득율 12.9%)의 추출물을 얻었다.

표준액의 조제 − 藿香正氣散 구성 생약의 주요 성분들인 20종의 표준물질에 대한 표준용액은 1.0 mg/mL의 농도로 메탄올에 녹여 조제하였으며, 4℃에 보관하면서 사용 전에 희석하여 사용하였다.

검액의 조제 − LC-MS/MS 정량분석을 위하여 동결 건조된 藿香正氣散 물 추출물100 mg을 정확히 취한 후 물을 넣어 5 mL로 맞춘 후 5분간 초음파 추출하였다. 그 후 추출액 100 μL를 물을 이용하여 10 mL로 100배 희석한 후 0.22 μm 멤브레인 여과하여 검액으로 하였다.

Fig. 1.Chemical structures of 20 marker compounds of Gwakhyangjeonggi-san.

Table II.10.1% (v/v) formic acid in water 2Acetonitrile

UPLC 및 LC-MS/MS 분석 조건 − 13 종의 생약으로 구성된 藿香正氣散의 주요 성분에 대한 함량을 분석하기 위하여 Waters사의 ESI 소스의 질량분석기가 결합된 UPLC를 사용하여 분석하였다. 성분의 분리를 위하여 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100.0 mm, 1.7 μm) 칼럼을 사용하였으며, 이동상은 0.1% 개미산이 함유된 물과 아세토나이트릴을 사용하여 기울기 용매 조건으로 흘려주었다(Table II). 칼럼은 45℃를 유지하였으며, 유속은 분당 0.3 mL 및 주입량은 2.0 μL였다. 또한 정량분석을 위하여 ACQUITY TQD MS를 사용하여 양이온과 음이온 모드에서 검출하였다. 최적의 검출을 위해 3.3 kV의 capillary voltage, 3 V의 extract voltage, 120℃의 source temperature, 0.3 V의 RF lens, 300℃의 desolvation temperature, 600 L/h의 desolvation gas, 50 L/h의 cone gas 및 0.14 mL/min의 collision gas 등 (Table II)과 각 성분의 precuusor ion, product ion, cone voltage 및 collision energy 등에 대한 최적의 조건을 Table III과 같이 설정하여 다중반응탐색법(multiple reaction monitoring; MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다.

검량선 작성 − 20종의 표준품에 대한 검량선은 10, 50, 100 및 500 ng/mL의 농도로 작성하였으며, 작성된 검량선의 직선성은 상관계수(r2)를 구하여 판단하였다. 검출한계와 정량한계는 신호 대 잡음 비인 3과 10으로 계산하였다.

Table III.Mass detection condition of marker compounds

 

결과 및 고찰

LC-MS/MS 분석조건 확립 − 香正氣散의 구성 생약의 주요 성분인 rosmarinic acid(Agastachis Herba), luteolin(Perillae Folium), imperatorin(Angelicae Dahuricae Radix), (+)-catechin과 (-)-epicatechin(Arecae Pericarpium), pachymic acid(Poria), honokiol과 magnolol(Magnoliae Cortex), atractylenolide Ⅰ, atractylenolie Ⅱ 및 atractylenolide Ⅲ (Atractylodis Rhizoma Alba), hesperidin(Citri Unshius Pericarpium), homogentisic acid와 3,4-dihydroxybenzaldehyde(Pinelliae Tuber), platycodin D와 platycodin D2(Platycodonis Radix), liquiritin, liquiritigenin 및 glycyrrhizin(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma), 6-gingerol(Zingiberis Rhizoma Crudus) 및 spinosin(Zizyphi Fructus) 등 21종에 대하여 LC-MS/MS를 이용하여 선택성과 감도가 우수한 MRM 방법으로 함량분석을 실시하였다. ACQUITY TQD LC-MS/MS를 이용하여 ESI 방법의 MRM모드를 이용하여 물(A)과 아세토나이트릴(B)의 이동상으로 성분의 분리 및 검출을 실시하였다. 또한 꼬리 끌림 현상을 줄이고 MS 검출 시 이온의 검출 감도를 높이고자 이동상 A에 0.1%(v/v) 개미산을 추가하여 분석을 실시하였다. 이러한 조건을 토대로 주요 성분에 대한 분석을 실시한 결과 복령의 주요 성분인 pachymic acid는 UPLC와 양이온 및 음이온 모드의 MS에서 모두 검출이 되지 않아 본 정량법 설정에서 제외하였다. Pachymic acid를 제외한 20종의 성분은 양이온 모드에서 11종 및 음이온 모드에서 9종이 10분 이내로 양호하게 분리 및 검출되었다(Table III 및 Fig. 2). MS 분석 결과 물질 2, 3, 5, 7, 9, 10, 1416, 18 및 20이 [M+H]+ 형태로 m/z 291.3, 291.3, 609.5, 611.5, 257.2, 287.2, 295.3, 249.3, 271.2, 233.3 및 231.2에서 분자이온 피크를 확인하였으며, 물질 1, 4, 6, 8, 1113, 17및 19는 m/z 167.0, 137.0, 417.4, 359.3, 1386.4, 1224.3, 821.9, 265.3 및 265.3에서 [MH] 형태의 분자이온 피크를 각각 확인하였다(Table III).

