Effects of Water Temperature and Estradiol-17β on the Sex Ratio and Growth of the Japanese Eel, Anguilla japonica

극동산 뱀장어, Anguilla japonica의 성비와 성장에 미치는 수온 및 estradiol-17β의 효과

Abstract

This study investigated the effects that water temperature and the administration of estradiol-17${\beta}$ (E2) had on the sex ratio and growth of the Japanese eel, Anguilla japonica. Glass eels (total length${\fallingdotseq}$6.5 cm) were differentiated into an E2 group and an E2-free group and then they were reared for about four months at three water temperature levels of $20^{\circ}C$, $24^{\circ}C$, and $28^{\circ}C$. The results showed that the young eels survived normally at the rearing water temperature of ${\geq}24^{\circ}C$, and grew to a mean size of 20 cm (total length). In the E2-free group, temperature was not found to increase the sex ratio (feminizing rates); however, the sex ratio of the E2-administrated group was found to be a little higher at a high temperature ($28^{\circ}C$). The growth of the E2 group was lower than the growth of the E2-free group at $24^{\circ}C$ and the E2 concentration levels in the plasma at $24^{\circ}C$ were found to be significant after the end of the E2 administration period (178 days). Therefore, we thought that long-term administration of E2 must be considered to be the reason for growth decline in spite of the prominent sex ratio effect. Our results indicate that temperature was not related to an increase in the feminizing rate (sex ratio) in the Japanese eel, Anguilla japonica, and other environmental factors (rearing density, salinity, etc.) that have the possibility of inducing ovarian differentiation must be investigated.

본 연구에서는 양식산 극동산 뱀장어, Anguilla japonica, 에서 고비율로 암컷 친어를 확보할 목적으로 실뱀장어(평균 전장: 6.5 cm)를 estradiol-17${\beta}$ (E2) 투여구와 일반사료(E2-free) 투여구로 나누어 사육수온 별(20, 24 및 $28^{\circ}C$) 조건에서 4개월간 사육하여 성비조사와 성장변화를 실시하였다. 조사한 결과 본 연구에서 설정한 수온 영역에서는 E2-free 실험구에서는 암컷 비율의 변화가 없었으나, E2 경구투여에 의한 자성화율은 높은 수온($28^{\circ}C$)에서 소폭 증가하였다. 특히, 수온 $24^{\circ}C$ 실험구에서 E2 경구투여 개체가 E2-free 개체보다 성장곡선이 낮게 나타났으며, 혈중 E2 농도는 E2 투여를 종결한 후(178일)에도 여전히 유의적으로 높게 존재하였다. 따라서 E2 투여에 의한 자성화 유도 효과는 높았지만, 장기간 투여시 성장저하에 영향을 미치는 것으로 보인다. 극동산 뱀장어에서 사육조건 중 수온에 의한 암컷으로의 성분화 효과는 확인 할 수 없었으며, 다른 환경인자(사육 밀도, 염분 등)의 관련성도 이후 검토하여야 할 것이다.

서 론

뱀장어과(Anguillidae) 어종은 태평양 동쪽, 대서양 남부 및 극지를 제외한 온대 지역과 열대 지역에 걸쳐 16종 3아종이 분포하며, 담수역에서 성장하고 산란을 위해 수백에서 수천 Km 떨어져 있는 대양의 각 산란장으로 이동하는 강하성(Catadromous) 어류이다[21]. 그 중 우리나라에 서식하는 종은 극동산 뱀장어, Anguilla japonica와 무태장어, A. marmorata 2종이며, 우리나라를 비롯한 일본, 중국, 대만 등의 주요 양식 대상 종은 극동산 뱀장어이다[14].

