Composition of a Medium for Serum-free Culture of an Adipose-derived Stem Cell Line Established with a Simian Virus 40 T Antigen

Simian virus 40의 T항원 도입으로 수립한 지방유래줄기세포주의 효율적인 무혈청 배양법 및 무혈청 배지조성

Abstract

Adipose-derived stem cells (ADSCs) are considered promising tools for tissue regeneration. However, ADSCs have very poor proliferation capacity. Therefore, fetal bovine serum (FBS) is generally added to the culture media of ADSCs. As FBS contains many uncharacterized components that may affect cellular functions, methods for serum-free cultures of ADSCs have been widely investigated. In this study, to develop an efficient method for a serum-free culture of ADSC-T, we used an ADSC line established by introducing the simian virus 40 (SV40) T gene into primary ADSCs. We then investigated the effect of amino acids, vitamins, and other components on the growth of ADSC-T. When the ADSC-T cells were plated with DMEM/F12 serum-free medium, the cells did not proliferate, and the mixture of amino acids, vitamins, and B27 supplement did not increase the growth of the cells. However, when the ADSC-T cells were provided with serum-free DMEM/F12 after they had been cultured with serum-supplemented DMEM for 24 h, the cells proliferated, and the vitamins and B27 supplement increased the cell growth. Stem-Pro serum-free medium also appeared to be useful as a suspension culture for the ADSC-T cells. The ADSC-T cells secreted large amounts of proteins of around 70 kDa. Insulin-like growth factor (IGF) and fibroblast growth factor basic (FGF basic) were secreted by ADSC-T in larger amounts in the serum-free culture than in the serum-supplemented culture.

지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell; ADSC)는 조직재생을 위한 탁월한 수단으로 인정되고 있으나 세포증식속도가 느려 ADSC의 배양용 배지에는 대게 fetal bovine serum (FBS)이 첨가된다. FBS는 세포에 다양한 영양분을 공급하지만 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있는 미 동정 물질도 많이 함유하고 있다. FBS에 의한 예상밖의 영향과 동물유래물질의 오염을 방지하기 위해 ADSC의 무혈청 배양법에 관한 연구가 광범위하게 이루어지고 있다. 본 연구에서는 ADSC세포에 SV40의 T항원 유전자를 도입하여 증식속도를 향상시킨 ADSC-T세포주의 효율적인 무혈청 배양법을 확립하기 위해 ADSC-T의 세포증식에 미치는 아미노산복합체, 비타민 복합체 및 여러가지 영양분 혼합물(B27)의 영향을 검토하였다. 그 결과, ADSC-T세포를 DMEM/F12 무혈청 배지에 현탁하여 plate에 주입하였을 때는 증식하지 않았으며 아미노산, 비타민 및 B27 영양소복합체는 증식촉진효과를 나타내지 않았다. 그러나 ADSC-T세포를 유혈청 DMEM배지로 24시간 배양 후 DMEM/F12 무혈청 배지로 교체하여 배양했을 때는 세포가 증식하였으며 이때, 비타민 복합체와 B27 영양소복합체는 증식촉진효과를 나타내었다. 또한 Stem pro 배지를 이용하면 ADSC-T의 무혈청 부유배양이 가능한 것으로 나타났다. ADSC-T세포는 분자량 70 kDa 부근의 단백질을 다량으로 분비하였으며, 성장인자 중에서 insulin-like growth factor (IGF)와 fibroblast growth factor basic (FGF basic)는 유혈청 배양보다 무혈청 배양에서 더 많이 분비되었다.

