Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)법을 이용한 Streptococcus parauberis 의 신속 진단

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) for Detection of Streptococcus parauberis

Abstract

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)법은 등온에서 DNA 주형을 변성시키지 않고 실시하기 때문에, autocycling 가닥 변위 DNA 합성에 의존한다. 그래서 고가의 PCR 장비를 필요로 하지 않고 등온 유지가 가능한 저가의 장비인 항온 수조, 오븐, 온장고 등에서 증폭이 가능하다. 본 연구진은 Streptococcus parauberis의 random primer중에서 5개를 선정하여, 신장도가 높은 2개의 primer를 이용하여 최적 반응온도 및 최적 반응시간, 최적 반응 조건들을 확립하였다. 그리고 기존의 PCR과 LAMP의 민감도의 비교 분석을 측정한 결과, LAMP의 높은 검출 한계를 확인할 수 있었다. 본 논문에서는 non-target DNA의 영향을 받지 않고 등온 조건 하에서 DNA를 증폭시킬 수 있는 LAMP법과 SYBR-green I를 이용하여 시각화시켰으며, 기존의 PCR과 비교 분석함으로써, S. parauberis에 대한 신속하고 정확한 진단법을 확립하였다.

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique relies on autocycling strand displacement DNA sysnthesis without template denaturation steps under isothermal conditions. LAMP has more advantages than modern PCR, as it requires only basic laboratory equipment like an isothermal water bath, oven, and heating cabinet. Hence, in this study, five random primers were designed with Streptococcus parauberis, shikimate kinase Arok gene sequences (Genbank accession number: CP0024711). Two primers were selected based on the ladder pattern. Other optimum reaction conditions like temperature, time, and sensitivity were established and confirmed with conventional SYBR-green PCR. Results confirmed that the designed random primers were species specific, without any non-target DNA amplification under isothermal conditions. Hence, this study suggests that LAMP techniques could be used in the diagnosis of fish pathogen, specifically S. parauberis.

서 론

연쇄구균증은 1958년에 일본 무지개 송어(Oncorhynchus mykiss)에서 처음으로 발견되었으며[5], 넙치(Paralichthys olivaceus)에서 발병하는 연쇄상구균증은 최근 Streptococcus iniae보다 Streptococcus parauberis의 감염 빈도가 증가하였다[2]. S. parauberis에 감염된 어류의 증상으로는 체색흑화, 안구 출혈 및 돌출, 비장 및 간 비대, 복부와 복벽의 점상출혈 등이 나타난다[3]. 양식어민들이 감염어를 진단하기에는 생물학적인 지식이 부족하여 육안 진단법에 의존하고 있다[4]. 그러므로 우리는 연쇄상구균증을 진단하는데 있어 양식 어민들이 쉽게 활용할 수 있도록 LAMP를 접목시키고자 한다.

Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)은 감수성 및 특이성을 갖춘 분자 진단학적 기술로서, DNA polymerase 6개 영역을 인식하도록 특별하게 제작된 4개의 primer를 사용한다[8]. 이는 별도로 온도 구배를 두지 않고도 주형 DNA를 증폭하기 때문에 고가의 PCR 장비를 필요로 하지 않으며, PCR 증폭법보다 신속하게 처리할 수 있으며 장소 구애를 받지 않고 어류질병의 병원체에 대한 진단이 가능한 장점을 지니고 있다. 따라서 본 논문에서는 LAMP 법을 SYBR-green I을 이용하여 시각화시켰으며, 기존의 PCR과 LAMP 법을 비교분석하여 S. parauberis에 대한 신속하고 정확한 진단법을 확립하고자 한다.

 

재료 및 방법

시험균주

실험에 사용한 표준 균주 Streptococcus parauberis KCTC 3651은 미생물자원센터 KCTC (Korean Collection for Type Culture)에서 분양 받았다. 시험 균주는 1.5% NaCl이 첨가 된 Brain Heart Infusion Broth (BHIB, Difco., USA)에 계대하여 25℃에서 24시간동안 배양하였다.