뱀장어 양식은 100% 자연산 실뱀장어 어획에 의존하고 있으며, 최근 동아시아 4개국의 극동산 실뱀장어는 2006년 160톤(국내 어획량 15톤)의 최고 어획량을 기점으로 점점 감소하여 2013년에는 15톤(국내 어획량 1톤)으로 급격히 감소하였다[6]. 이러한 이유로 세계 각국에서는 자국 뱀장어의 자원 증강을 위한 인공종묘생산 연구가 1960년대부터 시작되어, 2001년 일본은 인공 실뱀장어 생산에 세계 최초로 성공하였으며[29,30]. 국내에서도 2012년 세계 2번째로 성공하였다[13, 15]. 그러나 세계적으로 상업 목적의 인공 실뱀장어 양산 체계는 구축되어 있지 않아 동아시아 4개국의 뱀장어 양식 업계에서는 타종(유럽산 A. anguilla, 북미산 A. rostrata, A. marmorata, 동남아산 A. bicolor, 아프리카산 A. mossambica) 실뱀장어 등이 입식되어 양식되고 있으나, 열대역에 서식하는 실뱀장어 초기 생존율의 감소와[20] 자국 뱀장어 자원 보호 및 수출 규제[6, 25] 등으로 뱀장어 양식 산업에 어려움을 겪고 있는 실정이다.

한편 뱀장어 인공종묘의 대량생산 기술력을 확보하기 위해 우량 암컷 친어를 안정적으로 확보하는 것이 필요하지만 양식산 뱀장어의 대부분이 수컷으로 보고되어 있다[4, 5, 14]. 이러한 문제점을 해결하기 위해 성분화 이전의 개체에 estradiol-17β (E2) 경구투여로 자성화 유도된 개체를 암컷 친어로 이용하고 있으나[4, 14, 28], 난질 저하 및 염색체 이상[19, 24] 등으로 안정적인 양질 수정란을 대량 확보에 어려움이 있다. 이처럼 양식 뱀장어의 치어로부터 높은 비율의 암컷생산을 유도하기 위한 방법에 관한 정보 부족은 물론 실험적인 연구도 미비하여, 본 연구에서는 환경적 요인 중 하나인 사육 수온 영향에 따른 성비 조성을 조사하여 안정적인 암컷 친어 확보 방법을 연구하고자 하였다.

 

재료 및 방법

시험어

극동산 뱀장어, Anguilla japonica, 치어인 실뱀장어(평균체중: 0.14±0.06 g, 평균전장: 5.7±0.9 cm) 3,000마리를 4월 말경 목포 현지 실뱀장어 채포 어민에게서 구입하였다. 실뱀장어는 서서히 담수로 순치 시킨 후, 24℃에서 10일간 입붙임 사료(키토아미노, KOFEC사, 서울, 한국)를 1일 2회, 체중의 8%씩 공급하면서 유수식으로 사육하였다. 사육 수조에는 충분한 산소를 공급하였고, 수조 상단에 검정색 차광막을 설치하여 안정을 취하였다.

수온 및 Estradiol-17β (E2) 경구투여에 따른 성장 및 성비 조사

일주일간 입붙임 단계가 끝난 실뱀장어(평균체중: 0.17±0.06 g, 평균전장: 6.5±0.8 cm)를 1톤 FRP수조에 500마리씩 6개 실험구로 분산 수용하였다. 실험구의 온도를 20℃, 24℃ 및 28℃로 설정하여 냉온수 조절이 가능한 히터펌프를 설치하여 유수식으로 사육하였고, 경구투여용 배합사료(일청사료, 도쿄, 일본) 는 Kim 등[14] 방법에 따라 25 mg/kg diet 농도의 estradiol-17ß (E2; Sigma-Aldrich Co., LLC, USA) 첨가 분말사료와 E2-free 분말사료를 각각 제조하여 실험구에 따라 1일 2회, 체중의 4~6%씩 약 4개월(127일) 간 순차적으로 공급하였고, 그 이후 178일까지는 일반 치만 분말사료(수협사료, 의령, 한국)를 전체 실험구에 공급하였다.

각 실험구의 성장률 조사는 실험개시(initial; in) 및 실험개시 후 34, 68, 98, 127 그리고 178일째 무작위로 30마리씩 20 ppm 농도의 2-phenoxyethanol (Sigma, USA)으로 마취 후 전장(Total Length; TL, cm)와 체중(Body Weight; BW, g)을 측정하였다.