서 론

지방줄기세포(ADSC;adipose-derived stem cells)의 배양과 유지에는 대부분 동물의 혈청, 특히 우태아혈청(FBS;fetal bovine serum)이 포함된 배지가 이용된다. FBS는 다양한 종류의 성장인자(growth factors), 단백질, 비타민류, 호르몬을 포함하고 있다[17]. 혈청 단백질은 지질, 효소류 등의 영양소를 세포내로 운반하는 carrier역할을 하기도 한다[14, 16]. FBS는 살아있는 우태아의 심장을 파열시켜 얻는 것으로 혈청 내 구성성분은 완벽하게 규명되지 않고 있으며, 구성성분과 세포배양에 미치는 영향은 우태아 개체에 따라 다양하게 나타난다[3, 9]. 그러므로 사용되는 FBS의 종류에 따라 줄기세포의 증식과 분화에 다양한 영향을 미쳐 실험결과의 재현성이 낮아지는 결과를 초래하기도 한다[9, 10]. 이로 인해 일반적으로 FBS는 실험에 사용하기 전에 생산된 batch별로 적합성을 사전 검토한 후 사용하게 되는데 이에 따른 인력과 경제적 부담도 적지 않다. 뿐만 아니라 판매되는 FBS의 20~50%에서 바이러스 오염이 관찰되고 있으며, endotoxin이나 prion의 오염 가능성도 높아서 생물의약품의 생산에는 FBS의 사용이 부적절하다는 견해가 강하게 제시되고 있다[12, 16, 17]. 특히 지방유래 또는 골수 유래 줄기세포가 우수한 재생의료 소재로 부각되면서 이들 줄기세포의 무혈청 배양에 관한 중요성이 부각되고 있으며 연구도 활발히 진행되고 있다.

일반적으로 세포배양용 배지는 비타민류, 무기염류, 호르몬류, 성장인자를 포함하며 세포에 따라 미량으로 요구되는 영양소의 공급을 위해 FBS가 첨가된다. 최근에는 FBS를 첨가하지 않는 serum-free media가 다양하게 개발되어 판매되고 있으며 세포의 종류에 따라 적당한 serum-free media를 선정하여 사용하게 된다. 그러나 아직 serum-free media를 이용한 배양효율은 serum을 첨가하여 배양했을 때 보다 매우 낮은 경우가 대부분이며 이를 보완하기 위하여 각종 첨가제가 개발되고 있다[9]. 무혈청 배양의 효율을 증가시키기 위한 첨가제는 기본배지에 포함되어 있는 비타민류, 무기염류, 호르몬류 등을 보다 다양한 종류로 보충하거나 고농도로 보충하여 기본배지의 영양성분을 강화하게 되며 세포에 따라서는 특정한 성장인자를 첨가하기도 한다[10].

한편, 인간의 지방유래줄기세포(ADSC)는 흡입지방으로부터 쉽게 분리가 되며 골수유래줄기세포 못지 않는 분화능력[1, 11, 20]을 가지고 있어서 재생의료 및 줄기세포치료제의 소재로 주목을 받고 있다[2, 8, 15]. 특히 ADSC를 배양하여 수거한 배양액에는 ADSC가 분비한 다양한 종류의 성장인자와 사이토카인이 함유되어 있어 배양액을 원료로 한 재생의약품 (regenerative medicine)의 개발이 활발히 연구되고 있다[1, 4, 12, 13, 18].

본 연구에서는 인간의 지방유래줄기세포에 simian virus 40 (SV40)의 T항원유전자를 도입하여 수립한 지방유래 줄기세포주 ADSC-T를 대상으로 무혈청 배양을 위한 무혈청 기본배지를 설정하고, 무혈청 배양 효율을 증가시키기 위하여 아미노산류, 비타민류 및 영양소복합체의 첨가제 효과를 검토하였으며, ADSC-T의 유혈청 배양과 무혈청 배양으로부터 수거한 배양액 내에 함유되어 있는 성장인자의 양을 비교 검토하였다.

 

재료 및 방법

세포 및 시약

ADSC-T 세포는 흡입지방에서 분리한 지방유래줄기세포 (ADSC)의 초대배양세포에 SV40의 T항원생산유전자를 도입하여 증식 효율을 증가시킨 세포주로서 저자들의 선행연구에서 수립되었다[5]. 세포배양에 사용된 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), DMEM/F12, 아미노산 복합체, 비타민 복합체, B27 영양소복합체, Stem pro 배지 및 FBS는 Invitrogen사의 제품을 사용하였다. 세포의 사진촬영은 위상차도립현미경(Olympus, IMT-2)을 이용하였다.