Fig. 2.Chromatogram of reference compounds 1–20(A) and Gwakhyangjeonggi-san extract(B) by LC-MS/MS MRM mode. Homogentisic acid(1), (+)-catechin(2), (-)-epicatechin(3), 3,4-dihydroxybenzaldehyde(4), spinosin(5), liquiritin(6), hesperidin(7), rosmarinic acid(8), liquiritigenin(9), luteolin(10), platycodin D2(11), platycodin D(12), glycyrrhizin(13), 6-gingerol(14), atractylenolide Ⅲ(15), imperatorin(16), honokiol(17), atractylenolide Ⅱ(18), magnolol(19), and atractylenolide Ⅰ(20).

검량선 − LC-MS/MS를 이용하여 ESI 방법의 MRM 방식에서 20종 성분의 농도에 따른 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성한 결과 상관 계수(r2) 값이 0.9950 이상으로 양호한 직선성을 나타내었다(Table IV). 또한 검출한계와 정량한계는 0.01-2.79 ng/mL와 0.03-8.37 ng/mL의 범위로 각각 나타났다(Table IV).

藿香正氣散 중 주요성분의 함량분석 −藿香正氣散 추출물을 확립된LC-MS/MS 분석법을 이용하여 20종의 성분에 대한 토탈이온크로마토그램(total ion chromatogram; TIC)으로 특정 분자량에 대한 크로마토그램을 추출하여 지표물질에 대한 함량 분석을 실시하였다. Table III과 Fig. 2에서 보듯이 이들 20종의 성분들은 모두 10분 이내에 분리 및 검출되었다. LC-MS/MS에서 정량분석을 위한 성분 1의 MRM 조건은 m/z 167.0(precursor ion)에서 COO−가 떨어진 [MCOO−-H] 형태의 m/z 123.0(product ion),13) 성분 2와 3은m/z 291.3(precursor ion)에서 [M-C8H8O3+H]+ 형태의 m/z 139.0(product ion),14,15) 성분 4는 m/z 137.0(precursor ion)에서 aldehyde기가 떨어져 나간 [M-COH−-H]− 형태의 m/z 108.0(product ion),16) 성분 5는 m/z 609.5(precursor ion)에서 [M-Glu-C4H6O4+H]+ 형태의 m/z 327.2(product ion),17) 성분 6은 m/z 417.4(precursor ion)에서 glucose가 떨어진 [M-Glu-H]− 형태의 m/z 255.2(product ion),18) 성분 7은 m/z 611.5(precursor ion)에서 rhamnose와 glucose가 떨어진 [M-Rham-Glu+H]+ 형태의 m/z 303.2(product ion),19) 성분 8은 m/z 359.3(precursor ion)에서 [M-C9H9O5-H]− 형태의 m/z 161.0(product ion),20) 성분 9는 m/z 257.2(precursor ion)에서 [M-C8H8O8+H]+ 형태의 m/z 137.0(product ion),18) 성분 10은 m/z 287.2(precursor ion)에서 [MC8H6O2+H]+ 형태의 m/z 153.0(product ion),21) 성분 11과 12는 precursor ion이 각각 m/z 1386.4와 1224.3에서 product ion이 m/z 843.6과 469.4,22) 성분 13은 m/z 821.9(precursor ion)에서 glucose 2 분자가 떨어진 [M-2Glu-H]− 형태의 m/z 351.2(product ion),23) 성분 14는 m/z 295.3(precursor ion)에서 [M-C6H12O2+H]+ 형태의 m/z 177.1(product ion),23) 성분 15는 m/z 249.3(precursor ion)에서 1개의 물 분자가 떨어진 [M-H2O]+ 형태의 m/z 231.2(product ion),24) 성분 16은 m/z 271.2(precursor ion)에서 [M-C5H9+H]+ 형태의 m/z 203.0(product ion),25) 성분 17은 m/z 265.3(precursor ion)에서 [M-C3H5-H]− 형태의 m/z 224.2(product ion),26) 성분 18은 m/z 233.3(precursor ion)에서 1개의 물 분자와 CO가 떨어진 [M-H2O-CO+H]+ 형태의 m/z 187.1(product ion),24) 성분 19는 m/z 265.3(precursor ion)에서 물 분자 1개가 떨어진 [M-H2O-H]− 형태의 m/z 247.2(product ion)26) 및 성분 20은 m/z 231.2(precursor ion)에서 1개의 물 분자와 CO가 떨어진 [M-H2O-CO+H]+ 형태의 m/z 185.1(product ion)24)로 설정한 후 정량을 실시하였다. 함량 분석 결과 藿香正氣散 추출물 중 spinosin(5)은 검출되지 않았으며, 이를 제외한 19종의 성분은 1.25-3,267.67 μg/으로 검출이 되었다(Table V).