DNA 추출

S. parauberis의 DNA는 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer., Korea)를 사용하여 추출하였다. 1.5% NaCl-BHIB를 이용하여 배양조건에 따라 24시간 배양한 뒤, 1.5 ml e-tube에 배양액 500 μl를 옮겨 담은 후 14240× g, 5분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전된 균체를 사용하여 DNA를 추출하였다.

Lysozyme 20 μl (10 mg/ml)를 첨가한 후 37℃ 에서 1시간, 80℃에서 10분간 반응시켰으며, Tissue Lysis buffer (TL) 200 μl와 Proteinase K 20 μl를 넣고 votexing 하여, 60℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후, spin down하여 GC (Binding buffer) 200 μl를 넣고 60℃에서 10분 동안 반응 시켰다. Isopropanol 100 μl를 첨가한 후 Binding column tube (2 ml tube)에 옮기고 9490× g, 1분간 원심분리한 다음 Binding column을 새로운 Binding column tube (2 ml tube)로 옮겨 Washing buffer 1 (W1) 500 μl를 첨가하고 9490× g, 1분간 원심분리 하고 Washing buffer 2 (W2) 500 μl를 첨가한 후, 9490× g, 1분간 원심분리하였다. 완전한 washing을 위해 14240× g, 1분간 원심분리한 후 Binding column을 Binding column tube (1.5 ml tube)에 옮긴 후 Elution buffer (EL) 200 μl를 첨가한 후, 상온에서 1분간 반응 시키고 9490× g, 1분간 원심분리하였다 (Bioneer., Korea). 분리한 DNA는 -20℃에 저장 후 실험에 사용하였다.

LAMP primer 제작

분석을 위해 S. parauberis의 LAMP DNA oligonucleotide primer의 sigma 인자를 BLAST program [1]으로 species-specific gene sequences shikimate kinase AroK (GenBank accession number: CP002471.1)을 선택하였다. 다음 sequence는 LAMP primer designing software인 Primer Explorer version 3(https://www.primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)를 이용하여 S. parauberis의 LAMP용 primer 총 5개(5, 17, 28, 54, 84)의 random primer을 선정하여 디자인 하였다[8].

Primer set은 4개의 primer로 구성된 target sequence의 6개의 특정 영역을 인지할 수 있는 두 개의 다음 inner primer (FIP: Forward inner primer, BIP: Backward inner primer)는 S. parauberis sequence의 상보적인 염기서열과 loop를 형성하는 sequence의 부분 TTTT spacer로 합하여 제작하였다[8]. 다음 두 개의 outer primer (F3: Forward outer primer, B3: Backward outer primer)는 각각 inner primer의 바깥쪽에 위치하도록 설계하였다. 총 5개의 primer들은 Bioneer (Korea)에 주문 의뢰하여 제작하였다(Table 1).

Table 1.aFor nomenclature see Ref. 8.

LAMP 반응 확립

총 5개의 random primer의 LAMP 반응을 확인하고자 하였다. 20 pM의 F3,B3 primer와 40 pM의 FIP,BIP primer, 시약 1× reaction mix (20 mM Tris-HCI (pH 8.8), 10 mM (NH4)2SO4, 10mM KCI, 2 mM MgSO4, 0.4% Triton X-100, 6 mM MgSO4 (New England Bioabs, Beverly, MA), 0.8 M betaine (Sigma-Aldrich Corporation, USA), 400 μm dNTP (TaKaRa Biotechnology Co., Ltd)를 총 25 μl의 반응액으로 조성하였다. 다음 heat block에 반응액을 95℃에서 5분간 방치한 후, 얼음에 식혀 8 U Bst DNA polymerase large fragment (New England Bioabs, Beverly, MA, USA)를 첨가하였다. 그 후 반응액을 65℃에서 60분, 80℃에서 10분간 반응 시켰으며 [8], SYBR Green I (Life technologies, USA)을 첨가하여 시각화하였다. 이것은 amplicon 부재 시 오렌지색을 띠며, LAMP 증폭 생성물이 존재하면 녹색을 띠게 된다. 그리고 1× TAE buffer (Tris-acetate-EDTA Bioneer, korea)가 첨가 된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.

