Analysis of Single Nucleotide Polymorphism of eNOS Genes in Korean Genome

한국인의 eNOS 유전자 SNP 분석

Abstract

We identified SNPs (single nucleotide polymorphisms) for endothelial nitric oxide synthase (eNOS) genes in the Korean genome. eNOS is present in the vascular endothelium, platelets, and several other cell types that continuously produce modest amounts of NO. Endothelium-derived NO plays a key role in the regulation of vascular tone, and the impaired effects of NO on the cardiovascular system appear to be responsible for coronary atherosclerosis and thrombosis. In recent studies, a missense variant within exon 7 of the eNOS gene in patients with coronary spastic angina-GAG to GAT substitution, which results in the replacement of glutamic acid by aspartic acid (Glu298Asp [G894T])-has been identified and is known to be significantly associated with coronary spasm. We prepared PCR primers based on sequences in Genbank. Primers were prepared for normal and SNPs separately, as reported for other Asian countries, such as G894T. Their sequences were different only at the 3' ends so that primer extension could only by possible when base pairs between templates and primers matched. We also employed ARMS (Amplification Refractory Mutation System) technology to improve the specificity of the PCR reaction. In conclusion, we were able to demonstrate the eNOS G894A polymorphism in Korean gemone. This study should facilitate research on the cause of myocardial infarction and development on further therapy at the genetic level.

본 연구에서는 eNOS 유전자에 대한 한국인 특이적 SNP를 확인하고자 하였다. eNOS (endothelial nitric oxide synthase)는 내피세포에서 발현되는 산화질소(nitric oxide, NO)를 합성하는 유전자로 관동맥 연축 및 혈압에 영향을 미친다. 이 유전자는 발현이 항상 일정한 constitutivegene으로 7번 염색체에 위치한다. 최근 연구 보고에 따르면 exon 7에 해당하는 894번째 염기 변이[G894T (Glu298Asp)]의 다형성이 심근경색 및 관상동맥 경련의 발병원에 기여하는 유전적 요소일 가능성으로 제시되었다. SNP가 모든 환자에게서 직접적으로 질환의 원인은 아닐지라도 일부 환자에게서는 상당한 연관성이 있다고 보여지고, 인종 간에도 차이가 있기 때문에 인종별로 이를 정확히 분석하는 것이 유전자 진단에 핵심이 될 것으로 생각된다. eNOS 유전자에서 다형성 부분에 해당하는 sense primer와 antisense primer를 고안, 제작하였으며, ARMS 기법에 기초한 방법으로 allele 특이적인 산물이 생성될 수 있게 하였다. eNOS의 G894T는 wild type (W/W)이 95명, heterozygote type (W/S)이 9명 확인되었다. SNP homozygote type (S/S)은 나타나지 않았다. 환자에서는 W/W 19명, W/S 1명으로 역시 S/S은 나타나지 않았다. 본 연구를 통해 eNOS에 대한 한국인 특이적 다형성의 확인과 진단이 보다 신속 정확하게 이루어질 수 있는 기반이 마련될 것으로 기대된다.

서 론

산화질소(nitric oxide, NO)는 혈관의 긴장도를 조절하는 인자로서 말초저항과 혈압조절에 중요한 역할을 한다[11]. 산화 질소를 만드는 nitric oxide synthase (NOS)에는 neuronal NOS, monocyte-macrophage NOS, endothelial NOS (eNOS) 등 세 종류가 있다[1, 7, 10]. eNOS는 내피세포에서 발현되는 산화질소를 합성하는 유전자로 역시 관동맥 연축 및 혈압에 영향을 미친다고 보고되어 있다[1, 12]. 이 유전자는 발현 정도가 항상 일정한 구조성의 유전자(constitutive gene)로 밝혀져 있다. eNOS 유전자는 7번 염색체에 위치하는데 exon 7에 해당하는 894번째 염기 변이(G894T (Glu298Asp))가 심근경색 및 관상동맥 경련의 발병원일 가능성이 제시되었다[11]. 이러한 변이는 모두 단일염기변이로 인해서 본래의 아미노산 대신 다른 아미노산을 지정하는 미스센스 돌연변이(missense mutation)를 유발한다.

