Isolation and Characterization of Marine Bacterial Strain SH-1 Producing Agar-Degrading Enzymes

한천 분해효소를 생산하는 해양 미생물 SH-1의 분리 및 특성 분석

Abstract

A marine bacterial strain producing agar-degrading enzymes was isolated from a mud flat in Jeboo-do (Korea) using a selective artificial sea water (ASW) agar plate containing agar as the sole carbon source. The isolate, designated as SH-1, was gram-negative, aerobic, and motile with single polar flagellum. 16S rRNA gene sequence similarity analysis showed the isolate SH-1 had the highest homology (96.5%) to marine bacterium Neiella marina J221. Cells could grow at $28-37^{\circ}C$ but not at $42^{\circ}C$, and the agarase activity of the cell culture supernatant was higher when grown at $28^{\circ}C$ than when grown at $37^{\circ}C$. Cells could grow when concentrations of 1-5% (w/v) NaCl were added to the growth media with the best growth observed at 3% NaCl, and the agardegrading enzyme activity of the cell culture supernatant was best when grown at 3% NaCl-containing growth media under the conditions we examined. The crude enzyme prepared from 48-h culture broth of strain SH-1 exhibited an optimum pH and temperature for agar-degrading activity at 7.0 and $40^{\circ}C$, respectively. Zymogram analysis of the crude supernatant and cell extract showed that strain SH-1 produced at least 3 agar-degrading enzymes with molecular weights of 15, 35, and 52 KD. Thinlayer chromatography (TLC) analysis also suggested that HS-1 produces ${\beta}$-agarase to degrade agarose to neoagarooligosaccharides.

한천을 분해하는 해양미생물을 한천을 유일한 탄소원으로 하는 인공 해수 한천 배지를 이용하여 제부도 개펄에서 분리하였다. SH-1으로 명명한 분리된 균주는 그람음성균이며 한 개의 극성 편모를 가지는 균이었다. 16S rRNA 유전자의 염기서열의 유사성 분석 결과 분리된 균주는 Neiella marina J221 [9]과 가장 높은 상동성을 보였다(96.5%). 분리 균주는 $28-37^{\circ}C$에서 생장하였지만 $42^{\circ}C$에서는 생장하지 못하였고 한천분해효소의 활성은 $37^{\circ}C$보다 $28^{\circ}C$에서 높은 활성을 보였다. 또한 SH-1균주는 1-5% NaCl (w/v)를 포함하는 배양액에서 생장이 가능했으며 3%의 농도에서 가장 좋은 생장을 보였고 한천을 분해하는 효소의 활성도 3% 염분농도의 배양액에서 가장 높았다. 48시간 배양한 세포배양액을 농축하여 조효소액을 준비하여 효소의 적정 pH와 적정 온도를 조사한 결과 pH 7.0에서와 $40^{\circ}C$에서 최적 효소 활성을 보였다. 조효소액을 사용하여 zymogram 분석을 실시한 결과 분자량 15, 35, 52 KD 크기의 3개 이상의 한천 분해효소를 생산하는 것으로 보인다. 박막크로마토그라피(TLC) 분석 결과 아가로스를 분해하여 네오올리고당을 생성하는 ${\beta}$-agarase 를 생산하는 것으로 추정된다.

서 론

최근 지상 및 지하의 자원에서 해양자원 쪽으로 관심이 이동되는 상황에서 해조류 또한 여러 분야에서 관심을 받고 있다. 해조류는 역사적으로 오랜 기간 동안 산업용으로 또한 식용으로 광범위하게 사용되어온 자원으로 해조류의 구성성분은 다당류가 주를 이룬다[5, 15]. 천연자원의 고갈에 따른 대체 에너지 개발, 즉 바이오에탄올 생산을 위한 바이오매스 원료 측면으로도 해조류의 응용 기대감이 매우 높은 상황이다[2, 3, 6]. 또한 지구표면이 아닌 해양에서 자라는 생명체는 지구표면위의 생명체가 생산하는 생리활성 물질과 그 분포 및 종류가 다르다는 면에서도 연구의 대상이 되고 있다[5, 15]. 특히 해조류의 다당류의 분해산물인 올리고당을 활용한 기능성 음식 및 웰빙 음식문화가 대두되며 해조류를 이용하려는 연구가 진행되고 있고 최근 일부 올리고당이 의학적으로 효과가 있는 것으로 밝혀지며[14, 17] 올리고당을 확보하는 방법에 대하여 관심이 증대되고 있다.