PCR primer 제작 및 PCR

PCR primer는 S. parauberis 표준균주의 AroK 유전자 서열을 이용하여 제작하였다[7](Fig. 1). PCR 수행을 위해 primer는 각각 20 pM과 AccuPower PCR premix (1 U Taq DNA polymerase, 250 μm dNTP, 10 mM Tris-HCI, 40 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, stabilizer and tracking dye : Bioneer., Korea), template genomic DNA, 총 볼륨 20 μl의 반응액을 조성하였다[7]. Initial denature (94℃에서 5분), Denature (94℃에서 30초), Annealing (50℃에서 30초), Extension (72℃에서 1분) 총 30 cycle 반응 시킨 후, Last extension (72℃에서 5분) 반응을 수행하였다[8]. 그 후, 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE buffer가 첨가 된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.

Fig. 1.Partial nucleotide sequence of Shikimate kinase AroK gene of S. parauberis (GenBank accession number CP002471.1) used for the LAMP primer design. Nucleotide sequences used for primer design are indicated by boxes and arrows[7].

LAMP법의 최적 반응 온도 확립

LAMP법을 이용한 S. parauberis의 특이적인 검출을 위해 최적 반응 온도를 확인하였다. 혼합물은 20 pM F3, B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genmic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment, 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI (pH 8.8), 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.4% Triton X-100), 400 μm dNTP, 1 M Betaine, 6 mM MgSO4, Distilled water (negative control)로 총 25 μl의 반응액을 조성하였다[7].

LAMP법은 기존의 PCR법과 달리 Bst DNA polymerase large fragment를 이용하므로 80℃ 이상의 온도에서는 불활성을 나타낸다. 따라서 heat block 95℃에서 5분간 해리 한 뒤 바로 얼음에 옮겨 식힌 후 첨가하였다[8]. 최적 온도의 확립을 위하여 DNA 변형 합성의 온도를 45℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃ 사이로 각각 등온 조건하에 실시하였으며, 증폭된 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE Buffer 가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.

LAMP법의 최적 반응 시간 확립

LAMP법을 이용한 S. parauberis의 특이적인 검출을 위해 최적 반응 시간을 확인하였다. 혼합물은 20 pM F3, B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genmic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment, 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI (pH 8.8), 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.4% Triton X-100, New England biolabs, Beverly, MA, USA), 400 μm dNTP, 1 M Betaine, 6 mM MgSO4, Distilled water (negative control)로 총 25 μl 의 반응액을 조성하였다[7].

최적 반응 시간 확립을 위해서 Bst DNA polymerase large fragment를 첨가 후, DNA 변형 합성의 시간을 0분, 20분, 40 분, 60분, 80분, 100분으로 각각 조절하였다. 증폭된 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE Buffer 가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.

LAMP법의 최적 반응 조건 확립

LAMP법을 이용한 S. parauberis의 특이적인 검출을 위해 최적 반응 조건을 확인하였다. MgSO4의 농도를 확립하기 위해 각각 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM을 첨가하여 최적 반응 조건을 확인하였고, betain은 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M 을 첨가하여 확인하였다. dNTP는 0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.8 mM, 1.0 mM으로 조성하였고, Bst DNA polymerase는 4 U, 8 U, 12 U, 16 U, 20 U을 첨가하여 최적 반응 조건을 확립하였다[7]. 증폭된 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE Buffer 가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.