인간게놈 프로젝트 이후 SNP (single nucleotide polymorphism) 연구가 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있다. SNP가 모든 환자에서 직접적인 병인은 아닐지라도 일부 환자에게서는 상당한 연관성이 있다고 보여지기 때문이다. 게다가 SNP는 인종간에도 차이를 보이기 때문에 각 인종별로 이를 정확히 분석하는 것이 유전자 진단에 핵심요소이다

본 연구에서는 현재 Genbank에 보고된 SNP를 토대로 하여 한국인 특이적 유전자의 다형성을 확인하고자 하였다. SNP 확인을 위해 이용된 PCR (polymerase chain reaction)방법은 ARMS (Amplification Refractory Mutation System)기법이다. 원리는 primer의 3'-end가 주형 DNA의 염기서열과 불일치 (mismatch)되면 PCR 반응시 primer 연장이 일어나지 않는 것을 이용한 것이다[9]. 일단 적당한 primer를 디자인하고 PCR 반응조건이 확립되면 PCR에 이은 전기영동으로 결과를 빠르게 알아낼 수 있는 편리성이 있다[8]. 본 연구를 통해 eNOS에 대한 보다 많은 분석이 이루어지면 한국인만의 특이적 다형성을 확인할 수 있고, 맞춤형 질병 진단에 대해 폭 넒은 유전자 차원에서의 이해가 도모될 수 있을 것으로 기대된다.

 

재료 및 방법

혈액 채취

임상적으로 정상인 20대, 104명에게 실험의 내용과 목적에 대하여 설명한 다음 동의서를 받고 사혈침을 이용하여 손가락 끝에서 소량의 혈액을 채취하여 실험에 사용하였다. 또한 경북대학교 의료원에서 대사성 질환으로 판정받은 환자 20명의 혈액에서 채취한 DNA를 제공 받아 실험에 사용하였다. 환자의 동의서는 시료를 제공한 병원의 IRB (Institutional Review Board)에서 관리하기로 하였다.

시약 및 기기

Tris-HCl, agarose, boric acid, EDTA, ethidium bromide 등은 Sigma Co (USA)의 제품을 사용하였다. dNTP, 100 bp ladder size maker, Taq DNA polymerase 등은 Solgent (Korea)의 제품을, QIAamp DNA Blood Mini kit은 QIAGEN (Germany)의 제품을, 사진기는 Olympus (Japan)의 제품을, agarose gel용 전기영동장치는 Mupid (Japan)의 제품을, 자외선조사기는 Vilber (France)의 제품을, 원심분리기는 Hanil(Korea)의 제품을, PCR 기계는 TaKaRa (Japan)의 gradient PCR 기기를 각각 사용하였다. Eppendrof tube (1.5 ml), micropipette tip 등은 일회용품을 사용하였고, deionised water 와 재활용 초자기구들은 121℃에서 30분간 고압증기 멸균하여 사용하였다. 회사로부터 구입한 kit을 사용할 경우에는 함께 제공된 용액을 이용하였다.

혈액으로부터의 DNA 분리

혈액에서 DNA를 분리하기 위해 QIAamp DNA Blood Mini kit을 사용하였다. 실험과정은 kit와 함께 제공된 안내서에 따라 실시하였다. 혈액 200 μl를 기준하여 DNA를 분리하였고, 최종적으로 분리된 DNA는 70 μl의 멸균수에 녹여 4℃ 냉장고에 보관하였다.