현재까지 다당류를 분해하는 방법은 여러 가지가 사용이 되고 있지만 화학적 방법의 경우에는 탄수화물 대부분이 화학적 성분 특히 알칼리나 산에 대하여 비교적 안정적이므로 유효성분의 분리에 어려움이 있으며 비특이적으로 분해되는 문제점이 있다[15]. 그러므로 산업적으로 이용할 수 있는 선택적 올리고당을 획득하기 위해서는 효소의 사용이 바람직하다고 볼 수 있다. 이러한 점에서 최근 해양 유래 다당류의 분해효소에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 특히 분해효소를 분비하는 해양미생물이 탐색 연구결과가 보고되고 있다[5, 13, 29].

한천은 홍조류의 세포벽 구성성분으로 다당류 두 종류, 즉 agarose (60-80%)와 agaropectin (20-40%)의 복합체이다[10, 20]. 응고력이 강하여 한천은 그 자체로 연구용 및 산업적으로 많이 응용이 되었고[8] 의약제로[14, 17], 비만방지제로서[14], 산업용으로 지지체로서 많은 분야에 사용되고 나아가서 식품 및 과자의 원료로 사용되고 있다. 하지만 최근 올리고당의 기능성 식품으로, 의료용으로의 관심이 증대되며 한천을 분해하여 부가가치를 높일 수 있는 올리고당으로 분해하고자 한천 분해효소에 연구가 활발히 진행되고 있다[5, 27, 29].

한천 분해효소(agarase)는 주로 해양미생물이 생산하지만 최근 해양미생물이 아닌 미생물도 생산한다고 보고되고 있다[27]. 특히 홍조류에 기생 또는 공생하는 미생물이 생산하는데 agarose 분해 형식에 따라 α-(1→3) 결합을 분해하여 agarobiose를 생산하는 α-agarase [25]와 β-(1→4) 결합을 분해하여 neoagarooligosaccharide를 생산하는 β-agarase로 나눌 수 있다[13, 25]. 한천분해효소 중 기능성 역할이 월등히 높은 neoagarooligosaccharide를 생산하는 β-agarase에 연구가 집중이 되고 있다[5, 17]. 현재까지 많은 β-agarase를 생산하는 미생물들이 분리되어 효소에 대한 특성이 연구되고, 그 β-agarase 유전자를 클로닝하여 대량생산하는 연구도 활발히 진행되고 있다[23, 24, 29]. 하지만 β-agarase중에도 특히 기능성 면에서 효능이 높다고 알려진 neoagarotetraose 또는 neoagarohexose로 분해하는 β-agarase를 생산하는 미생물의 계속적인 분리 및 효소의 특성 연구는 필요하다[5, 17].

본 연구에서는 한천 분해효소를 생산하는 세균을 서해 제부도의 갯벌에서 분리하였으며, 분리균주 SH-1이 생산하는 한천분해효소의 특성을 조사하였다.

 

재료 및 방법

미생물 배양조건 및 시약

개펄에서 미생물을 분리하고 배양하기 위하여 사용된 배지는 Artificial Sea Water (ASW; MgSO4 12.3 g, KCl 0.74 g, (NH4)2HPO4 0.13 g, NaCl 17.5 g, CaCl2 0.14 g, agar 15 g, Tris base 6.2 g per/1 L, pH 7.2)였으며[4] 필요 시 Bactopeptone 10 g, Yeast extract 3 g을 첨가하였다(ASW-YP). 배지 및 효소 활성측정을 위한 시약은 주로 Sigma (MO, USA) 사로부터 구입하여 사용하였으며 PCR 증폭을 위한 효소 등은 Takara (Japan) 사로부터 구입하여 사용하였다.

한천 분해효소 생산 균주 분리

인천 제부도 개펄에서 다양한 해조류를 포함하는 개펄을 채취하여 멸균 해수 적당량을 첨가하여 약 10-2-10-5배로 희석한 후 ASW 한천 평판배지에 도말한 후 28℃에서 배양하였다. 4-7일이 지난 후 한천이 분해되어 투명한 환을 만들거나 움푹 파이는 세균들을 한천 분해 효소를 생산하는 균주로 간주하였고 필요 시 Lugol’s iodine 용액 (25 g/l Iodine, 50 g/l Potassium Iodine)으로 염색하여 콜로니 주변에 한천을 분해하는 투명환을 형성하는 것을 확인하였다. 한천 분해효소를 생산하는 것으로 확인된 후에는 주로 ASW-YP를 사용하여 균주를 순수 분리하였다. 균주의 전자현미경 사진은 2%의 Uranyl acetate를 사용하여 negative 염색방법으로 투과전자현미경(JEOL, JEM 1010, USA)을 사용하여 세포의 외관 모습을 촬영하였다(NICEM, Seoul).