세포배양 및 세포증식속도 측정

ADSC-T세포의 유지 및 배양은 FBS 10%가 함유된 high-glucose DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건으로 실시 되었다. 배지에는 세균의 오염을 방지하기 위하여 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin (Gibco)이 첨가되었다. Plate의 세포 밀도가 80~90% confluence에 도달하면 passage를 실시하였으며 1:3의 비율로 새로운 plate에 passage 하였고, 각 passage 때마다 hemocytometer를 이용하여 cell counting함으로써 세포증식 속도를 측정하였다.

배지 및 배양 상등액의 단백질 검출

ADSC-T 세포를 FBS 10%가 포함된 DMEM 배지에서 24시간동안 배양한 후 PBS로 3회 세척하고 DMEM/F12, DMEM/F12에 비타민 복합체와 B27 영양소복합체가 첨가된 배지, 또는 Stem pro 배지로 medium change 한 후 매일 1 ml씩 배양상등액을 수거하였으며, 수거한 배양상등액은 0.22 μm의 filter를 이용하여 여과한 후 전기영동 시료로 사용하였다. 배지도 같은 방법으로 여과한 후 전기영동 시료로 사용하였다. 전기영동은 10% SDS-PAGE를 이용하였으며 전기영동한 gel은 단백질 검출을 위해 0.25% coomassie brilliant blue R-250 (Gibco-BRL) 용액으로 20분간 염색하고 탈색용액(25% Methanol, 7% Acetic acid)으로 2시간 동안 탈색하였다.

배양상등액의 성장인자 정량

배양상등액에 함유된 성장인자(growth factor)의 정량은 ELISA kit (R&D systems)를 사용하였다. 시료는 ADSC-T세포를 해당배지에서 72시간 배양한 후 수거한 배양상등액을 0.22 μm filter를 이용하여 여과함으로써 세포를 제거한 후 ELISA를 실시하였다. ELISA는 제조사에서 제공한 사용방법에 의거하여 duplicate로 실시하였으며 결과는 ELISA reader (EZ Read 400. Biochrom)를 사용하여 측정한 후 ELISA reader제조사에서 제공한 soft ware를 이용하여 산정하였다.

 

결과 및 고찰

ADSC-T의 무혈청 배양에서 아미노산 복합체, 비타민 복합체 및 B27 영양소복합체 첨가의 효과

ADSC-T세포는 FBS가 10% 함유된 DMEM에서 가장 잘 증식한다[7, 19]. 그러나 DMEM에 FBS를 첨가하지 않으면 세포는 증식하지 못하고 사멸한다. 한편, Ham’s F12는 CHO (Chinese hamster ovary)세포용 배지이며 역시 10%의 FBS 첨가가 필요하다. 그러나 Ham’s F12는 DMEM에 함유되지 않은 여러 종의 영양소를 함유하고 있다. 본 연구에서는 ADSC-T 세포의 무혈청 배양을 위해 DMEM과 Ham’s F12가 1:1로 혼합된 DMEM/F12 (Invitrogen)를 무혈청 기본 배지로 설정하였다. DMEM/F12는 DMEM에 함유되지 않은 Alanine, Asparagine, Cysteine hydrochloride, Glutamic acid, Proline 등의 아미노산이 첨가되어 있고, 비타민류는 Biotin, Vitamin B12가 첨가되어 있으며, 무기염류는 CuSO4, MgCl2, NaHPO4가 첨가되어 있고 그 외 Hepes, hydroxanthine Na, Linoleic acid, Lipoic acid, Putrescine, Thymidine이 첨가되어 있다.