LAMP법과 PCR법의 민감도 확인

S. parauberis을 1.5% NaCl-BHIB에 25℃에서 48시간 배양한 배양액을 연속적으로 희석하여 1×108 CFU/ml 의 농도로 조정하였다. 희석된 배양액으로부터 1 ml을 취하여 DNA를 분리한 후 LAMP법과 PCR법을 수행하여 검출 한계 값을 비교하였다[7].

 

결 과

LAMP 반응 확립

총 5개의 random primer의 LAMP 반응을 확인하였다. LAMP 산물이 inverthed-repeat 구조를 구성하기 때문에 전기 영동상에서 각기 다른 크기의 DNA band로 나타난다[4].

LAMP법에 의한 DNA 증폭은 PCR법에 의한 증폭 방법과 다르게 ladder pattern 으로 나타나게 된다. LAMP의 반응 확인 결과 5개(5, 17, 28, 54, 84)의 random primer 중 확연한 ladder pattern이 확인 된 두 개의 primer (28, 84)을 선택하였으며, 이들을 비교 분석 및 최적 조건 확립을 SYBR Green I 및 전기영동을 통하여 확인하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Reaction of LAMP establish of the S. parauberis. Five random primers were electrophoresed on 1.5% agarose gels and appearance of LAMP products visualized with SYBR Green I stain. A Electrophoresis results for the reaction of LAMP for detection of five random primers. B Direct visualization of aliquots containing precipitates for five random primer products. Lane M, 100 bp DNA Marker (Intron Biotechnology Inc., Korea); 1-5:5, 17, 28, 54, 84.

LAMP법의 최적 반응 온도 확립

최적 반응 온도 확립을 위해서 DNA 변형 합성의 최적 온도를 각각 45℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃에서 1시간 동안 등온 조건하에서 LAMP를 수행하였다. 그 결과, 두 개의 primer는 55℃~65℃에서 신장되었으나, primer 28이 좀 더 뚜렷하게 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3.Optimum temperature of the LAMP reaction detection of S. parauberis. (A and C) Electrophoresis results, (B and D) Direct visualization of aliquots containing precipitates. Lane 1, DNA template in the reaction, amplification at 45℃; Lane 2, amplification at 55℃; Lane 3, amplification at 60℃; Lane 4, amplification at 65℃; Lane 5, amplification at 70℃; Lane M, 100 bp DNA Marker (Intron Biotechnology Inc.).

LAMP법의 최적 반응 시간 확립

최적 반응 시간 확립을 위해서 Bst DNA polymerase large fragment를 첨가하여 반응 시켰으며, polymerization 시간을 0분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분으로 각각 조절하였다. 확인한 결과 primer 28에 비해 primer 84는 40분에서 신장이 연했으며, 결과적으로는 최소 40분 이상의 반응에서 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 4.Optimum time of the LAMP reaction detection of S. parauberis. (A and C) Electrophoresis results, (B and D) Direct visualization of aliquots containing precipitates. Lane 1, DNA template in the reaction, amplification at 0 min; Lane 2, amplification at 20 min; Lane 3, amplification at 40 min; Lane 4, amplification at 60 min; Lane 5, amplification at 80 min; Lane 6, amplification at 100 min; Lane M, 100 bp DNA Marker (Intron Biotechnology Inc.).

LAMP법의 최적 반응 조건 확립

LAMP법을 이용한 S. parauberis의 최적 반응 조건을 확립하기 위해 MgSO4, betaine, dNTP, Bst DNA polymerase의 최적 농도를 구하였다.

MgSO4 의 최적 농도를 위해서는 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM을 첨가하여 LAMP를 수행한 결과 두 개의 primer (28, 84)는 2 mM 에서 6 mM 일 때, 신장이 가장 잘 이뤄진다는 같은 결과를 나타내었다. 이는 과량의 MgSO4는 LAMP 반응을 저해한다는 것을 알 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 5.Optimum MgSO4 concentration of the LAMP reaction for detection of S. parauberis. (A and C) Electrophoresis results, (B and D) Direct visualization of aliquots containing precipitates. Lane 1, 0mM MgSO4; Lane 2, 2 mM MgSO4; Lane 3, 4 mM MgSO4; Lane 4, 6 mM MgSO4; Lane 5, 8 mM MgSO4; Lane M, 100 bp DNA Marker (Intron Biotechnology Inc.).

