Abstract
Gap junction is an ion channel forming between adjacent cells. It also acts as a membrane channel like sodium or potassium channels in a single cell. The amino acid residues up to the $10^{th}$ position in the amino (N)-terminus of gap junction hemichannel affect gating polarity as well as current-voltage (I-V) relation. While wild-type Cx32 channel shows negative gating polarity and inwardly rectifying I-V relation, T8D channel in which threonine residue at $8^{th}$ position is replaced with negatively charged aspartate residue shows reverse gating polarity and linear I-V relation. It is still unclear whether these changes are resulted from the charge effect or the conformational change of the N-terminus. To clarify this issue, we made a mutant channel harboring cysteine residue at the $8^{th}$ position (T8C) and characterized its biophysical properties using substituted-cysteine accessibility method (SCAM). T8C channel shows negative gating polarity and inwardly rectifying I-V relation as wild-type channel does. This result indicates that the substitution of cysteine residue dose not perturb the original conformation of wild-type channel. To elucidate the charge effect two types of methaenthiosulfonate (MTS) reagents (negatively charged $MTSES^-$ and positively charged $MTSET^+$) were used. When $MTSES^-$ was applied, T8C channel behaved as T8D channel, showing positive gating polarity and linear I-V relation. This result indicates that the addition of a negative charge changes the biophysical properties of T8C channel. However, positively charged $MTSET^+$ maintained the main features of T8C channel as expected. It is likely that the addition of a charge by small MTS reagents does not distort the conformation of the N-terminus. Therefore, the opposite effects of $MTSES^-$ and $MTSETT^+$ on T8C channel suggest that the addition of a charge itself rather than the conformational change of the N-terminus changes gating polarity and I-V relation. Furthermore, the accessibility of MTS reagents to amino acid residues at the $8^{th}$ position supports the idea that the N-terminus of gap junction channel forms or lies in the aqueous pore.
간극결합은 이웃하는 두 세포 사이에 형성된 이온채널이며 또한 단일세포막에서도 작용한다. 간극결합채널을 형성하는 아미노 말단의 10번째 아미노산 잔기 부위까지가 개폐극성(gating polarity)과 전류-전압관계에 영향을 미친다. 정상적인 Cx32 채널은 음성의 개폐극성과 내향적인 정류현상을 보이는 반면, 음성전하를 띠는 aspartate로 치환된 T8D 채널은 반대의 개폐극성과 직선의 정류현상을 보인다. 이러한 개폐극성과 정류현상의 변화가 전하 자체에 의한 것인지 아니면 아미노 말단의 구조적인 변화에 의한 것인지는 아직 불명확하다. 이러한 문제점을 규명하기 위하여 아미노 말단의 8번째 아미노산 잔기를 cysteine기로 치환시킨 T8C 채널을 만들어 substituted-cysteine accessibility method (SCAM) 방법으로 이 채널의 생물리학적 특성을 조사하고자 하였다. T8C 채널은 정상적인 Cx32 채널처럼 음성의 개폐극성과 내향적인 정류현상을 보였으며, cysteine기로 치환이 정상적인 Cx32 채널의 원래 구조를 변화시키지 않았다는 것을 의미한다. 본 연구에서는 이런 전하효과를 규명하기 위하여 음성 전하를 갖는 MTSES-와 양성전하를 갖는 MTSET+를 사용하였다. MTSES-를 처리하면 T8C 채널은 T8D 채널의 특성처럼 양성의 개폐극성과 직선의 정류현상을 보였다. 그러나 양성전하를 갖는 MTSET+를 처리한 경우에는 T8C 채널은 본래의 특성을 그대로 유지하였다. 작은 분자의 MTS에 의해서 부여된 전하가 아미노 말단의 구조적인 변화를 초래하지는 않을 것으로 생각된다. 따라서 반대의 전하를 띠는 MTSES-와 MTSET+가 서로 상반대는 영향을 미치는 것으로 보아 본 연구에서 관찰된 개폐극성과 전류-전압의 변화는 아미노말단의 구조적인 변화라기보다는 MTS에 의해서 부여된 전하 자체에 기인한다고 할 수 있다. 또한 MTS가 아미노말단의 8번째 부위에 접근하여 반응을 일으킬 수 있다는 결과는 간극결합채널의 아미노말단이 채널의 통로(pore)를 형성한다는 가설을 뒷받침한다.