각 실험구의 성비 조사는 E2 첨가사료 공급종료 시기인 약 4개월(127일) 째, 생식소 판별 및 발달 정도를 분석하기 위해Kim 등[14] 방법에 따라 25~30마리씩 생식소를 절취하여 Bouin’s액에 고정한 후 상법에 따라 파라핀 조직 절편 제작 및 Hematoxylin-Eosin (H＆E) 염색 후 광학 현미경으로 판별하였다[1, 14].

혈중 E2 농도 측정

사료 공급을 개시한지 68일과 127일째에, 그리고 E2 첨가사료 공급을 종료하고 일반 분말사료로 약 2개월 공급하여 사육한 178일째에 각 실험구에서 10마리씩 상기 방법대로 마취하여 1 ml 주사기로 혈액을 채취한 후 4℃, 6,500× g, 15분간 원심하여 상층액을 혈중 E2 분석 전까지 -50℃ 냉동고에 보관하였다. Kim 등[12] 방법에 따라 스테로이드 호르몬 추출 및 혈중 E2 농도를 방사선면역측정법(Radioimmunoassay; RIA)으로 측정하였다.

통계처리

통계처리는 분산 분석 후, Duncan’s new multiple range test 혹은 t-test에 의해서 유의성 검정을 실시하였다(p＜0.05).

 

결 과

수온 및 E2 경구투여에 따른 성장률 조사

사육 수온 변화 및 E2 경구투여에 따른 성장률 변화를 Fig.1에 나타내었다. 사육 수온 20℃ 실험구의 E2-free 및 E2 처리구에 있어서 사육 실험 기간 중 유의한 성장률 차이를 보이지 않았으며, 특히 다른 사육수온 실험구보다 성장률은 두드러지게 낮았다. 사육 수온 24℃ 실험구의 E2-free 및 E2 처리구에서는 실험 기간 중 유의한 성장률 차이를 보이지 않았으나, 실험 종결 후 178일째에는 E2-free 실험구(평균전장 34.1±6.5 cm, 평균체중28.2±0.17 g)가 E2 처리구(평균전장 25.2±4.2 cm, 평균체중 14.3±0.15 g)보다 성장률이 유의하게 증가하였다. 한편 사육 수온 28℃ 실험구의 E2-free 및 E2 처리구에서는 실험 기간 및 종결 후 성장률에 유의한 차이를 보이지 않았다.

Fig. 1.Changes of body weight (BW, A~C) and total length (TL, D~F) of E2-free and estradiol-17ß (E2) treated eels in various rearing water temperature. A: Change of body weight at 20℃, B: Change of body weight at 24℃, C: Change of body weight at 28℃, D: Change of total length at 20℃, E: Change of total length at 24℃, F: Change of total length at 28℃. Data are expressed as the mean ± SEM (n=30). * p＜0.05, ** p＜0.01

수온 및 E2 경구투여에 따른 생식소 발달과 성비 조사

사육 수온 변화 및 E2 경구투여에 따른 성비 조사 결과를 Table 1에 나타내었다. 사육 수온 20℃ 실험구 중 암컷 비율은 E2-free의 경우 16.7%, E2-처리구의 경우 30%였고 수컷 비율은 각각 40%, 20% 였으나, 두 실험구 모두 미분화 혹은 확인 불가능한 상태의 생식소가 각각 43.3%, 50% 였다. 또한 실험기간 중 생존율은 각각 20%, 15%로 현저히 낮았다. 사육 수온 24℃ 실험구의 암컷 비율은 E2-free의 경우 13.3%, E2 처리구의 경우 90% 였고, 수컷 비율은 각각 63.3%, 10% 였다. 한편 E2-free실험구에서만 미분화 상태의 생식소가 23.3% 였다. 또한 실험 기간 중 생존율은 각각 88%, 81%로 다른 사육 수온 실험구보다 높았다. 사육 수온 28℃ 실험구의 암컷 비율은 E2-free의 경우 6.7%, E2 처리구의 경우 93.3% 였고 수컷 비율은 각각 80%, 6.7% 였다. 한편 E2-free실험구만 미분화 상태의 생식소가 13.3% 였다. 또한 실험 기간 중 생존율은 각각 80%, 72% 였다.