ARMS 기법에 기초한 primer 제작

혈액에서 분리된 genomic DNA의 PCR 분석을 위해 Genbank에 등록된 human eNOS의 SNP 염기서열을 바탕으로 primer를 제작하였다. 변이 부분에 해당하는 염기를 기준으로 sense primer를 두 개 제작하였고, antisense primer는 공통되게 하나로 제작하였다. 즉 각 유전자 별로 2 종류의 PCR (wild type, SNP type)반응이 가능하게 primer를 제작하였다. 사용된 primer의 농도는 100 pmole/μl의 농도였다. 또한 변이 염기에 해당하는 3차 끝의 염기를 다르게 하였는데 PCR 반응의 특이성을 좀 더 높이기 위해 변이 바로 앞 염기서열을 상보적으로 고안하지 않고 주형 DNA에 동일한 염기로 대체하였다. 이것으로 모두 allele 특이적인 산물이 생성될 수 있게 하였다. 이 원리는 ARMS 기법에 기초한 것으로 상세한 모식도를 Fig. 1에 나타내었다. eNOS의 allele specific primer 는 주식회사 바이오닉스(한국)에 의뢰하여 제작하였다.

Fig. 1.Principle of ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Wild type-specific primer (A) matchs wild-type template, but SNP type-specific primer (B) not match wild type template.

eNOS 유전자 SNP는 G894T (Glu298Asp)에 해당한다. G894T의 의미는 mRNA 염기서열에서 개시코돈(ATG)으로부터 개수를 헤아려 내려 온 것에 기인한다. eNOS의 894번째 고유 염기서열은 G이며 이것이 T로 변이하여 다형성이 있음을 의미한다. Sense primer의 3'-end를 각각 G와 T로 2개 제작하였고, 공통되는 antisense primer를 1개 제작하여 1쌍으로 하였다. Genbank에 등록된 eNOS의 염기서열과 primer 서열은 Fig. 2와 Table 1에 나타내었다.

Fig. 2.Sequence of the eNOS gene. Primer sequences are represented as underlined. G894T polymorphism (○) is represented as bold letters.

Table 1.List of PCR primers

PCR 조건의 확립

PCR 반응은 DNA 1 μl, 10pmole의 sense primer와 antisense primer를 각각 1 μl, 10mM의 dNTP 1 μl, 10x buffer (free MgCl2) 2 μl, Taq DNA polymerase 1 unit와 MgCl2를 2.0 mM 되게 섞어 전체 반응 부피가 20 μl가 되게 하였다. 반응 cycle은 denaturation 반응을 94℃에서 30초, annealing 반응은 gradient를 적용하여 50℃에서 65℃까지에서 30초, extension 반응을 72℃에서 30초로 모두 35회 반복하였으며, pre-denaturation을 94℃에서, post-extension을 72℃에서 각각 7분씩 추가로 처리하였다.

eNOS의 경우 annealing temperature가 64℃에서 적정되었다. PCR 조건은 Table 2에 정리하여 나타내었으며 반응이 끝난 PCR 산물은 4℃에 보관하였다.

Table 2.PCR condition of eNOS

전기영동

PCR 산물 20 μl 중 5 μl를 취하여 6x loading buffer 1 μl를 더한 다음 1.5% agaroes gel에서 전압을 16.7 V/cm로 25 분간 전기영동하였고, 자외선조사기에서 원하는 크기의 band가 증폭되었는지 확인한 다음 사진촬영 하여 보관하였다.

 

결 과

전기영동하여 나타난 결과에서 eNOS의 변이 G894T는 정상과 환자 모두에서 wild type과 heterozygote type이 각각 관찰되었다. SNP homozygote type은 전혀 나타나지 않았다. 즉 임상적 정상인에서 wild type이 95명, heterozygote type은 9명 확인되었으며, SNP homozygote type은 나타나지 않았다. 환자에서는 wild type이 19명, heterozygote type이 1명으로 관찰되었다. 역시 SNP homozygote type은 나타나지 않았다. 전기영동 사진과 결과는 Fig. 3와 Fig. 4에 나타내었다.