Table IV.Linearities, regression equation, correlation coefficients, LOD, and LOQ for 20 marker compounds

Table V.Amount of the 20 marker compounds in Gwakhyangjeonggi-san

 

결 론

藿香正氣散의 주요 성분인 homogentisic acid(1), (+)-catechin(2), (-)-epicatechin(3), 3,4-dihydroxybenzaldehyde(4), spinosin(5), liquiritin(6), hesperidin(7), rosmarinic acid(8), liquiritigenin(9), luteolin(10), platycodin D2(11), platycodin D(12), glycyrrhizin(13), 6-gingerol(14), atractylenolide Ⅲ (15), imperatorin(16), honokiol(17), atractylenolide Ⅱ(18), magnolol(19) 및 atractylenolide Ⅰ(20) 등 20종에 대하여 LCMS/MS를 이용한 함량분석을 실시하였다. 분석 결과 감초의 주요 성분인 liquiritin과 glycyrrhizin 및 진피의 hesperidin 함량이 1,058.17±24.29, 1467.83±23.63 및 3236.67±52.25 μg/g으로 다른 성분에 비해 많이 함유되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 藿香正氣散 또는 이와 관련된 한약제제의 품질관리를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

참고문헌

  1. Koo, C. M., Sun, J. K., Kim, H. H. and Nam, C. G. (2003) Effect of GwakHyangJungGiSan on the arterial contraction in rabbit. Korean J. Orient. Int. Med. 24: 260-268.
  2. Yun, H. S., Ryu, B. H., Park, D. W. and Ryu, K. W. (1998) Experimental comparative studies on the effects of Kwakhyangjeonggisan and Souminkwakhyang-jeonggisan. K. H. Univ. O. Med. J. 1: 197-211.
  3. Park, S., Ahn, S. and Lee, S. (2007) Heo jun's traditional tales connected with Gwakhyangjeonggisan. Korean J Orient. Med. 13: 69-75.
  4. Lu, Y., Li, D. and Tang, F. (2011) Mechanism of huoxiang zhengqi extract for regulating the intestinal motility in rat model of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi 31: 941-945.
  5. Kim, S. Y. and Lee, W. C. (2001) The effects of Sunghyangjunggi-san and Gwackhyangjunggi-san extracts on cerebral ischemia following the MCA occlusion in rat. J. Korean Oriental Med. 22: 142-150.
  6. Woo, S. K., Leem, J. T., Park, S. K., Kwak, S. H., Jung, W. S., Moon, S. K., Cho, K. H., Park, S. W. and Ko, C. N. (2010) Study on characteristics of acute stroke patient with Gwakhyangjeonggisan. Korean J. Joongpoong 11: 26-35.
  7. Han, J. H., Kim, G. B., Han, I. S., Shim, Y. S. and Kim, E. G. (2005) A clinical report of chronic diarrhea treated with Gwakhyang-junggisan. Korean J. Orient. Int. Med. 26: 889-896.
  8. Na, W. K., Han, K. H., Lee, H. J. and Park, E. J. (2004) A case report of epileptic children. J. Korean. Orient. Pediatrics 28: 131-138.
  9. Kim, S. M., Ha, K. S., Ha, S. Y., Kim, H. Y., Song, I. S., Park, S. K. and Chun, S. C. (2006) Three cases report of molluscum contagiosum children treated by Gwakhyangjeonggisangamibang. J. Korean Oriental Pediatrics 20: 11-22.
  10. Wang, X. Y., Chen, X., Quan, H. and Bai, X. H. (2008) Determination of magnolol and honokiol in traditional Chinese medicine Magnolia officinalis and its preparations by liquid-phase microextraction-back extraction combined with high performance liquid chromatography. J. Chinese Pharm. Sci. 17: 163-166.
  11. Han, P., Luan, F., Yan, X., Gao, Y. and Liu, H. (2012) Separation and determination of honokiol and magnolol in Chinese traditional medicines by capillary electrophoresis with the application of response surface methodology and radial basis function neural network. J. Chromatogr. Sci. 50: 71-75. https://doi.org/10.1093/chromsci/bmr010
  12. Li, K., Yuan, J. and Su, W. (2006) Determination of liquiritin, naringin, hesperidin, thymol, imperatorin, honokiol, isoimperatorin, and magnolol in the traditional Chinese medicinal preparation Huoxiang-zhengqi liquid using highperformance liquid chromatography. Yakugaku Zasshi 126: 1185-1190. https://doi.org/10.1248/yakushi.126.1185
  13. Elgstoen, K. B., Zhao, J. Y., Anacleto, J. F. and Jellum, E. (2001) Potential of capillary electrophoresis, tandem mass spectrometry and coupled capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry as diagnostic tools. J. Chroamtogr. A 914: 265-275. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(00)01117-1