Table 1.* Sex ratio and survival rate were determined at the end of E2 treatment during 4 months (127 days). Data are expressed as the mean±SEM (n=25~30).

사육 수온 변화 및 E2 경구투여에 따른 생식소 발달 조사를 위한 조직 관찰 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 입붙임 단계의 실뱀장어 및 실험 종결 후, 사육 수온 20℃의 양 실험구의 미확인 개체의 대부분은 미분화 원시세포 단계(Undifferentiated gonad) (Fig. 2A)였다. 그러나 사육 수온 24℃와 28℃ 실험구에 있어서 약 4 개월(127일) 간 사육 실험 후 E2-free실험구의 암컷은 80% 정도가 염색질 핵소체 단계의 난모세포(Oocyte of chromatin neucleolus stage, Fig. 2B)였으며, 20% 정도가 주변 인기의 난모세포(Fig. 2C)들로 구성되어 있었다. 한편 사육 수온 24℃와 28℃ 실험구에 있어서 약 4 개월(127일) 간 사육 실험 종료 때 E2 처리구의 암컷은 40% 정도가 염색질 핵소체 단계의 난모세포(Fig. 2B)였으며, 60% 정도가 주변인기의 난모세포(Fig. 2C)들로 구성되어 있었다. 그러나 각 수온별 실험구의 E2-free 및 E2 처리구의 수컷은 정원세포(Spermatogonia, Fig. 2D)로 구성되어 있었다.

Fig. 2.Photomicrographs of histological section of gonads in the Japanese eel, Anguilla japonica. A: Undifferentiated gonad of glass eel (X800), B: Chromatin nucleolus stage (X800), C: Perinucleous stage (X800), D: testis in the eel (X400).

혈중 E2농도 조사

사육 수온 변화 및 E2 경구투여에 따른 혈중 E2 농도 변화 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 모든 사육 수온 실험구의 혈액채취 시기인 68일, 127일 및 178일째의 모든 E2-free실험구의 혈중 E2 농도는 30 pg/ml 이하로 측정 불가능한 상태였다. 그러나 사육 수온 20℃의 E2 처리구는 68일째 0.3±0.1 ng/ml 였으며, 127일째에는 0.5±0.18 ng/ml로 증가하였다가 178일 0.2±0.08 ng/ml 로 감소하였다. 사육 수온 24℃의 E2-처리구는 68일째 3.2±0.2 ng/ml 였으며, 127일째에는 4.9±0.9 ng/ml 로 증가하였다가 178일 1.6±0.2 ng/ml로 감소하였다. 사육 수온 28℃의 E2-처리구는 68일째 4.3±1.9 ng/ml 였으며, 127일째에는 7.1±2.1 ng/ml로 증가하였다가 178일째에는 0.45±0.6 ng/ml으로 급격히 감소하였다.

Fig. 3.Changes in plasma estradiol-17ß (E2) levels in a E2-free and E2-treated Japanese eel during experiment periods (A and B) and after experiment periods (C) at 20, 24 and 28℃. A significant difference was observed between columns indicated by different letters (a: has no significant difference, b: has significant difference). A: 68 days, B: 127 days, C: 178 days. Data are expressed as the mean±SEM (n=10).

 

고 찰

극동산 뱀장어, Anguilla japonica의 실뱀장어 단계(평균 전장: 6.5 cm)에서 어린 뱀장어(치만) 단계까지 다양한 수온별 (20, 24 및 28℃) 조건에서 4개월간 사육하여 성비를 조사한 결과 본 연구에서 설정한 수온 영역에서는 암컷 비율의 증가 효과는 없었으나, E2 경구투여에 의한 자성화 유도 효과는 증가하였다. 또한 수온 24℃ 실험구에서 E2 경구투여에 의한 성장률 효과는 오히려 억제되었다.