Betaine의 최적 농도 확립을 위해 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M 을 첨가하여 LAMP 반응을 수행하였다. betaine은 GC 영역의 이차구조의 형성을 감소시켜 DNA의 증폭을 향상시켜주며, DNA의 녹는점인 염기 쌍 조성의 의존성을 제거시켜 중합효소 연쇄반응의 특이성을 개선해주는 것이다. 하지만 primer 28과 primer 84는 betaine을 첨가하지 않아도 DNA가 증폭되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 6).

Fig. 6.Optimum betaine concentrations of the LAMP reaction detection of S. parauberis. (A and C) Electrophoresis results, (B and D) Direct visualization of aliquots containing precipitates. Lane 1, 0 mM betaine; Lane 2, 0.2 mM betaine; Lane 3, 0.4 mM betaine; Lane 4, 0.6 mM betaine; Lane 5, 0.8 mM betaine; Lane 6, 1.0 mM betaine; Lane M, 100 bp DNA Marker (Intron Biotechnology Inc.).

dNTP의 최적 농도를 확립하기 위하여 각 반응액에 0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.8 mM, 1.0 mM으로 첨가하여 LAMP 반응을 수행하였다. 그 결과 두 개의 primer (28, 84)는 0.2 mM에서 0.8 mM 일 때, DNA 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인 할 수 있었으며, 첨가하지 않거나 다량의 dNTP 사용은 오히려 저해된다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7).

Fig. 7.Optimum deoxynucleotide triphosphate (dNTP) concentration of the LAMP reaction detection of S. parauberis. (A and C) Electrophoresis results, (B and D) Direct visualization of aliquots containing precipitates. Lane 1, 0 mM dNTP; Lane 2, 0.2 mM dNTP; Lane 3, 0.4 mM dNTP; Lane 4, 0.6 mM dNTP; Lane 5, 0.8 mM dNTP; Lane 6, 1.0 mM dNTP; Lane M, 100 bp DNA Marker (Intron Biotechnology Inc.).

Bst DNA polymerase의 최적 농도 확립을 위하여 4 U, 8 U, 12 U, 16 U, 20 U을 첨가하여 LAMP을 수행하였다. 두 개의 primer (28, 84)는 다양한 ladder pattern으로 다양한 크기로 관찰 되었으며, primer 28은 대체적으로 DNA 신장이 농도별로 잘 이뤄진 반면에, primer 84는 4 U에서 조금은 연하게 신장된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 8).

Fig. 8.Optimum Bst DNA polymerase concentrations of the LAMP reaction detection of S. parauberis. (A and C) Electrophoresis results, (B and D) Direct visualization of aliquots containing precipitates. Lane 1, 4 U Bst DNA polymerase; Lane 2, 8 U Bst DNA polymerase; Lane 3, 12 U Bst DNA polymerase; Lane 4, 16 U Bst DNA polymerase; Lane 5, 20 U Bst DNA polymerase; Lane M, 100 bp DNA Marker (Intron Biotechnology Inc.).

본 실험에서 LAMP를 위한 최적 반응 조건은 총 25 μl를 기준으로 2 mM MgSO4, 0.2 mM dNTP, 8 U Bst DNA polymerase를 LAMP 표준 조건으로 결정하였다.

LAMP법과 PCR법의 민감도 확인

최적 조건을 확립 한 후, LAMP 검출법의 민감도는 S. parauberis 배양액을 단계 희석하여 1.0×101~1.0×108 CFU/ml의 농도로 조정하여 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer., Korea)을 사용하여 DNA 추출 후 LAMP 검출법과 PCR법의 검출 한계 값을 비교 하였다.

