패브리병(Fabry) 진단을 위한 혈장 중 Globotriaosylceramide (Gb3)의 탠덤매스 분석법 개발과 임상 응용

Determination of plasma C16-C24 globotriaosylceramide (Gb3) isoforms by tandem mass spectrometry for diagnosis of Fabry disease

목 적 : 패브리병은 X-linked 지질 축적 질환으로 ${\alpha}$-galactosidase A (${\alpha}$-Gal A)의 결손으로 인해 스핑고당지질인 Gb3의 세포내 축적을 일으키는 병이다. 혈장 중 Gb3 측정은 패브리병 환자의 효소대체요법 후의 모니터링이나 진단에 임상적 의의가 크므로 ESI-MS/MS를 이용한 시료 전처리를 위한 노동력이 덜 들면서 간단, 신속, 고감도로 정량할 수 있는 혈장 중 Gb3분석법을 개발하고자 하였다. 방 법 : 혈장을 디옥산으로 50배 희석하여 vortex-mix 및 원심분리를 거쳐 Gb3의 추출 및 분리를 수행한다. 이 때 내부표준액인 C17:0 Gb3를 혈장에 처음부터 첨가한다. 희석과 원심분리된 혈장은 가드컬럼을 통하여 ESI-MS/MS의 다중성분 모니터링 모드에서 분석하여 내부표준액에 대한 8종 Gb3 isoform의 피크면적비를 이용하여 정량한다. 결 과 : 혈장의 바탕성분 하에서 8종의 Gb3 isoform이 완전히 잘 분리됨을 확인할 수 있었다. 혈장 중의 8종의 Gb3 isoform 중 50% 이상 차지하는 종류는 C16:0 Gb3 임이 확인되었다. Gb3 isoform이 직선성을 이루는 농도 범위는 0.001-1.0 ${\mu}g$/mL이었다. 검출한계(S/N=3)는 C16:0 Gb3의 경우 0.001 ${\mu}g$/mL 이었고 정량한계는 0.01 ${\mu}g$/mL 이었으며 회수율의 일내재현성(정확도 87-108%와 정밀도 7% 이하)과 일간재현성(정확도 87-110%와 정밀도 13% 이하)은 매우 양호 하였다. 결 론 : 본 연구에서 개발된 Gb3 분석법은 신속, 정확, 간편하게 패브리병의 1차 스크리닝이나 효소대체요법 전후의 모니터링 및 진단에 유용하게 적용될 수 있을 것이다.

Purpose : A simple, rapid, and highly sensitive analytical method for Gb3 in plasma was developed without labor-ex tensive pre-treatment by electrospray ionization MS/ MS (ESI-MS/MS). Measurement of globotriaosy lceramide (Gb3, ceramide trihex oside) in plasma has clinical importance for monitoring after enzyme replacement therapy in Fabry disease patients. The disease is an X-linked lipid storage disorder that results from a deficiency of the enzyme ${\alpha}$-galactosidase A (${\alpha}$-Gal A). The lack of ${\alpha}$-Gal A causes an intracellular accumulation of glycosphingolipids, mainly Gb3. Methods : Only simple 50-fold dilution of plasma is necessary for the extraction and isolation of Gb3 in plasma. Gb3 in diluted plasma was dissolved in dioxane containing C17:0 Gb3 as an internal standard. After centrifugation it was directly injected and analyzed through guard column by in combination with multiple reaction monitoring mode of ESI-MS/MS. Results : Eight isoforms of Gb3 were completely resolved from plasma matrix. C16:0 Gb3 occupied 50% of total Gb3 as a major component in plasma. Linear relationship for Gb3 isoforms w as found in the range of 0.001-1.0 ${\mu}g$/mL. The limit of detection (S/N=3) was 0.001 ${\mu}g$/mL and limit of quantification was 0.01 ${\mu}g$/mL for C16:0 Gb3 with acceptable precision and accuracy. Correlation coefficient of calibration curves for 8 Gb3 isoforms ranged from 0.9678 to 0.9982. Conclusion : This quantitative method developed could be useful for rapid and sensitive 1st line Fabry disease screening, monitoring and/or diagnostic tool for Fabry disease.