16S rRNA 유전자 염기서열 분석과 계통수(phylogenetic tree) 작성

순수 분리한 균체로부터 genomic DNA를 획득하여 16S rRNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다[19]. 이 때 PCR 프라이머로 세 개의 bacterial universal primer 세트(27F와 1492R, 9F와 1512R 그리고 518F와 800R)를 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편의 염기서 열은 ㈜제노텍(Daejeon, Korea)에 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열을 바탕으로 blastn을 수행하여 염기서열에 상동성을 보이는 균주를 확인하였다. 상동성을 보이는 표준균주의 16S rRNA의 유전자 염기서열은 EzTaxon server [7]을 이용하여 획득하였고 가장 높은 상동성을 보이는 16S rRNA 유전자 서열간의 alignment는 ClustalW program [28]을 사용하였다. Phylogenetic tree 작성은 문헌을 바탕으로 Kimura’s two-parameter evolutionary model [16]에 의해 계산하였고 Neighbor-Joining [26] 방법으로 작성하였다.

균주의 세포 성장과 agarase 활성 측정

균주의 성장에 따른 agarase 활성을 관찰하기 위해서, 기본적인 조건으로 0.2% agarose를 첨가한 ASW-YP 액체배지에 28℃에서 진탕 배양하면서 12시간 간격으로 샘플을 채취하였다. 온도에 따른 생장 및 효소활성을 위한 실험으로는 28℃, 37℃, 42℃에서 수행하였고, NaCl 농도에 따른 생장 및 효소활성을 위한 실험으로는 ASW-YP를 바탕으로 하여 최종 NaCl 농도를 1%, 3%, 5%로 조정하여 수행하였다. 균체의 성장은 600 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였고, agarase 활성은 균체를 제거한 샘플의 상등액을 이용하여 0.2% agarose를 기질로 하는 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)법[21]으로 540 nm에서 측정하였다. 모든 실험은 3번 반복실험을 수행하여 통계 처리하였다.

조효소액(crude enzyme) 준비

해수의 평균 염분 농도인 3% NaCl을 포함하는 ASW-YP 배양액에서 28℃에서 2일간 배양한 균주 배양액을 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하였다. 배양 상등액에 황산암모늄을 최종 75%가 되도록 첨가하여 침전시켰다[11]. 침전된 단백질 용액을 원심분리하고 상등액을 제거하여 얻어진 단백질 펠렛에 25 mM Tris-buffer (pH 7.2)를 첨가하여 펠렛을 용해시키고 투석하여 배양액 조효소액을 얻었다.

한편 배양액으로부터 회수된 세포 펠렛에 배양액 부피의 25 mM Tris buffer (pH 7.2)를 첨가하여 세척하고 적당량의 완충용액을 첨가한 세포 현탁액을 얻었다. 세포를 파쇄하고 원심분리하여 얻은 상등액에 황산암모늄으로 단백질을 침전시켜 펠렛을 얻고, 여기에 적당량의 25 mM Tris-buffer (pH 7.2)를 첨가하여 용해시키고 투석하여 세포질 조효소 액으로 사용하였다.

pH와 온도에 따른 agarase의 활성 측정

효소활성을 위한 최적 pH 조건을 찾기 위해서 준비한 배양액 조효소액으로 두 종류의 buffer, 즉 20 mM MOPS (pH 6.0-7.0), 20 mM Tris-Cl (pH 7.0-9.0)를 사용하여 효소 반응을 실시한 후 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성의 최적 온도를 찾기 위해서 20℃에서 50℃까지의 다양한 온도 조건에서 30분간 반응을 유도하여 활성을 측정하였는데 이 때 pH는 7.0으로 고정하고 활성을 측정하였다.

Zymogram assay 및 박막 크로마토그래피 분석

단백질 농도는 Bio-Rad Dc protein assay kit (CA, USA)를 이용하여 측정하였고 standard 단백질로 bovine serum albumin (BSA)를 사용하였다. SDS-PAGE는 Laemmli [18] 방법을 바탕으로 10% polyacrylamide gel를 사용하였고 전기영동 후 commassie blue 염색을 시행하였다. 효소 활성을 보기 위한 zymographic analysis를 위해 gel을 준비할 때 agarose를 첨가하여 separating gel을 만들었다[12]. SDS-PAGE가 끝난 gel은 2.5% Triton X-100 용액에서 40분간 세척하여 SDS를 제거하였다. SDS가 제거된 gel은 agarase 효소 활성을 나타낼 수 있는 25 mM Tris buffer (pH 7.2)에서 42℃에서 30-60분간 반응시킨 후 Lugol 시약이나 commassie blue 시약으로 발색하여 확인하였다. Agarase에 의한 가수분해 산물 분석은 agarose 0.2%를 포함하는 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)에 조효소액을 첨가하여 40℃에서 반응시킨 후 Temujin 등의 방법으로[29] silica gel 60 plate (Merck, USA)를 이용하여 n-butanol-acetic acid-DDW(2:1:1)을 전개용매로 하여 Thin layer chromatography(TLC)를 수행하였다.

