한국약용식물의 최종당화산물 생성저해활성 검색 (XI)

Screening of Korean Herbal Medicines with Inhibitory Activity on Advanced Glycation End Products Formation (XI)

Abstract

In this study, the inhibitory effect on advanced glycation end products (AGEs) formation of 43 Korean herbal medicines has been evaluated. Among them, 16 Korean herbal medicines were showed to have significant effect ($IC_{50}$; <50 ${\mu}g/ml$) compared to positive reference, aminoguandine ($IC_{50}$: $76.47{\pm}4.81{\mu}g/ml$). Especially, five herbal medicines, Rubus coreanus (leaves, $IC_{50}$: $4.49{\pm}0.03{\mu}g/ml$), Rubus coreanus (twigs, $IC_{50}$: $3.80{\pm}0.34{\mu}g/ml$), Ampleopsis brevipedunculata (stems, $IC_{50}$: $7.43{\pm}0.09{\mu}g/ml$), Lindera erythrocarpa (leave, $IC_{50}$: $8.14{\pm}0.20{\mu}g/ml$), and Lindera erythrocarpa (stems, $IC_{50}$: $3.69{\pm}0.14{\mu}g/ml$) showed more potent inhibitory activity (approximately 9-20 fold) than the positive control aminoguanidine.

재료 및 방법

실험재료 −약용식물은 2009월 4월부터 10월 그리고 2010년 1월부터 2011년 7월까지 전국에서 채취되어, 가천대학교 생명과학과 김주환 교수의 감정을 거친 후 실험 재료로 사용되었다(Table I). 사용한 실험 재료의 증거표본은 한국한의학연구원 한약연구본부 한의신약개발그룹 당뇨합병증연구팀 표본실에 보관중이다.

추출 및 시료조제 −분쇄한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40℃의 수욕 상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조하였다. 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P2O2를 이용하여 24시간 이상 재건조한 후 DMSO(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며 최종 DMSO의 농도가 0.2%가 되도록 15% TWEEN 80(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액으로 희석하여 사용하였다. 추출에 이용한 에탄올 및 그 외 시약은 1급 및 특급시약을 사용하였다.

In vitro에서 최종당화산물 생성저해 실험 – Vinson과 Howard23)의 방법을 변형하여 실험을 실시하였다. 본 실험에서는 10 mg/ml의 우혈청 알부민(bovine serum albumin, Sigma)을 0.2 M phosphate buffer(pH 7.4)에 용해시키고, 0.2 M의 fructose와 glucose를 처리하였다. 이 때 0.2 M phosphate buffer에 0.02% sodium azide를 넣어 반응기간 동안 박테리아의 생성을 방지하였다. 이 반응액에 추출물 또는 최종당화산물 생성저해제인 aminoguanidine을 넣은 후 37℃에서 7일 동안 반응시켰다. 배양 후에는 spectrofluorometric detector(Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 이용하여 형광도를 측정하였다(Ex: 350, Em: 450 nm). IC50값은 n=3으로 하여 계산되었다.

Table I.List of the ethanol extracts of the herbal medicines

 

결과 및 고찰

최근 청년 당뇨 환자의 증가와 함께 평균 수명이 연장 됨에 따라 당뇨환자의 합병증 문제가 심각하게 대두되고 있다. 만성당뇨로 인한 망막증, 실명, 신경병증, 족부궤양, 신증 및 신장 이식 등 국가재정뿐만 아니라 환자 및 가족의 삶의 질을 매우 부정적인 영향을 끼치고 있다. 그러나 아직 당뇨완치제도 개발이 안되었으며 합병증 약 개발 또한 요원한 상태이다.24,25) 따라서 최근에는 천연물을 이용하여 당뇨 합병증의 요인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 억제하는 약물의 검색을 위해 많은 연구들이 진행되고 있다. 한국산 생약을 대표적인 최종당화산물의 억제제인 aminoguanidine26,27)은 독성 문제가 제기되어 임상 3상에서 중단되었다. 본 연구팀은 최종당화산물 생성을 강력하게 억제하는 천연물 소재를 발굴하기 위하여 많은 천연소재들의 효능을 검색 발표하였다.12-19)

Table II.Inhibitory activity of the ethanol extracts of the herbal medicines on AGEs formation in vitro

Table II.Continued

Table II.IC50 values were calculated from the dose inhibition curve.