DMEM/F12의 무혈청 기본배지를 사용할 때 ADSC-T세포의 배양효율을 높이기 위하여 각종 첨가제의 효과를 검토하였다. 먼저 아미노산 첨가의 효과를 검토하기 위해 7종류의 아미노산 복합체(Glycine 750 mg/l, L-Alanine 890 mg/l, L-Asparagine 1,320 mg/l, L-Aspartic acid 1,330 mg/l, L-Glutamic acid 1,470 mg/l, L-Proline 1,150 mg/l, L-Serine 1,050 mg/l)를 DMEM/F12 기본배지에 1% 첨가하여 ADSC-T의 증식 효율을 비교하였다. 배양방법은 ADSC-T를 trypsinization하여 검토할 배지로 suspension한 후 직경 10 cm plate에 1×105 cell씩 seeding하였다. 그 결과 FBS를 10% 함유한 DMEM에서는 ADSC-T가 plate에 잘 부착하여 증식하였고 (Fig. 1A) doubling time이 72시간으로 나타났다(Fig. 1B). 그러나 DMEM/F12 무혈청 기본 배지에서는 세포가 plate에 부착하였으나 증식하지 않고 시간이 지남에 따라 사멸하였다(Fig. 1A, B). DMEM/F12 기본배지에 아미노산 복합체를 1% 첨가한 무혈청 배지로 seeding했을 때에도 마찬가지로 plate에 부착하였으나 증식하지 않고 사멸하였다(Fig. 1A, B). 이로부터 DMEM/F12 기본배지로 ADSC-T를 seeding 및 passage를 했을 경우에는 세포증식이 일어나지 않으며 이때 아미노산 복합체의 첨가는 증식 촉진 효과가 없음을 알 수 있었다.

Fig. 1.Effect of additives on ADSC-T proliferation. 1×105 cells of ADSC-T were suspended in DMEM supplemented with 10% FBS (DMEM) or DMEM/F12 serum-free basal medium (D/F) supplemented with amino acids (a.a), vitamin (vit) or B27 supplement (B27) and then plated on 10 cm plates. The cells were photographed after 24 hr of plating (×100) (A) and the growth rates were estimated by cell counting (B). Values are mean ± SD (n=3).

다음은 ADSC-T의 무혈청 배양에서 비타민류 첨가의 효과를 검토하였다. 무혈청 기본배지인 DMEM/F12에 비타민 복합체(Choline chloride, D-Calcium pantothenate, Folic acid, Nicotinamide, Pyridoxal hydrochloride, Thiamine hydrochloride 각 100 mg/l, Riboflavin 10 mg/l, i-Inositol 200 mg/l)를 1% 첨가한 후 ADSC-T를 suspension하여 직경 10 cm plate에 1×105 cell을 seeding하였다. 그리고 FBS 10%를 함유한 DMEM 및 비타민 복합체를 첨가하지 않은 DMEM/F12배지를 사용했을 때와 세포증식을 비교하였다. 그 결과 plate에 ADSC-T가 부착하였으나 증식은 하지 않고 사멸하는 것으로 나타나 DMEM/F12의 기본배지에서 비타민 복합체의 증식촉진효과는 없음을 알 수 있었으며, DMEM/F12를 이용한 무혈청 배양에서 세포의 사멸은 배양 3일 이후에 사멸속도가 증가함을 알 수 있었다(Fig. 1A, B).

다음은 세포증식을 촉진하는 미량 영양소의 복합체인 B27 supplement (Invitrogen, Table 1)를 제조사의 사용법에 따라 DMEM/F12 기본배지에 2% 첨가하여 세포증식 촉진효과를 검토하였다. DMEM/F12에 B27 영양소복합체를 첨가한 배지로 ADSC-T를 suspension하여 직경 10 cm plate에 1x105 cell을 seeding하고 세포증식을 측정한 결과 세포가 plate에 부착하였으며(Fig. 1A), 세포증식촉진 효과는 나타나지 않았으나 세포는 사멸하지 않고 유지 되었고 배양 3일 이후의 급격한 사멸현상은 나타나지 않았다(Fig. 1B).

