Screening of Chinese Herbal Medicines with Inhibitory Effect on Aldose Reductase (X)

중국 약용식물 추출물의 알도즈 환원 효소 억제 효능 검색(X)

Abstract

Aldose reductase (AR) is the key enzyme of the polyol pathway in the development of the diabetic complications. Sixty seven Chinese herbal medicines have been investigated for inhibitory activities on AR. Among them, 7 herbal medicines, Buddleja crispa (twigs and leaves), Taiwania flousiana (twigs and leaves), Sloanea hemsleyana (fruits), Euphorbia nemetocypha (whole plants), Photinia glomerata (twigs and leaves), Vitex yunnanensis (twigs and leaves) exhibited a significant inhibitory activity against AR. Particularly, S. hemsleyana and V. yunnanensis showed 1.2-4.5 times more potent inhibitory activity than the positive control, 3,3-tetramethyleneglutaric acid (TMG).

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용된 중국산 약용식물들(Table I)은 가천대학교 김주환 교수팀에 의해 중국에서 채집되었으며, 동정을 거친 후 실험에 사용하였다. 증거표본은 한국한의학연구원 한약연구본부 한의신약연구그룹 표본실에 보관중이다.

Table I.Inhibitory effect of extracts from Chinese herbal medicines on the activities of aldose reductase

Table I.Continued

Table I.Continued

Table I.IC50 values were calculated from the dose inhibition curve.

추출 및 시료조제 −분쇄한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40℃의 수욕 상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조하였다. 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P2O5를 이용하여 24시간 이상 재건조한 후 dimethyl sulfoxide(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며 최종 dimethyl sulfoxide의 농도가 0.2%가 되도록 15 % TWEEN 80(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액으로 희석하여 사용하였다. 추출에 이용한 에탄올 및 그 외 시약은 1급 및 특급시약을 사용하였다.

In vitro에서 알도즈 환원 효소 억제 실험 − Sprague-Dawley rat(250-280 g)의 수정체로부터 aldose reductase를 Dufrane18) 방법으로 분리하였다. 150 mM sodium phosphate buffer(pH 6.2)와 10 mM 2-mercaptoethanol을 적출한 수정체와 함께 분쇄하여 14,000 rpm에서 30분 간 원심 분리한 다음 상층액을 0.22 μm의 filter로 여과하였다. 효소의 단백질은 bovine serum albumin을 표준으로 이용하여 Bradford19) 방법으로 정량하였다. 150 mM sodium phoshate buffer(pH 6.2), 0.15 mM NADPH, 10 mM DL-glyceraldehyde와 700 μg/ml 효소 혼합액에 0.5% dimethyl sulfoxide에 녹인 시료를 가하여 최종용액을 1 ml로 한 뒤 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이때 공시료는 10mM DL-glyceraldehyde를 첨가하지 않았으며, 표준액은 시료 대신 0.5% dimethyl sulfoxide가 들어가도록 하였다. 0.15 ml의 0.5 N HCl을 첨가하여 반응을 종료시킨 뒤, 10 mM imidazole이 첨가된 6 M NaOH 0.5 ml을 가하여 60℃에서 15분간 반응시켜 NADPH가 NADP로 전환되는 것을 spectrofluorometric detector로 (Ex. 360 nm, Em. 460 nm) 측정하였다. 모든 시료는 triplicate로 수행하여 IC50값으로 나타냈다. Aldose reductase inhibitor로 알려진 3,3-tetramethyleneglutaric acid (TMG)20)를 양성대조군으로 택하여 효능을 비교하였다.

 

결과 및 고찰

알도즈 환원 효소는 당뇨합병증의 발병원인 중 하나인 폴리올 대사 경로의 첫 번째 효소로 포도당이 솔비톨로 전환되는 과정에 관여한다. 솔비톨은 일반적으로 세포막을 통과하지 못하고 세포막에 축적되어 세포내 삼투압 및 대사과정의 변이와 세포막의 안정성을 감소시켜 당뇨합병증을 야기한다.1) 본 연구에서는 알도즈 환원 효소를 저해하여 당뇨합병증을 예방 및 치료하기 위한 목적으로 천연물로부터 알도즈 환원효소 억제 약물을 검색하기 위해 중국산 67종의 에탄올 추출물을 이용해 효능을 검색하여 Table I과 같은 결과를 얻었다.

Table I에서 보여주는 것과 같이 양성대조군인 TMG의 IC50 값(1.23±0.01 μg/ml)을 기준으로 알도즈 환원 효소 억제 효능을 판단하였다. 이 중 Buddleja crispa 의 가지와 잎(1.57±0.00 μg/ml), Taiwania flousiana의 가지와 잎(1.85±0.01 μg/ml), Sloanea hemsleyana의 열매(0.27±0.02 μg/ml), Euphorbia nemetocypha의 전초(1.77±0.16 μg/ml). Photinia glomerata의 잎(1.83±0.04 μg/ml)과 가지(2.08±0.06 μg/ml), Vitex yunnanensis의 가지와 잎(1.02±0.04 μg/ml) 7종이 IC50<5 μg/ml으로 나타났으며, 그 중 S. hemsleyana의 열매와 V. yunnanensis의 가지, 잎은 1.2-4.5배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다. 부블레이아과의 B. crispa에서 분리한 물질들은 활성산소의 일종인 hydroperoxide의 생성을 촉진하는 lipoxygenas를 억제하고, DPPH radical을 소거하는 항산화 활성이 있다고 보고되었다.21) 알츠하이머 환자에서 감소되어 있는 신경전달 물질인 아세틸콜린을 분해하는 효소와 중추신경계 효소 중 하나인 butyrylcholinesterse의 활성을 억제시켜 알츠하이머의 진행 지연 가능성을 나타냈다.22) 또한 혈압강하와 진정작용을 하여 항고혈압, 항경련 효과가 있다고 보고 되었으며.23) 잎과 가지에서 당뇨합병증의 또 다른 원인 중 하나인 최종당화산물 억제효능이 우수하여 당뇨합병증 예방에 중요한 소재가 될 것으로 판단된다.24) 측백나무과의 T. flousiana뿌리의 성분 분석 결과, sesquiterpene glycoside, triterpenoids, duterpene, phenol류의 성분들이 확인 되었다.25) 담팔수과의 S. hemsleyana polyethylene glycol(PEG)가 처리한 S. hemsleyana의 씨앗은 항산화와 관련된 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT)의 활성을 증가시킨다는 보고가 있다.26) 대극과의 E. nemetocypha와 장미과의 P. glomerata, 마편초과의 V. yunnanensis는 효능 및 성분에 관한 연구가 진행된 바 없으며, 위 7종 모두 알도즈 환워 효소 억제 효능에 관해 보고된 바 없었다. 본 연구 결과는 안전하고 우수한 알도즈 환원 효소 억제제 후보 물질 발굴을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 당뇨합병증 예방 및 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

 

결 론

67종의 중국산 약용식물 에탄올 추출물을 in vitro에서 알도즈 환원 효소 억제활성 검색하였다. 그 결과 B. crispa의 가지와 잎, T. flousiana의 가지와 잎, S. hemsleyana의 열매, E. nemetocypha의 전초, P. glomerata의 잎과 가지, V. yunnanensis의 7종이 IC50<5 μg/ml으로 뛰어난 효능을 보였으며, 그 중 그 중 S. hemsleyana의 열매와 V. yunnanensis의 가지, 잎은 양성대조군인 TMG보다 1.2-4.5배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.