Quantitative Analysis of the Seven Marker Components in Asarum sieboldii using the LC-MS/MS and GC-MS

LC-MS/MS와 GC-MS를 이용한 세신 추출물 중 7종 성분의 함량분석

Abstract

Asarum sieboldii has been used for treatment of fever, pain, common cold, and chronic sinusitis in Korea. In this study, we performed quantification analysis of seven major constituents including aristolochic acid I, aristolochic acid II, ${\alpha}$-asarone, ${\beta}$-asarone, elemicin, methyl eugenol, and safrole in the 70% ethanol extract of Asarum sieboldii and its solvent fractions, n-hexane, ethylacetate, n-butanol, and water ones using a ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometer(UPLC-ESI-MS) and gas chromatography-mass spectrometer(GC-MS). Regression equations of seven components were acquired with $r^2$ values >0.99. The values of limit of detection(LOD) and quantification(LOQ) were 0.1-3.9 ng/mL and 0.3-11.7 mg/mL, respectively. The amount of the seven compounds in Asarum sieboldii were not detected -143.66 mg/g. The established LC-MS/MS and GC-MS methods will be helpful to improve quality control of Asarum sieboldii.

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용된 세신(Asarum sieboldii)은 HMAX(Jecheon, Korea)에서 규격품을 구입하여 전문가로부터 감정 후 사용하였다. 세신 표본(2008-ST14)은 한국한의 학연구원 한약방제연구그룹에 보관하였다.

시약 및 기기 −표준물질인 aristolochic acid I, methyl eugenol 및 safrole은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. aristolochic acid II와 elemicin은 ChromaDex(Irvine, CA, USA)와 Synchem OHG(Felsberg-Altenburg, Germany)에서 각각 구입하였으며, α-asarone과 β-asarone은 ROTH(Karlsruhe, Germany)로부터 구입하였다. 이들 표준물질의 순도는 모두 95.0%이상으로 확인되었다. 정량분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J. T, Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 개미산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 그 외의 시약은 HPLC 또는 특급 시약을 구입하여 사용하였다.

Aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종의 성분 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였다. 질량분석기는 electrospray ionization(ESI) source가 장착된 LC-MS/MS(Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 데이터 처리는 Waters MassLynx software(version 4.1, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 또한 safrole의 분석을 위해 질량분석기가 장착된 GC-MS는 Shimadzu(Kyoto, Japan)사의 QP-2010 Ultra 모델을 사용하였다.

70% 에탄올 추출물 및 용매분획물 조제 − 세신 약 2.0 kg을 분쇄한 후 70% 에탄올을 이용하여 60분간 3회 초음파추출하였다. 추출액을 농축 및 동결 건조하여 222.7 g(수득율 11.1%)의 추출물을 얻었다. 70% 에탄올 추출물을 증류수(1 L)에 현탁시킨 후 n-hexane(1.0 L×3회), ethyl acetate(1.0 L×3회) 및 butanol(1.0 L×3회) 순으로 용매분획을 실시하였다. 각각의 용매분획물을 농축 및 동결 건조하여 nhexane 분획 14.7 g, ethyl acetate 분획 7.0 g, butanol 분획 15.8 g 및 물 분획 130.0 g을 얻었다.

Fig. 1.Chemical structures of seven marker compounds of Asarum sieboldii.

표준액의 조제 − Aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin, methyl eugenol 및 safrole 등 7종의 표준품에 대한 표준용액은 메탄올을 이용하여 모두 1.0 mg/mL의 농도로 조제한 후 4℃에 보관하면서 사용전에 희석하여 사용하였다.

검액의 조제 − LC-MS/MS 정량분석을 위하여 70% 에탄올 추출물, n-hexane 분획, ethyl acetate 분획, butanol 분획 및 물 분획을 각각 100 mg을 정확히 측정한 후 메탄올을 넣어 10 mL로 맞춘 후 30분간 초음파 추출하였다. 그 후 메탄올을 이용하여 70% 에탄올 추출물 100배, n-hexane 분획 2000배, ethyl acetate 분획, butanol 분획 및 물 분획을 각각 10배 희석 후 0.22 μm 멤브레인 여과하여 검액으로 하였다. 또한 GC-MS 분석을 위한 검액은 LC-MS/MS 검액 조제법과 동일하며 n-hexane 분획만 100배 희석한 후 검액으로 사용하였다.

LC-MS/MS 및 GC-MS 분석조건 −세신의 주요성분인 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol의 정량분석을 위해 Waters사의 UPLC와 질량분석기를 사용하여 Table II와 같은 조건으로 분석을 하였다. 이들 6종 성분의 LC-MS/MS 정량 분석을 위하여 각 성분의 precuusor ion, product ion, cone voltage 및 collision energy 등에 대한 최적의 조건은Table III과 같이 설정하여 다중반응탐색법(multiple reaction monitoring; MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다. 또한 세신의 성분 중 하나인 safrole의 정량분석을 위해 Shimadzu사의 QP-2010 Ultra 모델의 GC-MS를 사용하여 Table IV와 같이 분석하였다.

검량선 작성 − Aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종의 표준품에 대한 검량선은 10, 100, 500 및 1000 ng/mL의 농도로 작성하였으며, safrole은 100, 500, 1000 및 2000 ng/mL의 농도로 희석하여 피크 면적과 농도에 대해서 작성하였다. 작성된 검량선은 상관계수(r2)를 구하여 직선성을 판단하였다.

