재료 및 방법
실험재료 −본 실험에 사용된 베트남산 약용식물들(Table I)은 가천대학교 김주환 교수팀에 의해 베트남에서 채집되었으며, 동정을 거친 후 실험에 사용하였다. 증거표본은 한국한의학연구원 한약연구본부 한의신약연구그룹 표본실에 보관중이다.
Table I.Inhibitory effect of extracts from Vietnamese herbal medicines on the activities of aldose reductase
Table I.Continued
Table I.Continued
Table I.Continued
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Table I.IC50 values were calculated from the dose inhibition curve.
추출 및 시료조제−분쇄한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40℃의 수욕 상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조하였다. 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P2O5를 이용하여 24시간 이상 재건조 한 후 DMSO(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며, 분획물은 에탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(n-BuOH), 증류수로 각각 3 회씩 순차적으로 용매분획하여 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물들을 각각 얻었다. 최종 DMSO의 농도가 0.2%가 되도록 15% TWEEN 80(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액으로 희석하여 사용하였다. 추출에 이용한 에탄올 및 그 외 시약은 1급 및 특급시약을 사용하였다.
In vitro에서 알도즈 환원 효소 억제 실험 − Sprague-Dawley rat(250-280 g)의 수정체로부터 aldose reductase를 Dufrane19) 방법으로 분리하였다. 150 mM sodium phosphate buffer(pH 6.2)와 10 mM 2-mercaptoethanol을 적출한 수정체와 함께 분쇄하여 14,000 rpm에서 30분 간 원심 분리한 다음 상층액을 0.22 μM의 filter로 여과하였다. 효소의 단백질은 bovine serum albumin을 표준으로 이용하여 Bradford20) 방법으로 정량하였다. 150 mM sodium phoshate buffer(pH 6.2), 0.15 mM NADPH, 10 mM DL-glyceraldehyde와 700 μg/ml 효소 혼합액에 0.5% DMSO에 녹인 시료를 가하여 최종용액을 1 ml로 한 뒤 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이때 공시료는 10 mM DL-glyceraldehyde를 첨가하지 않았으며, 표준액은 시료 대신 0.5% DMSO가 들어가도록 하였다. 0.15 ml의 0.5 N HCl을 첨가하여 반응을 종료시킨 뒤, 10 mM imidazole이 첨가된 6M NaOH 0.5 ml을 가하여 60℃에서 15분간 반응시켜 NADPH가 NADP로 전환되는 것을 Spectrofluorometric detector(Ex. 360 nm, Em. 460 nm)로 측정하였다. 모든 시료는 triplicate로 수행하여 IC50 값으로 나타냈다. Aldose reductase inhibitor로 알려진 3,3-tetramethyleneglutaric acid(TMG)21)를 양성대조군으로 택하여 효능을 비교하였다.
결과 및 고찰
천연물로부터 알도즈 환원효소 억제 약물을 검색하기 위해 베트남산 119종의 에탄올 추출물을 이용해 효능을 검색하여 Table I과 같은 결과를 얻었다.
Table I에서 보여주는 것과 같이 양성대조군인 TMG의 IC50값(1.23±0.01 μg/ml)을 기준으로 알도즈 환원 효소 억제효능을 판단하였다. 이 중 Synedrella nodiflora의 줄기와 잎(0.88±0.04 μg/ml), Combretum sundaicum의 줄기와 잎(1.78±0.06 μg/ml), Argyreia acuta의 줄기와 잎(0.67±0.01 μg/ml), Platea latifolia의 전초(2.47±0.01 μg/ml), Linociera sangda의 전초(1.93±0.18 μg/ml), Rhaphiolepis indica의 전초(1.36±0.01 μg/ml), Harrisonia perforata의 줄기와 잎(1.23±0.01 μg/ml), Harrisonia perforata의 줄기와 잎의 EtOAc(2.37±0.12 μg/ml) and BuOH(2.35±0.05 μg/ml) 분획, 9종이 IC50<5 μg/ml으로 효능이 뛰어났고, 그 중 S. nodiflora의 줄기, 잎 그리고 A. acuta 의 줄기, 잎, H. perforata의 줄기와 잎이 TMG보다 1.0-1.8 배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.
국화과의 S. nodiflora 추출물은 항염 효과와 살충 효과가 있다고 보고되었다.22,23) 콤브레타과의 Combretum sundaicum의 잎과 꽃의 EtOAc 추출물에서 분리된 pentacyclic trierpenoids와 그 외 새로 발견된 물질들이 antiapoptotic protein인 Bcl-xL을 억제하고, 다양한 암세포들의 세포 활성을 억제하여 항암 작용을 한다고 보고되었다.24) 메꽃과의A. acuta의 줄기와 잎은 본 연구팀의 연구 결과 당뇨합병증의 중요한 원인 중 하나인 최종당화산물의 생성을 억제효능이 우수하여25) in vitro 실험을 통한 효능이 확인이 필요하다고 사료된다. 장미과의 R. indica뿌리의 methanol 분획의 dibenzofurans, biphenyls와 trierpenoids가 염증매개물질인 N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(fMLP)가 유도된 산화 생성물을 억제하는 효능이 보고되었다.26,27) 소태나무과의 H. perforate의 뿌리와 줄기의 methanol 추출물은 Staphylococcus aureus와 Mycobacterium smegmatis에 대해 우수한 항균성이 나타났으며,28) 뿌리는 유방암 세포인 MCF-7에 독성을 나타내 항암작용이 보고되었다.29) 또한 plasmodium flaciparum을 억제하여 항말라리아 활성이 보고되었다.30) P. latifolia와 물푸레나무과의 L. sangda는 효능 및 성분에 관한 연구가 진행된 바 없으며, 위 7종의 추출물과 2종의 분획 모두 알도즈 환원 효소 억제 효능에 관해 보고된 바 없었다. 본 연구 결과는 안전하고 우수한 알도즈 환원 효소 억제제 후보 물질 발굴을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 당뇨합병증 예방 및 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
결 론
119종의 베트남산 약용식물 에탄올 추출물과 분획을 in vitro에서알도즈 환원 효소 억제활성 검색하였다. 그 결과 S. nodiflora의 줄기와 잎(0.88±0.04 μg/ml), C. sundaicum의 줄기와 잎(1.78±0.06 μg/ml), A. acuta의 줄기와 잎(0.67±0.01 μg/ml), P. latifolia의 전초(2.47±0.01 μg/ml), L. sangda의 전초(1.93±0.18 μg/ml), R. indica의 전초(1.36±0.01 μg/ml), H. perforata 의 줄기와 잎(1.23±0.01 μg/ml), H. perforata의 줄기와 잎의 EtOAc(2.37±0.12 μg/ml)와 BuOH(2.35±0.05 μg/ml) 분획, 9종이 IC50<5 μg/ml으로 효능이 뛰어났고, 추출물이 양성대조군인 TMG와 근접한 효능이 있음을 확인하였고, 그 중 S. nodiflora의 줄기, 잎 그리고 A. acuta의 줄기, 잎, H. perforate의 줄기와 잎이 3종은 양성대조군 TMG보다 1.0-1.8배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.
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