어류의 성결정은 기본적으로는 유전적으로 결정되지만(유전적 성결정) 대부분의 어종에서 자어기(생식선의 형태적 성분화 이전)의 환경 수온이 성결정에 영향을 미친다고 알려져 있다[7, 23]. 넙치, Paralichthys olivaceus의 경우 생식선의 형태적 성분화가 나타나는 12~30 mm 시기에 25~27.5℃에서 사육하면 유전적 암컷이 생리적 수컷으로 발현한다고 보고하고 있으며[17, 32], 차넬메기, Ictalus punctatus는 고수온 사육에서 암컷 비율이 유의적으로 증가한다고 보고하고 있다[7]. 또한 사육 수온 차이에 의한 성비 연구 결과를 보면 조피볼락, Sebastes schlegeli의 경우 20~22℃ 사육 수온 보다 24℃ 수온에서 암컷 비율이 높다는 보고[22], 이와는 반대로 남미에 서식하는 영명, pejerrey, Odontesthes argentinensis와 guppy, Poecilia reticulate에서는 낮은 사육 수온 일수록 암컷 비율이 높게 나타난다고 보고하였다[10, 26]. 따라서 온대역과 같이 뚜렷한 계절을 거치는 지역에 서식하는 경골어류의 경우 1년 중 특정 시기에 산란하는 생식년 주기를 가질 뿐만 아니라 특정 사육 수온이 성결정의 중요한 인자라는 것을 알 수 있다.

극동산 뱀장어에 있어서 사육 수온에 의한 성분화 유도에 관한 연구 결과는 없지만, 자연에서 전장 20 cm 전후의 시기에 생식선의 형태학적 분화가 시작되어, 암 ·수컷 특유의 생식소 구조를 나타내기 시작한다고 보고하고 있으나[1, 4], 성결정 유전자에 의해 성이 명료하게 결정되는 것이 아니라 환경적 요인(수온, 밀도, 염분, 광주기 등) 혹은 사회적 요인에 의해 성이 편향되어 나타난다고 보고하였다[2, 18]. 또한 유럽산 뱀장어, A. anguilla의 경우 따뜻한 수온에서 사육하면 수컷으로 유도된다는 결과[3]와 이와 반대로 수온을 점점 증가시킴에 따라 암컷 비율이 유의적으로 증가한다는 보고[9]와 같이 동일 어종에 있어서도 서로 상반되는 연구 결과를 보고하고 있어 유럽산 뱀장어의 경우 수온에 의한 암컷으로의 성분화 영향은 아직 논쟁이 계속되고 있다. 한편 본 연구 결과에서 극동산 뱀장어의 경우 생식선의 형태적 성분화 이전 단계인 실뱀장어를 다양한 사육 수온에서 성분화가 일어나는 전장 20 cm 전후까지 사육시 수온에 의한 암컷 비율 증가 효과는 없었다. 따라서 극동산 뱀장어에 있어서 수온에 의한 암컷 성분화 유도 효과는 관찰할 수 없었으며, 대서양 뱀장어(유럽산 뱀장어와 북미산 뱀장어, A. rostrata)에서는 사육 밀도 등이 성비에 영향 미친다는 연구[3, 18]를 토대로 극동산 뱀장어에 있어서 수온 이외의 다른 환경 인자(사육 밀도, 염분 등)에 의한 효과적인 암컷 유도 연구가 수행되어야 할 것이다.

성호르몬 처리에 의한 유전적 암컷의 수컷화 유도 혹은 유전적 수컷의 암컷화 유도에 관한 연구는 다양한 어종에서 보고되어 있지만, 호르몬 처리 시기는 생식소의 형태학적 성분화 이전인 자어기에 한정되며, 정소 및 난소로 분화 후에는 호르몬 처리에 의한 성제어는 불가능하다고 보고되었다[7, 23]. 앞선 우리 연구결과에서도 전장 13 cm의 어린 뱀장어 단계에 estradiol-17ß (E2) 경구 투여에 의한 자성화 유도율 보다 입붙임 단계가 끝난 전장 6 cm의 실뱀장어 단계에서 자성화 유도율이 유의적으로 높았으며[14], 본 연구에서도 입붙임 단계가 끝난 실뱀장어 단계에 E2 경구 투여에 의한 자성화 유도율은 유사하였으나, 수온 24 및 28℃ 사육 실험구에 있어서 E2 경구투여에 의한 자성화 유도율은 90%에서 93.3%로 28℃에서 조금 높게 나타났고 생존율에는 81%에서 72%로 28℃에서 소폭 감소하는 것으로 나타났다. 20℃ 실험구에서 자성화 유도율과 생존율이 낮게 나타난 것은 낮은 사육 수온에 의한 생리적 이상으로 추측하였으나, 수온 변화에 따른 실뱀장어의 이석 성장을 조사한 보고에서는 5~25℃ 사이의 거의 모든 실험온도에서 100%에 가까운 생존율을 나타내었던 것을 보면 [8] 20℃ 실험구의 낮은 생존율에는 다른 요인이 관여하였을 가능성이 높을 것으로 추측된다. 또한 다른 수온 실험구에 비해 낮은 자성화율은 아마도 낮은 사육 수온에서 사료 섭이율이 낮았기 때문일 것으로 추측된다.