Fig. 3.Electrophoresis of eNOS polymorphism (G894T). Results of control (A) and patient (B) show W/W type and W/S type. M, 100bp ladder; W, wild type; S, SNP type

Fig. 4.Distribution chart of eNOS polymorphism (G894T). A: distribution of control group, B: distribution of patient group

 

고 찰

eNOS는 혈관의 긴장도를 조절하는 인자(endothelium-dependent reaxing factor, EDRF)로 알려진 NO의 합성유전자이다[1]. NO는 혈관의 말초저항과 혈압조절에 중요한 역할을 하고 있으며 eNOS는 관동맥 연축(coronary artery spasm) 및 혈압에 영향을 미친다고 보고되어 있다[11]. 관동맥 연축은 가역적인 관동맥 내경의 국소적 협착으로 그 내경이 좁아지는 역동적인 기전에 의해 심근허혈을 초래하는 현상으로 전형적인 이형협심증(variant angina)뿐만 아니라 운동성 또는 안정형 협심증이 불안정형 협심증으로 전환되는 기전이나 급성 심근경색증의 발생기전에 중요한 역할을 한다[2, 6, 10]. eNOS 유전자는 7번 염색체에 위치하는데 최근 연구보고에서 exon 7에 해당하는 894번째 염기 변이 G894T의 빈발성이 심근경색 및 관상동맥 경련의 발병원에 기여하는 유전적 요소일 가능성이 제시되었다[1, 11]. 또한 이들 염기의 변이는 당뇨병, 고혈압, 흡연, 고콜레스테롤, 과체중과 함께 심근경색의 위험성을 시사한다고 알려져 있다[4, 5].

인간 게놈 프로젝트 이후 SNP 연구가 각 국가별로 박차를 가하고 있다. 최근 SNP 연구보고에 의하면 동일 유전자라고 하더라도 인종이나 민족별로 특이적 변이가 있을 수 있다는 것이 알려지게 되었고[3], 그에 따른 변이 발굴 연구가 활발하게 진행되고 있다. SNP가 모든 환자에게서 직접적으로 질환의 원인은 아닐지라도 일부 환자에게서는 상당한 연관성이 있다고 보여지기 때문이다. 게다가 SNP는 인종 간에도 차이가 있기 때문에 각 인종별로 이를 정확히 분석하는 것이 유전자 진단에 필수적이라 할 수 있다.

본 연구에서는 eNOS의 알려진 변이부분을 한국인 게놈에서 검색하여 이들 변이가 한국인에도 특이적으로 나타나는지 만약 나타난다면 그 빈도가 어느 정도인지를 알아보고자 하였다. eNOS의 변이부분, G894T는 Genbank 보고에 기준하여 선택하였다[1, 11]. 실험 결과 eNOS에서 정상인과 환자에게서 wild type과 heterozygote type이 나타났으며 SNP type은 나타나지 않았다. 그 비율은 정상인에게서 wild type이 91%, heterozygote type이 9%, 환자의 경우 wild type이 95%, heterozygote type 5%로 나타났다. 실험 결과는 Table 3에 정리하였다.

Table 3.The results of eNOS polymorphism (G894T) in Koreans

본 연구 결과 유전자의 변이가 직접적인 발병의 원인을 나타내지는 않지만 다른 아시아 인종과 비교하였을 때 한국인에서 다르게 변이율이 관찰됨에 따라 인종간의 특이적 SNP에 있어서 그 의미가 크다고 볼 수 있겠다. 또한 더욱 유용한 정보의 획득을 위해 모집단의 크기를 계속해서 확장 할 필요가 있으며 이번 연구를 통해 한국인 특이적인 다형성의 신속한 확인과 진단에 있어 미비하나마 그 발판을 마련하였고 그 가능성을 제시하였다고 생각된다.