Table 1.Composition of B27 supplement

무혈청 배지를 이용한 배양방법 확립

상기의 결과에서 DMEM/F12 무혈청 배지를 seeding 배지로 이용할 때는 세포가 plate에 부착 하였으나 증식하지 않았고, 이 때 아미노산 복합체, 비타민 복합체, B27 영양소복합체를 첨가하여도 증식은 촉진되지 않았다. 그러므로 배양방법을 바꾸어 FBS가 함유된 DMEM으로 seeding하여 24시간 배양하여 세포를 안정화 시킨 후 DMEM/F12로 medium change하는 방법을 검토하였으며 이 때 앞에서 사용한 아미노산 복합체, 비타민 복합체, B27 영양소복합체를 첨가하여 증식 촉진효과를 검토하였다. FBS가 10% 함유된 DMEM에 ADSC-T 1×105 cell을 suspension하여 직경 10 cm plate에 seeding하고 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양 후 PBS로 3회 세척하고, DMEM/F12 및 DMEM/F12에 아미노산 복합체 1%, 비타민 복합체 1%, B27 영양소복합체 2%를 각각 첨가한 배지로 medium change하고 세포 성장 속도를 측정하였다. 그 결과 세포 증식 효율은 Fig. 2A에 나타난 바와 같이 무혈청 기본배지(DMEM/F12)에서도 완만한 증식을 보였으며 DMEM/F12 무혈청 기본배지로 세포를 seeding했을때 3일 이후 세포가 급격히 사멸하는 현상은 나타나지 않았다(Fig. 1B).

Fig. 2.Growth efficiency of ADSC-T in serum-free culture with DMEM/F12. 1×105 cells of ADSC-T were cultured in DMEM containing 10% FBS (DMEM+FBS) for 24 hr and then medium was changed with DMEM/F12 (D/F) supplemented with amino acids (a.a), Vitamins (vit) or B27 supplement (B27). Growth rates were estimated by cell counting. Values are mean ± SD (n=3).

첨가제의 효과에 있어서는 DMEM/F12에 Vitamin 복합체를 첨가했을 때 가장 높은 증식 촉진효과가 나타났고, B27 영양소복합체를 첨가했을 때도 촉진효과가 양호하게 나타났다. 그러나 아미노산 복합체를 첨가했을 때는 증식촉진효과가 나타나지 않았다(Fig. 2A). 이 결과로부터 DMEM/F12 무혈청 배지를 이용한 ADSC-T의 배양은 FBS를 함유한 DMEM배지로 24시간 증식시켜 안정화 시킨 후 무혈청 배지로 medium change하여 배양을 하는 것이 적합하다는 것을 알 수 있었다.

또한 첨가제검토에서 비타민 복합체와 B27 영양소복합체가 증식촉진효과를 나타내었으므로 DMEM/F12에 비타민 복합체 1%와 B27 영양소복합체 2%를 함께 첨가한 배지로 medium change를 하여 배양효율을 측정하였다. 그 결과 Fig. 2B에 나타난 바와 같이 비타민 복합체와 B27 영양소복합체를 각각 첨가했을 때 보다 두 가지를 모두 첨가하였을 때 높은 증식속도를 보였으며 배양 3일후의 증식속도 감소현상이 나타나지 않고 일정한 속도로 세포가 증식하였다. 이러한 세포증식은 plate에 세포가 100% confluent로 될 때까지 지속되었으며 doubling time은 80시간으로 나타났다. 또한, trypsinization 이후 유혈청 DMEM배지로 seeding하고 24시간 후에 비타민 복합체와 B27 영양소 복합체를 첨가한 DMEM/F12로 medium change하는 방법으로 계대배양 및 무혈청 배양을 계속할 수 있었다.

이상의 결과로부터 ADSC-T세포주의 무혈청 배양은 FBS 10%를 함유한 DMEM배지를 사용하여 24시간 전배양한 후 PBS로 3회 세척하고, DMEM/F12에 비타민 복합체 1%, B27 영양소복합체 2%를 첨가한 배지로 medium change 하는 방법으로 확립할 수 있었다. 다만, FBS를 함유한 전배양 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후에도 FBS가 미량으로 잔류할 수 있으므로 세척에 주의 할 필요가 있으며 잔류 FBS에 대한 분석도 필요할 수 가 있다.

