Characterization of T7 RNA Polymerase Transcription Elongation Complex in Sequence-specific Transcription Termination

염기서열 특이적 전사종결부위에서 T7 RNA 중합효소 전사연장복합체 특성에 관한 연구

T7 RNA polymerase is a single subunit RNA polymerase able to accomplish whole transcription process without auxiliary factors. In order to study transcription elongation mechanism of phage T7 RNA polymerse, stepwise walking of RNA polymerase was established by immobilizing biotinylated DNA template with streptavidin bead, series of active and stable elongation complexes were obtained, Transcripts were radio isotope labeled at the 16thm 17th and 18th nucleotide residues so stable elongation transcription complex of T7 RNA polymerase containing 22-40 nucleotide residues could be identified. We identified the positions of stablely formed transcription elongation complexes of termination site in intrinsic hairpin-independent PTH terminator sequence through the established stepwise walking of wild-type of mutant R173C T7 RNA polymerases. The results suggest that stable elongation transcription complexes were at the site of passing PTH terminator signal by mutant R173C RNA polymerase.

박테리오 파아지 T7 RNA 중합효소는 다른 RNA 중합효소와 비교하여 볼 때 보조인자 없이 전사를 진행하는 하나의 subunit로 구성된 RNA 중합효소이다. 전사 진행 단계 중에서 T7 RNA 중합효소의 전사연장을 연구하기 위해 biotin이 결합된 DNA 주형을 streptavidin bead로 고정시킴으로서 T7 RNA 중합효소의 진행과정을 관찰할 수 있었고, 이러한 기작을 이용하여 일련의 활성을 가지는 가장 안정한 전사연장복합체들을 얻을 수 있었다. 전사 연장체들은 16번 염기 위치로부터 18번 염기의 위치까지 방사선 동위원소가 표지되어 있으며 이들 표지된 전사연장복합체들은 단계별로 합성하여 22-40개 핵산잔기들이 합성된 전사연장복합체들을 얻을 수 있었다. 이와 같은 전사연장복합체들을 PTH 전사종결 부위가 있는 주형으로 사용하여 야생형 및 R173C 돌연변이 RNA 중합효소를 이용하여 전사연장복합체를 제조하여 비교한 결과 PTH 전사종결에 둔감한 R173C 돌연변이 중합효소의 경우 야생형에 비해 PTH 전사종결부위를 지난 위치에서도 전사연장복합체가 생성되었다.