 

결과 및 고찰

SH-1 균주의 분리 및 형태학적, 유전학적 특성 분석

제부도 개펄에 서식하는 균주들 중 한천 분해 효소를 생산하는 해양 미생물을 분리하고자 염분 농도가 해양의 평균 염분농도와 같은 농도인 3%(w/v)를 포함하는 artificial sea water에 한천을 넣은 ASW 고체배지를 이용하여 한천 분해환을 보이는 균주를 선별하여 SH-1이라고 명명하였다. SH-1 균주는 ASW-YP 고체 배지에서 28℃에서 24시간 배양하면 약 1-2 mm 정도의 비교적 작은 약한 미색의 콜로니를 형성하고 콜로니 주위에 2-3 mm의 투명환을 보인다. 분리균주 SH-1은 고체배지에 접종한지 1일 이후부터 한천 분해능을 보였으며 배양시간이 지남에 따라 점점 높은 효소활성을 보였다(Fig. 1A).

Fig. 1.Agar-degrading activity and transmission electron micrograph (TEM) of the marine bacterium SH-1. (A) Zymogram plate assay result as a function of cultivation time of the SH-1. The strain was cultivated on ASW-YP agar plate and Lugol’s idodine solution was overlaid to detect reducing sugars, degraded product from agar by agarase. (B) Transmission electron micrograph of SH-1. The bacterial cells were removed from ASW-YP culture plate and examined by transmission electron microscopy after negative staining with 2% uranyl acetate. Bar, 1 μm.

SH-1 균주는 그람 음성균이며 투과전자현미경 (transmission electron microscopy) 사진 촬영 결과 포자를 형성하지 않는 박테리아인 것으로 보인다. 그 크기는 직경이 약 0.3-0.7 μm이며 그 길이는 1-3 μm 정도의 간균이었다. 편모는 한 쪽 극에 약 10-15 μm 길이의 한 개의 편모를 가지는 균이었다(Fig. 1B).

분리된 균주를 동정하고자 16S rRNA 유전자를 PCR 방법을 이용하여 증폭한 후 그 염기서열을 분석하였다. 결정된 염기서열을 바탕으로 blastn 프로그램으로 유사균들의 16S rRNA 유전자와의 상동성을 비교한 뒤 계통수를 작성하였다(Fig. 2). 분리 균주는 Neiella marina J221과 가장 높은 약 96.5%의 상동성을 보였다. Neiella marina J221 균은 2012년 해삼(Apostichopus japonicas) 내장에서 발견된 균으로 그람음성균이며, 1개에서 수 개의 편모를 가진 해양미생물로 보고되었지만[9] 아직까지 이와 같은 속으로 보고된 균주는 Neiella marina H014 하나 정도이다(GenBank: KJ577009.1). 그 다음으로 높은 유사성을 보인 균군으로는 Pseudoalteromonas 속이 약 92% 이하의 상동성을 보인다. 가장 높은 상동성을 보이는 Neiella marina J221은 agarase, alginase, cellulase, amylase 등을 생산하는 균으로 보고되었지만[9] 본 연구에서 분리한 SH-1의 균체 크기가 Neiella marina J221보다 좀 더 크고 편모도 하나인 것을 볼 때 분리균주 SH-1을 Neiella 속으로 판정하기도 아직은 어려운 상황으로 분리 균주의 동정에 관하여는 더욱 자세한 연구가 필요하다.

Fig. 2.Phylogenetic tree analysis of strain SH-1. Tree was constructed from the nucleotide sequence of 16S rRNA gene using the neighbor-joining method [26]. The scale bar indicates a genetic distance of 0.2. The number shown next to each node indicates the percentage bootstrap value of 1,000 replicates.

SH-1 균주가 생산하는 한천 분해 효소의 특성 분석

SH-1 균주가 생산하여 분비하는 한천 분해효소의 특성을 분석하고자 우선 균주의 생장조건에 따른 균주의 효소 활성에 대하여 알아보았다. 28℃, 37℃ 그리고 42℃에서 분리 균주를 배양한 결과, 37℃에서 생장 속도가 다소 빠른 것 외에는 36시간 정도가 지나면 28℃와 37℃에서 생장 속도가 같아졌다(Fig. 3A). 생장 온도에 따른 효소 활성을 조사하여 본 결과 비록 생장 속도는 37℃에서 더 좋은 생장을 보였지만 효소 활성은 28℃에서 최대 5배 정도의 높은 활성을 보였다(Fig. 3B).

