Abstract
Recombinant E. coli DH5 ${\alpha}$/pSB311 was made by cloning the genes encoding bacterial luciferase and aldehyde substrate proteins from Photohabdus luminescense, to complement defects of Lumistox, which is normally used in bioassays to monitor toxic substances in water environmental systems. The conditions for stable light production by the recombinant strains were investigated with respect to cell growth stage, cell number, and buffer conditions. The optimum growth stage was a middle-exponential stage with an OD$_{660nm}$ value of 0.6-0.7. ADout 10$^{6}$-10$^{7}$ cells per test tube was optimum for stable light emission. The effect of buffer was not significant if an optimum viable cell number was maintained. The bioluminescence of the recombinant E. coli harboring the lux operon of Photohabdus luminescense was not affected by temperature, while the bioluminescence of Lumistox was temperature sensitive. The recombinant E. coli was more sensitive to heavy metals (Cd, Cu, Hg, Zn) than Lumistox, because it does not require high concentrations of NaCl in the buffer.
수환경에 영향을 미치는 독성물질을 확인하기 위한 생물학적 경보장치로 현재 상용화된 Lumistox의 단점을 보안하기위해, Photohabdus luminescence의 lux CDABE 유전자가 응합되어 기질첨가의 번거러움이 없는 재조합 E. coli DH5$\alpha$/pSB311을 제조하였다. 적정 생장 상태와 생균수, 발광 측정 완충용액들을 중심으로 재조합 S. coli DH5$\alpha$/pSB311의 발광 안정화 조건을 조사한 결과, 적정 세포수가 유지되면 측정 완충용액은 그 종류에 크게 영향을 받지 않으며, O $D_{660nm}$ 0.6~0.7 정도의 middle-exponential stage까지의 cell age를 가지고 $10^{6}$-$10^{7}$ 정도 희석한 세포수가 가장 안정화된 발광량을 보여 주는 것으로 확인되었다. 온도에 따른 재조합 E. coli와 Lumistox의 발광량의 변화를 살펴보면, Lumistox는 15$^{\circ}C$에서는 안정하나 실온(25 ~ 3$0^{\circ}C$)에서는 급격하게 발광량이 감소하는 현상을 보이는 반면, E. coli DH5$\alpha$/pSB311은 Photohabdus luminescence의 lux operon을 함유함으로써 온도에 대한 영향을 많이 받지 않음을 확인하였다. 그리고 재조합 E. coli와 Lumistox의 중금속에 대한 독성정도를 EC값으로 산출하였다. Cd, Cu, Hg, Zn에 대해서 E. coli DH5$\alpha$/pSB311은 Lumistox보다 더 민감하거나 유사한 반응을 보였다. 이는 Lumistox의 성장과 발광을 안정화시켜 주는 고농도의 salt에 의한 민감도의 저하에 따른 현상으로, 광산이나 공장폐수와 같은 수계의 중금속 독성도를 측정하기 위한 생물경보장치로 사용하기에는 해양 발광 미생물을 이용하기보다는 재조합 E. coli가 더 효과적임을 알 수 있었다.