Stem pro 배지를 이용한 ADSC-T의 무혈청 배양

중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)의 무혈청 배양용 배지로 판매되고 있는 Stem pro배지(Invitrogen)를 사용하여 ADSC-T세포의 배양효율을 검토하였다. ADSC-T 세포를 FBS 10% 함유한 DMEM배지, 무혈청 기본배지(DMEM/F12) 및 Stem pro배지에 각각 1×105 cell씩 suspension하여 10 cm plate에 seeding하여 배양하였다. 그 결과 FBS 10%를 포함한 DMEM과 무혈청 기본 배지인 DMEM/F12에서는 세포가 plate에 부착하였으나, Stem pro로 배양할 경우 plate에 부착하지 않고 부유된 상태에서 증식함을 알 수 있었으며(Fig. 3A), 증식속도는 FBS를 함유한 DMEM에 비해 낮아 doubling time이 5일로 나타났다(Fig. 3B). 이 결과는 Stem pro 배지를 사용할 경우 ADSC-T세포를 부유상태로 무혈청 배양할 수 있음을 나타내며 이것은 앞으로 바이오 reactor를 이용한 대량배양에 적용할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 바이오 reactor를 이용한 연속대량배양조건을 적절히 조정한다면 세포증식 속도도 향상될 것으로 기대된다. 그러나 줄기세포를 부유상태로 대량 배양할 경우 분화능력 및 분비단백질 등에 변화가 나타날 수 있으므로 줄기세포의 사용목적에 따라 배양조건설정에 주의가 필요할 것으로 보인다.

Fig. 3.Serum-free culture of ADSC-T with Stem pro medium. 1×105 cells of ADSC-T were cultured with DMEM containing 10% FBS (DMEM+FBS), DMEM/F12 and Stem pro serum-free medium. The cells were photographed after 72 hr of culture (×100) (A), and the growth rates were estimated by cell counting (B). Values are mean±SD (n=3).

ADSC-T 배양 상등액의 단백질 검출

ADSC-T의 배양에 사용한 각종배지 및 배양 후 수거한 배양 상등액에 함유된 단백질을 검출하였다. 그 결과 Fig. 4A에 나타난 바와 같이 FBS를 10%첨가한 DMEM (D+S)과 DMEM/F12에 비타민 복합체 1% 및 B27 영양소복합체 2%를 첨가한 배지(D+V+B)에서 분자량 70 kDa 부근에서 많은 양의 단백질이 검출되었고 DMEM/F12 무혈청 기본배지에서는 단백질이 검출되지 않았다. 또한 FBS 10%를 함유한 DMEM배지로 24시간 배양 후 PBS로 세포를 3회 세척한 후 DMEM/F12 무혈청 기본배지(D/F)로 medium change하여 배양한 배양상등액에는 분자량 70 kDa 부근의 단백질이 다수 분비되어있는 것으로 나타났다(Fig. 4A). DMEM/F12에 비타민 및 B27 영양소복합체를 첨가한 배지(D+V+B)로 배양한 배양상등액에도 분자량 70 kDa 부근의 단백질이 분비되었을 것으로 추정할 수 있으나 B27 영양소복합체에 함유된 단백질과 겹쳐서 식별은 되지 않았다(Fig. 4A). 배지에서 70 kDa 부근의 단백질이 많이 검출된 것은 FBS에 함유된 BSA (bovine serum albumin)가 검출된 것으로 보이며, B27 영양소복합체에도 BSA가 함유되어 있으므로(Table 1) 70 kDa 부근의 단백질이 많이 나타난 것으로 추정된다. 또한 무혈청 기본배지(D/F)로 배양한 배양상등액에서 70 kDa 부근의 단백질이 검출된 것은 ADSC-T세포에 의해 분비된 것으로 볼 수 있으나 그 구체적인 성분은 차후 검토가 필요할 것이다.

Fig. 4.Staining of proteins in culture supernatants of ADSC-T. The culture supernatants of ADSC-T obtained from culture with DMEM/F12 (D/F), DMEM/F12 supplemented with 1% vitamin mixture and 2% B27 supplement (D+V+B) (A), and Stem pro serum-free medium (S/P) (B) were electrophoresed in 10% SDS-polyacryl amide gel and the gel was stained with 0.25% coomassie brilliant blue R-250 solution. D+S; DMEM supplemented with 10% FBS.

다음으로 Stem pro배지로 배양한 ADSC-T 세포의 배양상등액의 경우, Stem pro배지에 분자량 70 kd 부근의 단백질이 다량 포함되어 있으며 배양과정에 분비된 단백질은 Stem pro 배지에 함유된 단백질과 겹쳐져 식별되지 않았다(Fig. 4B).