PCR의 경우에는 1.0×104 CFU/ml 농도까지만 검출 할 수 있는 반면에, LAMP의 검출 한계를 측정한 결과, 1.0×108 CFU/ml의 농도까지 검출 할 수 있는 것으로 확인되었다(Fig. 9). 이는 LAMP법은 일반 PCR법에 비해 보다 높은 검출 한계를 갖고 있는 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 9.Sensitivity of S. parauberis identification by LAMP and conventional PCR. (A and C, E) Electrophoresis results, (B and D, F) Direct visualization of aliquots containing precipitates. Lane 1-8, amplification products using 10-fold serial dilutions of template DNA, which extracted variation of cell concentrations (1.0× 101 CFU/ml, 1.0×102 CFU/ml, 1.0×103 CFU/ml, 1.0×104 CFU/ml, 1.0×105 CFU/ml, 1.0×106 CFU/ml, 1.0×107 CFU/ml, 1.0×108 CFU/ml); Lane M 100 bp DNA Marker (Intron Biotechnology Inc.).

 

고 찰

등온증폭법은 기존의 PCR에서 사용되는 Taq DNA polypolymerase와는 다르게 Bst DNA polymerase를 사용하며, auto-cycling DNA 합성에 의존한다[7]. 본 연구에서는 S. parauberis의 LAMP용 primer 총 5개(5, 17, 28, 54, 84) 중 DNA의 신장이 높은 random primer (28, 84)를 선정하여 비교 및 분석하였다. LAMP 최적 온도는 55℃~65℃로써 너무 낮거나 높은 온도에서는 신장되지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 최적 반응 시간 확립은 최소 40분부터 신장되었으며, 너무 짧은 시간에서는 증폭되지 않은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). MgSO4는 2 mM~6 mM로 과량으로 첨가될 시, 신장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5. dNTP, betaine 및 LAMP와 PCR법의 민감도 확인에서는 이전에 보고 되어진 Kim [7]과 다른 결과 값을 나타내었다. Kim [7]은 dNTP의 농도가 0.4 mM~1.0 mM 로 소량일 경우 신장을 저해한다고 했으나, 본 연구에서는 0.2 mM~0.8 mM 로 오히려 다량의 dNTP는 신장을 저해한다는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 7). Betaine은 base stacking 을 낮춰, 전체 반응 속도를 활성 시키지 않아 target과 관련이 없는 sequences의 증폭을 막아주기 때문에[8], 수월하게 DNA의 증폭을 도와주는 역할을 한다. Kim [7]은 betaine없이는 LAMP 증폭이 불가능 하다고 하였으나, 본 연구에서는 random primer (28, 84)를 첨가하지 않은 상태에서도 증폭이 가능하였다(Fig. 6). LAMP법과 PCR법의 민감도 확인은 배양액을 단계 희석하여 1.0×101~1.0×108 CFU/ml의 농도로 조정하여 측정하였다. Kim [7]은 1.0×106 CFU/ml 의 검출한계를 갖는 반면에, 본 연구 결과에서는 1.0×108 CFU/ml의 높은 검출 한계를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 기존의 PCR 방법은 1.0×104 CFU/ml 의 검출 한계를 갖는 것으로 LAMP법 이 더 민감하고 특이성이 높다고 확인할 수 있었다(Fig. 7). Bst DNA polymerase는 80℃ 이상에서는 불활성 되기 때문에, 반응액을 얼음에 냉각한 후에 첨가시킨다. Primer 28, 84는 전체적으로 증폭이 잘 되었으나, primer 28이 좀 더 진하게 증폭된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 8).

최종적으로 최적 반응 온도 60℃, 반응 시간 60분, 4 mM MgSO4, 0.2 mM dNTP, 8 U Bst polymerase 을 최적 조건으로 결정하였다. 본 연구에서 개발한 LAMP 검출법은 다른 분자생물학적 검출법보다 민감하고 특이성이 높으며, 실용적인 진단법으로서 가치가 있다고 사료된다.