  14. Benavides, A., Montoro, P., Bassarello, C., Piacente, S. and Pizza, C. (2006) Catechin derivatives in Jatropha macrantha stems: characterization and LC/ESI/MS/MS quali-quantitative analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 40: 639-647. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2005.10.004
  15. Mulder TP, van Platerink CJ, Wijnand Schuyl PJ, van Amelsvoort JM. (2001) Analysis of theaflavins in biological fluids using liquid chromatography-electrospray mass spectrometry. J. Chromatogr. B 760: 271-279. https://doi.org/10.1016/S0378-4347(01)00285-7
  16. Li, Y., Qu, H. and Cheng, Y. (2008) Identification of major constituents in the traditional Chinese medicine "QI-SHENYI-QI" dropping pill by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 47: 407-412. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2007.12.037
  17. Ren, Y., Wang, P., Wu, C., Zhang, J. and Niu, C. (2013) Identification of the metabolites after oral administration of extract of Ziziphi Spinosae Semen to rats or dogs by highperformance liquid chromatography/linear ion trap FTICR hybrid mass spectrometry. Biomed. Chromatogr. 27: 17-26. https://doi.org/10.1002/bmc.2742
  18. Wang, Y., Yang, L., He, Y. Q., Wang, C. H., Welbeck, E. W., Bligh, S. W. and Wang, Z. T. (2008) Characterization of fiftyone flavonoids in a Chinese herbal prescription Longdan Xiegan Decoction by high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry and photodiode array detection. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22: 1767-1778. https://doi.org/10.1002/rcm.3536
  19. Zhou, D., Xu, Q., Xue, X., Zhang, F. and Liang, X. (2006) Identification of O-diglycosyl flavanones in Fructus Aurantii by liquid chromatography with electrospray ionization and collision-induced dissociation mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 42: 441-448. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2006.05.015
  20. Mitra, M., Nasrolah, G., Ebrahim, S., Alireza, G. and Mohammadreza, S. A. (2005) Main phenolic compound of petals of Echium amoenum Fisch. And C. A. Mey., a famous medicinal plant of Iran. Daru 13: 65-69.
  21. Fabre, N., Rustan, I., de Goffmann, E. Quetin-Leclercg, J. (2001) Determination of flavone, flavonol, and flavanone aglycones by negative ion liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12: 707-715. https://doi.org/10.1016/S1044-0305(01)00226-4
  22. Na, Y. C., Ha, Y. W., Kim, Y. S. and Kim, K. J. (2008) Structural analysis of platycosides in Platycodi Radix by liquid chromatography/electrospray ionization-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 1189: 467-475. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2007.11.085
  23. Tan, G., Zhu, Z., Jing, J., Lv, L., Lou, Z., Zhang, G. and Chai, Y. (2005) Characterization of constituents in Sini decoction and rat plasma by high-performance liquid chromatography with diode array detection coupled to time-of-flight mass spectrometry. Biomed. Chromatogr. 25: 913-924.
  24. Chen, L., Qi, J., Chang, Y., Zhu, D. and Yu, B. (2009) Identification and determination of the major constituents in Traditional Chinese Medicinal formula Danggui-Shaoyao-San by HPLC-DAD-ESI-MS/MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 50: 127-137. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2009.03.039
  25. Yang, W., Ye, M., Liu, M., Kong, D., Shi, R., Shi, X., Zhang, K., Wang, Q. and Lantong, Z. (2010) A practical strategy for the characterization of coumarins in Radix Glehniae by liquid chromatography coupled with triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry. J. Chromatogr. A 1217: 4587-4600. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2010.04.076
  26. Yu, Q., Xiang, J., Tang, W. F., Liang, M. Z., Qin, Y. P. and Nan, F. (2009) Simulataneous determination of the 10 major components of Da-Cheng-Qi decoction in dog plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B 877: 2025-2031. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2009.05.030