이상의 결과를 종합하여볼 때, ADSC-T세포의 무혈청 배양은 배양기에 세포를 부착시켜 배양하는 부착배양과 세포를 부유상태로 배양하는 부유배양이 모두 가능하며, 부착배양은 FBS 10%를 함유한 DMEM배지로 24시간 배양 후 DMEM/F12 무혈청 배지에 비타민류와 B27 영양소복합체를 각각 1%와 2% 첨가한 배지로 medium change하여 배양하는 것이 효율적이며, 부유배양의 경우 Stem pro 배지를 사용하여 배양할 수 있음을 알 수 있었다.

최근 지방줄기세포의 배양상등액에는 피부재생[7, 19], 모발증식촉진[5, 18], 상처치료[7, 8], 피부미백[6] 등의 다양한 효능 물질이 함유되어있음이 밝혀지면서 FBS의 부작용을 배제한 무혈청 배양을 이용한 배양상등액 생산방법이 많이 연구되고 있다. 본 연구의 결과에서 제시한 지방줄기세포주의 무혈청 배양방법은 향후 지방줄기세포의 배양액 생산시스템구축에 유용하게 활용 될 수 있을 것이다.

ADSC-T 배양 상등액의 성장인자 정량

지방줄기세포의 배양상등액에서 나타나는 다양한 효능은 대부분 배양상등액에 함유되어있는 성장인자와 사이토카인에 의한것으로 알려져있다[6, 7, 18, 19]. 그러므로 다음실험에서 유혈청 배양과 무혈청 배양에서 성장인자분비의 차이를 검토하였다. DMEM에 FBS 10%를 첨가한 유혈청 배지에서 ADSC-T 세포를 72시간 배양한 후 수거한 배양상등액과 DMEM/F12에 비타민 복합체 1%, B27 영양소복합체 2%를 첨가한 무혈청 배지에서 ADSC-T세포를 72시간 배양한 배양상등액 내에 함유된 성장인자를 비교하였다. 그 결과 vascular endothelial growth factor (VEGF)는 유혈청 배양액에서 1,537 pg/ml, 무혈청 배양액에서 807 pg/ml 함유된 것으로 나타나 유혈청 배양액에서 약 2배 높게 분비됨을 알 수 있었다(Fig. 5A). hepatocyte growth factor (HGF)는 유혈청 배양액에서 6,690 pg/ml, 무혈청 배양액에서 6,460 pg/ml 검출되어 분비량에 유의한 차이는 나타나지 않았다(Fig. 5A).

Fig. 5.Analysis of growth factors in culture supernatants of ADSC-T. Serum-containing culture was performed with DMEM containing 10% FBS for 72 hr at 37℃, 5% CO2. Serum-free culture was carried out after 24 hr of serum- containing culture by medium change with DMEM/ F12 containing 1% vitamin mixture and 2% B27 supplement for 72 hr at 37℃, 5% CO2. Growth factors in culture supernatants were analyzed with ELISA kit (R&D systems) according to manufacturer’s manual. Values are mean ± SD (n=3).

반면, insulin-like growth factor (IGF)는 유혈청 배양액에서 49 pg/ml, 무혈청 배양액에서 66 pg/ml로 검출되어 무혈청 배양에서 약 1.3배 높게 분비되었으며, 특히 fibroblast growth factor basic (FGF basic)의 경우 유혈청 배양액에서는 47 pg/ml로 검출되었으나 무혈청 배양액에서는 454 pg/ml로 검출되어 유혈청 배양액 보다 무혈청 배양액에서 약 9.7배 높게 분비됨을 알 수 있었다(Fig. 5B). Platelet-derived growth factor AB (PDGF-AB)는 유혈청 배양액과 무혈청 배양액 모두에서 각각 14.9 pg/ml로 검출되어 거의 분비 되지 않는 것으로 나타났다(Fig. 5B).

이 결과로부터 유혈청 배양은 무혈청 배양보다 세포의 증식은 빠르지만 성장인자의 종류에 따라서는 오히려 무혈청배양에서 많이 분비되는 경우도 있음을 알 수 있었으며, 성장인자의 분비는 세포증식속도뿐 아니라 배양조건에 따라서도 변화될 수 있으므로 성장인자의 분비량증가를 위해서는 배양조건의 검토가 필요함을 알 수 있었다.