본 연구에서도 국내에서 자생하는 약용식물 43종의 에탄올 추출물을 이용하여 최종당화산물 생성 저해 효능을 측정하였다. 양성 대조 약물인 aminoguanidine의 IC50값(76.47±4.81 μg/ml)을 근거로 하여, 추출물이 IC50<50 μg/ml이면 효능이 있다고 판단하였다. Table II에서 보여 주는 것과 같이 16종의 식물 추출물에서 IC50<50 μg/ml로 최종당화산물 생성 저해 효능을 보였고, 그 중에서 5종의 추출물 Rubus coreanus의 잎(4.49±0.03 μg/ml)과 가지(3.80±0.34 μg/ml), Ampleopsis brevipedunculata의 줄기(7.43±0.09 μg/ml), Lindera erythrocarpa의 잎(8.14±0.20 μg/ml)과 줄기(3.69±0.14 μg/ml)은 IC50가 10 μg/ml이하로 aminoguanidine보다 약 9-20배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.

장미과의 R. coreanus(복분자딸기)의 열매는 tumor necrosis factor-a(TNF-a), interleukin 6(IL-6) 분비를 억제하고, nitric oxide(NO)의 생산 감소와 inducible nitric oxide synthases (iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2)와 같은 염증유발 단백질의 발현을 억제하여 항알레르기, 항염 작용을 한다고 보고되었고,28,29) 열매, 잎, 뿌리의 추출물의 항산화, 미백, 주름개선 효과가 보고되었다.30) R. coreanus의 물 추출물, 에탄올 추출물은 돌연변이 억제 효과가 뛰어나고, Hep3B와 Hela cell의 성장을 억제한다고 보고되었다.31) R. coreanus의 줄기와 잎에서 분리한 tannins가 항산화작용을 한다고 보고되었다.32) 포도과에 속하는 A. brevipedunculata(개머루)는 메탄올 추출물이 환원력이 강하고, 리놀산 과산화와 플라스미드 DNA 산화를 억제시키고,33) 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼에 대한 산화능이 강해 항산화 효과가 있으며, 암세포에 대한 증식 억제효과를 나타낸다고 보고되었다.34) 마우스에서 사염화탄소에 의해 유도된 간독성을 억제시켜 간 기능을 회복시켜 주는 효과가 있다고 보고되었다.35) 또한 병원성 미생물에 대해 항균작용을 한다고 보고되었다.36) 녹나무과인 L. erythrocarpa(비목나무)가 사람면역결핍바이러스 타입 1(HIV-1) 단백질 분해효소에 대해 억제효과를 가지는 것으로 보고되었다.37) 또한 lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 대식세포에서 NO, iNOS와 COX-2을 억제하여 항염작용을 한다고 보고되었다.38) 일본에서는 위장약과 신경통의 진통제로 사용되고 있으며,39) L. erythrocarpa의 잎은 항균활성을 한다고 보고되었다.40) 또한 산화스트레스가 유도된 H9c2의 apoptosis를 억제하여 항산화 작용을 한다고 보고되었다.41)

위 언급된 5종의 약용 식물은 최종당화산물 생성 억제 효능이 보고된 바 없으며, 양성 대조 약물 보다 9-20배 이상 최종당화산물 생성 억제 효능이 우수한 것으로 확인되었으므로, 전임상 실험을 통해 in vivo효능 확인이 필요하다고 생각된다. 본 연구 결과는 국내 약용식물로부터 안전하고 효능이 좋은 최종당화산물 생성 저해제 후보를 발굴하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있으며, 당뇨에 의해 나타나는 합병증 치료제 개발의 기반을 구축하는데 기여할 수 있을 것이다.

 

결 론

기원이 확인된 국내산 약용식물 43종의 에탄올 추출물이 in vitro에서 최종당화산물 생성저해 효능이 검색되었다. 그 결과 16종이 양성대조군인 aminoguanidine 보다 우수한 효능이 있음을 확인하였고, 특히 복분자딸기의 잎(IC50: 4.49±0.03 μg/ml)과 가(IC50: 3.80±0.34 μg/ml), 개머루 줄기(IC50: 7.43±0.09 μg/ml), 비목나무 잎(IC50: 8.14±0.20 μg/ml)과 줄기(IC50: 3.69±0.14 μg/ml) 등 5종의 추출물은 양성대조군(aminoguanidine: IC50: 76.47±4.81 μg/ml) 보다 9-20배 억제 효능이 우수하므로 당뇨합병증 예방 및 치료제로 개발될 가능성이 있다.