 

결과 및 고찰

LC-MS/MS 및 GC-MS 분석조건 확립 −세신의 주요성분인 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종의 성분을 LCMS/MS를 이용한 선택성과 민감도가 우수한 MRM 검출 방법으로 함량분석을 실시하였다. 역상 UPLC 조건에 의한 ESI 방법의 양이온 모드에서 6종 성분의 분리를 위해 0.1%(v/v) 개미산이 각각 함유된 물과 아세토나이트릴의 이동상을 이용하여 Table I과 II의 조건을 이용하여 검출하였다. MS 분석 결과 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol 6종 모두 m/z 342.1, m/z 312.1, m/z 209.1, m/z 209.1, m/z 209.1 및 m/z 179.1에서 각각의 [M+H]+ 형태의 분자이온 피크를 확인하였다(Fig. 2). 확립된 세신의 LC-MS/MS MRM 모드 결과 6종의 성분인 aristolochic acid II, elemicin, β-asarone, methyl eugenol, aristolochic acid I 및 α-asarone은 6.10분, 6.81분, 6.96분, 6.96분, 6.99분 및 7.82분에서 각각 검출되었다(Fig. 3). 또한 safrole의 함량분석을 위해 GC-MS를 이용하여 Table III과 같은 조건으로 분석을 실시하여 m/z 162에서 [M]+ 형태의 분자이온 피크를 확인하였다(Fig. 4). 토탈이온크로마토그램(total ion chromatogram; TIC)에서 7.38분에 safrole이 검출되었다(Fig. 5).

Table I.*0.1%(v/v) formic acid in water †0.1%(v/v) formic acid in acetonitrile

Table II.Mass detection condition of marker compounds

검량선 − LC-MS/MS를 이용하여 ESI 방법의 MRM 모드에서 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종 성분의 농도에 따른 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성한 결과 상관 계수(r2) 값이 0.9972, 0.9991, 0.9959, 0.9992, 0.9998 및 0.9992의 양호한 직선성을 각각 나타내었으며, GC-MS를 이용하여 작성한 safrole 역시 0.9982의 양호한 상관 계수 값을 나타내었다(Table IV).

Fig. 2.Q1(a) and Q3(b) mass spectra of six standard compounds Aristolochic acid II(A), elemicin(B), β-asarone(C), methyl eugenol(D), aristolochic acid I(E), and α-asarone(F).

Fig. 2.Continued.

Fig. 2.Continued.

Fig. 2.Continued.

Fig. 3.Chromatogram of six marker compounds(A) and 70% ethanol extract of Asarum sieboldii(B), n-hexane fraction(C), ethylacetate fraction(D), butanol fraction(E), and water fraction(F) by LC-MS/MS MRM mode. Aristolochic acid II(1), elemicin(2), β-asarone(3), methyl eugenol(4), aristolochic acid I(5), and α-asarone(6).

Fig. 3.Continued.

Table III.Conditions for GC-MS Analysis of Asarum sieboldii

Fig. 4.Mass spectrum of safrole by GC-MS.

Fig. 5.TIC chromatograms of safrole(A) and n-hexane fraction(B) by GC-MS.

Table IV.Linearities, regression equation, correlation coefficients, LOD, and LOQ for marker compounds

Table V.*Not detected

세신 중 주요성분의 함량분석 −세신 추출물에 대하여 LC-MS/MS와 GC-MS를 사용하여 설정된 분석법으로 7종 성분에 대한 함량을 분석하였다. LC-MS/MS에서 정량분석을 위한 aristolochic acid I의 MRM 조건은 m/z 342.1(precursor ion)에서 COO−가 떨어진 [M−COO−+H]+ 형태의 m/z 298(product ion), aristolochic acid II는 m/z 312.1(precursor ion)에서 COO−가 떨어진 [M−COO−+H]+ 형태의 m/z 268(product ion), α-asarone, β-asarone 및 elemicin은 m/z 209.1(precursor ion)에서 CH3가 떨어진 [M−CH3+H]+형태의 m/z 194(product ion) 및 methyl eugenol은 m/z 179.1(precursor ion)에서 CH3가 떨어진 [M−CH3+H]+ 형태의 m/z 164(product ion)로 설정한 후 정량을 실시하였다. Safrole은 GC-MS를 이용하여 m/z 194에서 함량을 분석하였다. 함량 분석 결과 세신 추출물 중 aristolochic acid I은 에틸아세테이트 분획에서만 0.22 mg/g으로 검출되었으며, safrole은 헥산분획에서만 5.66 mg/g으로 검출되었다. Elemicin과 methyle eugerol의 경우 0.00-17.02 mg/g 및 0.06-143.66 mg/g으로 모든 시료에서 검출이 되었으며, β-asarone은 70% 에탄올 추출물에서만 0.11 mg/g으로 검출되었다. 그 외 aristolochic acid II와 α-asarone은 검출되지 않았다(Table V).

 

결 론

세tolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin, methyl eugenol 및 safrole 등 7종의 성분에 대하여 LC-MS/MS와 GC-MS를 이용한 함량분석을 실시하였다. LC-MS/MS 정량분석을 위한 MRM 조건은 aristolochic acid I m/z 342.1/298, aristolochic acid II m/z 312.1/268, α-asarone, β-asarone 및 elemicin m/z 209.1/194 및 methyl eugenol m/z 179.1/164으로 분석을 실시하였으며, safrole은 GC-MS를 이용하여 m/z 194에서 분석을 실시한 결과 헥산 분획물에서 methyl eugenol, elemicin 및 safrole이 143.66 mg/g, 17.02 mg/g 및 5.66 mg/g으로 다른 성분과 분획물에 비해 많이 함유되어 있음을 확인하였다.