본 연구에서 수온 28℃ 실험구의 E2-free와 E2 투여구 간의 성장률을 비교한 결과 실험 기간 중인 127일(약 4개월)과 실험 종결 후 동량의 E2-free의 일반 배합 사료로 공급하여 2개월 더 사육 후(178일)의 유의적인 성장률 차이는 없었다. 극동산 뱀장어에 관한 선행연구에서 수온 28℃의 사육 실험 기간 전후로 E2-free와 E2 투여 개체의 성장률의 유의적 차이는 없었다[14, 28]. 또한 타 어종 농어목(Centrachidae) 어류인 Bluegill sunfish, Leponis macrochirus, 치어를 일반적인 사육 수온인 23℃에 2개월간 고농도 E2 (100 mg/kg diet) 처리에 의한 자성화 유도 효과는 100% 였지만 성장률은 대조구에 비해 유의적으로 낮았으며[31], 대서양 연어, Salmo salar, 치어의 경우에서는 성호르몬 경구 투여에 의한 성장률은 대조구보다 낮았지만 유의적인 차이는 없다고 보고하였다[16].

본 연구 결과 극동산 뱀장어에 있어서 최적 수온 영역(28℃) 보다 낮은 사육 수온(24℃) 조건에서 실험기간 중 E2 투여 개체와 E2-free 개체 간의 유의적인 성장률 차이는 없었지만, E2 급여 종결 50일 후인 178일째에는 E2 투여개체의 성장률은 유의적으로 낮았다. 또한 혈중 E2 농도는 실험기간 중인 127일 (약 4개월)까지 E2-free 개체 보다 E2 투여 개체에서 유의적으로 높았다. 그러나 E2급여 종결 후인 178일째 20℃와 28℃ 실험구에 있어서 E2 투여 개체의 혈중 E2 농도는 급격히 감소하였지만 24℃ 실험구의 E2 투여 개체 혈중 E2 농도는 여전히 유의적으로 높았다. 극동산 뱀장어를 포함한 경골어류에 있어서 난소 내 스테로이드 생산(steroidogenesis)은 사육 수온에 의존하여 수온이 높을수록 스테로이드 대사 과정이 빨라진다고 보고하고 있고[11], 또한 넙치, Paralichthys olivaceus 치어에서도 낮은 수온(20℃)에서 사육한 개체 보다 높은 수온(28℃) 에서 사육한 개체의 체내 E2 농도가 유의적으로 낮다고 보고 하였다[27]. 이러한 선행 연구 결과를 토대로 본 연구 결과에서도 수온 24℃ 사육 개체 보다 고수온인 28℃ 사육 개체의 혈중 E2 농도가 감소되었던 이유도 보다 높은 수온에서 스테로이드 대사 과정이 빨리 진행되어 감소 현상을 나타낸 것으로 추측되며, 반대로 수온 24℃ 실험구에서 E2 투여 개체의 높은 혈중 E2 농도로 인해 오히려 성장률 감소를 유발하였다고 추측된다. 앞으로 극동산 뱀장어에 있어서 E2와 성장률에 관한 심도있는 연구가 진행되어야 할 뿐만 아니라 사육 수온 이외에 사육 밀도, 염분 등의 환경요인에 의한 성분화 유도 효과에 관한 연구도 수행 되어야 할 것이다.