Clonality analysis of fibroblast proliferation in patients with idiopathic pulmonary fibrosis

특발성 폐섬유증 환자에서 폐 섬유모세포 증식의 클론성에 관한 연구

Background/Aims: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is defined pathologically by usual interstitial pneumonia (UIP), and contains characteristic discrete areas of fibroblasts, myofibroblasts, and newly formed collagen, termed "fibroblast foci". A new hypothesis postulates that IPF results from epithelial injury and abnormal wound repair without preceding chronic inflammation. We explored the hypothesis that fibroblasts in the fibroblast foci of IPF undergo neoplastic monoclonal proliferation rather than reactive polyclonal proliferation. Methods: We obtained fibroblasts from 24 fibroblast foci in seven female patients with IPF, endothelial cells from ten plexiform lesions of two female patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension (IPAH) as a positive control for monoclonality, and lung parenchymal cells by microdissection of each formalin-fixed paraffin-embedded block of lung. To analyze clonality, we performed the human androgen-receptor gene methylation assay (HUMARA). DNA released by protein K digestion was subjected to polymerase chain reaction (PCR) amplification with prior digestion with and without the methylation-sensitive restriction enzyme HhaI. Then, we calculated the clonality ratio after electrophoretic analysis of the PCR amplification product. A clonality ratio <0.25 was considered evidence of monoclonal proliferation. Results: All of the patients included, i.e., the seven females with IPF and the two females with IPAH, showed polymorphism in the human androgen-receptor gene. The mean clonality ratio of the 24 fibroblast foci was 0.70 (SD: 0.18). All of the fibroblast foci had clonality ratios >0.25, suggesting polyclonality, whereas 7 of 10 plexiform lesions had clonality ratios <0.25 suggesting monoclonality. Conclusions: The polyclonality of the fibroblast foci in IPF suggests that the fibroblast proliferation in IPF is not neoplastic, but is reactive in nature.

목적: 특발성 폐섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)의 조직학적 소견인 usual interstitial pneumonia (UIP)는 섬유모세포 집단병소(fibroblast foci) 형성이 특징이다. 특발성 폐섬유증은 폐포염(alveolitis)으로 시작된 폐조직의 염증반응이 중요한 병인으로 여겨져 왔으나, 최근에는 폐 상피세포 손상에 대한 치유과정의 이상으로 처음부터 섬유화가 진행한다는 가설이 대두되었다. 본 연구는 특발성 폐섬유증환자의 섬유모세포 집단병소를 구성하는 섬유모세포가 신생물(neoplasm)과 같이 단일클론성(monoclonal) 증식을 하는지 여부를 검증하였다. 방법: 일곱 명의 특발성 폐섬유증 여자 환자에서 개흉폐생검을 통해 얻은 폐 조직의 파라핀 블록을 사용하여 현미해부(microdissection) 방법으로 섬유모세포 집단병소에서 증식된 섬유모세포들을 분리하였다. 단일클론성 검정의 양성대조로는 특발성 폐동맥 고혈압 환자에서 관찰되는 총상병변(plexiform lesion)내 '증식된 혈관내피세포'를 이용하였다. 클론성 분석은 인간 남성호르몬 수용체 유전자 메틸화 검사(human androgen-receptor gene methylation assay, HUMARA) 방법을 이용하였다. 현미해부로 얻은 조직을 proteinase K buffer 처리 후 제한 핵산내부가수분해효소(Restriction endonuclease) HhaI로 분해한 조직과 분해하지 않은 조직을 각각 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하였다. 증폭된 중합효소연쇄반응 생성물은 6% denaturing polyacrylamide sequencing gel로 전기영동 후 자가방사기록법(autoradiography)으로 분석하였다. 클론 비(Clonality ratio)는 검체의 대립유전자 불활성화 비(allele inactivation ratio)를 폐실질의 대립유전자 불활성화 비로 나누어 구하였다. 결과: 특발성 폐섬유증 일곱 예로부터 모두 24개의 섬유모세포 집단병소에 대해 섬유모세포 증식의 클론성 분석을 시행하였다. 24개 병변의 클론 비는 $0.70{\pm}0.18$ (평균${\pm}$표준편차) (범위 0.37~0.97)로 불균형 메틸화(unbalanced methylation, clonality ratio<0.25)를 보인 예는 없이 모두 다클론성이었다. 한편, 단일클론성의 양성 대조로 2예의 특발성 폐동맥 고혈압에서 10개의 총상병변내 내피세포의 클론성을 분석하였으며, 이 중 7개가 불균형 메틸화(clonality ratio<0.25)를 보여 단일클론성임을 확인하였다. 결론: 특발성 폐섬유증 환자 폐의 섬유모세포 집단병소를 구성하는 섬유모세포 증식은 다클론성임을 알 수 있었다. 즉, 특발성 폐섬유증 환자에서 폐 섬유모세포 증식은 창상치유에서와 같은 반응성과형성에 의한 것으로 여겨진다.