Fig. 3.Effect of growth temperature on cell growth and agarase production. (A) Comparison of cell growth in ASW-YP at the different growth temperature (42℃, ▲; 37℃, ●; 28℃, ■). (B) Comparison of agarase activity produced by the cells grown at two different growth temperatures (37℃, ●; 28℃, ■). All data are the average of three parallel replicates.

배양액의 염분농도에 따른 효소 활성을 조사하고자 NaCl 농도를 1%, 3%, 그리고 5%(w/v)를 포함하는 배양액에서 분리 균주를 배양하며 그 생장 곡선을 그려보았다. Fig. 4A에서 보듯이 균주는 3%에서 가장 좋은 생장을 보였다. 염분 농도에 따른 효소 활성을 알아본 결과 Fig. 4B에서와 같이 NaCl 3%에서 생장 했을 경우가 NaCl 1%에서 생장했을 경우보다 약 1.6배 높은 활성을 보였다.

Fig. 4.Effect of salt concentration of the medium on cell growth and agarase production. (A) Cell growth in ASW-YP with the different NaCl concentration at 1, 3 and 5% (w/v) (1%, ▲; 3%, ●; 5%, ■). (B) Comparison of agarase activity produced by the cells grown at the different NaCl concentration (1%, ▲; 3%, ●). All data are the average of three parallel replicates.

효소활성을 위한 최적 조건을 알아보고자 배양액 조효소액을 준비하여 서로 다른 pH와 온도에 따른 효소 활성을 조사하였다. 다른 한천 분해효소와 유사하게[13, 14] SH-1이 생산하는 한천 분해효소는 pH 7.0-8.0 사이에서 가장 높은 활성을 보였다(Fig. 5A). 온도에 따른 효소 활성을 보기 위하여 20, 30, 37, 40, 45, 그리고 50℃에서 효소 활성을 측정한 결과 Fig. 5B에서 보듯이 30-45℃ 사이에서 최대 활성 대비 80% 이상의 상대적인 효소활성을 보였으며 그 중 40℃에서 가장 높은 활성을 보였다.

Fig. 5.Effect of pH on agarase activity produced by SH-1 strain. (A) Enzyme activity on the different pH (pH 6-7, ▲; pH 7-9, ●). (B) Enzyme activity on the different temperatures. All data are the average of three parallel replicates.

배양액과 세포질 조효소액을 한천을 포함하는 PAGE 이후 zymogram 분석을 실시하여 Fig. 6과 같은 결과를 얻었다. 해양 박테리아 SH-1은 적어도 3개 이상의 한천 분해효소를 생산하는 것으로 보이며 그 중 가장 많이 발현되는 것으로 보이는 분해효소의 분자량은 약 50-55, 35, 15 KD 정도 되는 것으로 보인다. 그 중 약 50-55 KD의 분자량을 가지는 것은 세포 밖으로 분비되었으며 약 35 KD 분자량의 효소는 분해효소는 소량이 세포 밖으로 분비되는 것으로 보인다. 이는 β-agarase의 크기와 매우 유사한 크기이므로[13, 15] β-agarase가 분비되는 것으로 추정된다. 참고로 대부분의 α-agarase는 85 KD 이상의 크기를 가지는 것으로 보고 되고 있다[1, 22]. 또한 준비한 배양액 조효소액에 의한 agarose 분해산물을 TLC 분석한 결과 neoagarohexose, neoagarotetrose, neoagarobiose와 같은 Rf 값을 가지는 산물로 분해되는 것으로 보아 분리한 균주 SH-1은 β-agarase를 생산하는 것으로 추정된다(Fig. 7).

Fig. 6.Zymogram assay of the agarases produced from SH-1. Lane 1, crude enzyme extract of cell supernatant; lane 2, crude enzyme extract of the cell. Size of protein markers are indicated on the left (in KD).

Fig. 7.Thin layer chromatography analysis of the hydrolyzed product of agarose by agarase produced from SH-1. The reaction was carried out in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2% (w/v) agarose and enzyme extract at 40℃ for 8 days. The reaction products were analyzed by TLC using silica gel 60 plate with an n-butanol-acetic acid-water solution (2:1:1, by volume). G, galactose; Reaction time (0, 4, 6, 8 days); Standards (neoagarobiose, neoagarotetrose, neoagarohexose) [29].