ISOLATION AND IDENTIFICATION OF LACTOBACILLUS SALIVARIUS INHIBITING THE FORMATION OF ARTIFICIAL PLAQUE AND THE PRODUCTION OF VOLATILE SULFUR COMPOUNDS

치태 형성과 휘발성 유황화합물 생성을 억제하는 Lactobacillus salivarius의 분리 및 동정

There are normal inhabitants doing medically useful functions in the body. There are many kinds of bacteria performing specific functions in the oral cavity. Two strains of lactic acid bacteria were isolated from inhabitants of caries-free children's oral cavity, which inhibited the formation of artificial plaque by Streptococcus mutans and the production of volatile sulfur compounds by anaerobic bacteria. The isolates were identified by the test using API 50 CHL medium kit and 16S rDNA partial sequencing. 1. Two isolates were Gram-positive bacilli and produced hydrogen peroxide. 2. When Streptococcus mutans was cultured in the media, the mean weight of formed artificial plaque on the orthodontic wires was $124.4{\pm}30.4\;mg$, whereas being reduced to $5.2{\pm}2.0mg$ and $10.6{\pm}6.6mg$ in the media cultured with Streptococcus mutans and each isolate, respectively (p<0.05) 3. The number of viable cells of Streptococcus mutans was $3.4{\times}10^9$ per ml in the cultured solution, whereas those of Streptococcus mutans in the combined culture with each of isolates were $4.6{\times}10^8\;and\;2.4{\times}10^8$ per ml. 4. The optical density was 1.286 in the supernatant of Fusobacterium nucleatum after vortexing for 30minutes, whereas in the supernatant of combined Fusobacterium nucleatum and each isolate, they were reduced to 0.628 and 0.497, which the percentages of coaggregation between them were 29.4% and 57.8%, respectively 5. The optical density of Fusobacterium nucleatum precipitate was 1.794 in the culture media containing cysteine and $FeSO_4$, being reduced to 1.144 and 0.915 in the coaggregated precipitates of Fusobacterium nucleatum and each isolate. The optical density of Porphyromonas gingivalis precipitate was 1.932 in the culture media, being reduced to 1.170 and 1.266 in the coaggregated precipitates of Porphyromonas gingivalis and each isolate. 6. When two isolates were tested with API 50 CHL medium kit, those were identified Lactobaciallius salivarius and Lactobaciallius delbrueckii subsp. lactis. 7. The similarity values of 16S rDNA sequence between each of isolates and Lactobaciallius salivarius subsp. salicinius were 99.60% and 99.73%, respectively, meaning that isolates were Lactobaciallius salivarius subsp. salicinius. These results indicated that two strains isolated from caries-free children's saliva, which inhibited the formation of artificial plaque and the production of volatile sulfur compounds, were identified as Lactobaciallius salivarius subsp. salicinius.

우리 인체에는 의학적으로 유용한 기능을 가진 세균들이 정상적으로 존재하며 구강내에도 독특한 기능을 나타내는 세균들이 상재한다. 본 연구에서는 치아우식증이 없는 소아의 타액에서 분리한 유산균 2주가 Streptococcus mutans에 의한 인공치태 형성과 혐기성 세균에 의한 휘발성 유황화합물 생성을 억제하는 것을 확인하고, API 50 CHL medium kit를 이용한 생화학적 검사와 16S rDNA sequencing으로 동정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 분리균주는 2주 모두 그람양성 간균으로 과산화수소를 생성하였다. 2. 인공치태의 무게는 Streptococcus mutans의 단독 배양시 $124.4{\pm}30.4mg$이었으나, 분리균주와 병합 배양시에는 각각 $5.2{\pm}2.0mg,\;10.6{\pm}6.6mg$으로 현저하게 감소하였다(p<0.05). 3. Streptococcus mutans의 생균수는 단독 배양시 ml당 $3.4{\times}10^9$이었으나, 분리균주와 병합 배양시에는 각각 ml당 $4.6{\times}10^8$과 $2.4{\times}10^8$으로 감소하였다. 4. Fusobacterium nucleatum을 30분간 진탕한 후 측정한 상청액의 흡광도는 1.286이었으나, Fusobacterium nucleatum과 분리균주를 병합으로 30분간 진탕한 후 측정한 상청액의 흡광도는 각각 0.628과 0.497로 감소하였으며, 상호 결합 정도는 29.4%와 57.8%이었다. 5. Fusobacterium nucleatum의 단독 배양시 cysteine과 $FeSO_4$를 첨가한 배지를 가한 후 측정한 침전물의 배지 흡광도는 1.794이었으나, 분리균주와 병합 배양시 측정한 침전물의 배지 흡광도는 각각 1.144와 0.915로 감소하였으며, Porphyromonas gingivalis 단독 배양시 침전물의 배지 흡광도는 1.932이었으나 분리균주와 병합 배양시에는 침전물의 배지 흡광도가 각각 1.170과 1.266으로 감소하였다. 6. 분리균주를 API 50 CHL medium kit로 탄수화물 발효검사를 시행한 결과, 분리균주 1주는 Lactobacillus salivarius로, 다른 분리균주는 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis로 동정되었다. 7 분리균주를 16S rDNA partial sequencing으로 동정한 결과, 2주 모두 Lactobacillus salivarius subsp. salicinius와 유전자 유사치가 99.60%, 99.73%를 보여 Lactobacillus salivarius subsp. salicinius로 동정되었다. 이상의 결과를 종합하면 치아우식증이 없는 소아의 타액에서 분리된 유산균 중 과산화수소를 분비하여 인공치태 형성과 휘발성 유황화합물 생성을 억제하는 분리균주는 Lactobacillus salivarius subsp. salicinius로 동정되었다.