Abstract
An antagonistic bacterial isolate, that inhibits the growth of plant pathogens, was selected and identified from 5,000 isolates screened from the rhizosphere of various crop plants. An isolate Bacillus sp. N32, tested against Colletotrichum gloeosporioides causing anthracnose disease in hot pepper, produced both a heat resistant antifungal protein and a heat sensitive antifungal protein. The heat resistant protein was partially purified by Ammonium sulfate fractionation and gel filtration chromatography. The bioautography showed that the proteins possessed high antifungal activity. The biosynthetic gene cluster responsible for the heat resistant antifungal protein was cloned from cosmid library using DNA probe obtained from PCR product with the primers targeting the conserved nucleotide sequence of the synthetic genes reported earlier, Most of the clones obtained showed higher homology to fengycin antibiotic synthetic gene family reported earlier. On the other hand, the heat sensitive protein was isolated from SDS-PAGE and electroblotting to determine the N-terminal amino acid sequences. The heat sensitive antifungal protein gene was cloned from the ${\lambda}-ZAP$ libraries using a DNA probe based on the N-terminal amino acid sequences of the heat sensitive protein. We are contemplating to clone and sequence the whole gene cluster encoding the heat sensitive protein for further analysis.
작물 근권 토양으로부터 분리한 5,000여 길항 균주로부터 Erwinia 및 Pseudomonas등의 세균과 Trichoderma, Colletotrichum 등 곰팡이의 성장을 동시에 억제하는 Bacillus sp. N 32 균주를 선발 동정 하였다. 특히 Bacillus sp. N32 균주는 고추 탄저병균인 Colletotrichum gloeosporioides에 대하여 열에 저항성이 있는 단백질과 열에 민감한 단백질의 2종류의 항균 단백질을 동시에 생산함을 단백질 침전과 활성 검정을 통하여 확인하였다. 이 항균 단백질들을 FPLC를 이용한 gel filtration chromatography방법으로 분리한 후 SDS-PAGE와 bioautography로 항균력을 확인하였다. 또한 이 항균 단백질의 유전자들을 선발하기 위하여 기존의 알려진 그람양성 세균의 대표적인 열 저항성 항균 펩타이드 생합성 유전자 서열을 primer로 이용한 PCR 방법으로 fengycin의 생합성 유전자 단편을 분리하고 이 PCR 산물을 이용하여 Bacillus sp. N32 균주의 cosmid library로부터 fengycin의 생합성 유전자 cluster중 일부를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 또한 열에 민감한 항균 단백질 생산 유전자는 이 항균 단백질을 SDS-PAGE 및 electroblotting으로 분리한 뒤 N-terminal 부위의 15개의 아미노산 서열을 분석하고 이를 DNA 염기배열로 치환한 다음 probe로 이용하여 ${\lambda}-ZAP$ library로부터 항균 단백질 생산 유전자가 포함된 다수의 clone을 선발하였다.