초록
방선균에 존재하는 단백질 타이로신 포스파타아제의 기능을 알아보기 위하여 우선 이 유전자를 대장균에 클로닝하여 대량으로 발현시킨 결과, 발현된 단백질은 soluble형태로 존재하여 자신의 효소활성을 가지고 있었으나, 효소활성부위에 대한 변이주의 경우에는 기질과 결합은 하였으나 활성이 없는 것으로 나타났었다. 방선균에서 이 효소의 세포내 기작 및 결합 단백질을 파악하기 위해 대장균에 클로닝한 유전자를 방선균 발현벡터(pIJ6021)에 클로닝을 하였다. 이렇게 만든 유전자를 in-ducer인 thiostrepton을 이용하여 발현시킨 결과, 활성형의 단백질 타이로신 포스파타아제가 대량으로 생산되었다. 그리고 이들 유전자를 방선균에서 과잉 발현시킨 결과 항생제 생산 및 형태 변화 등의 표현형은 나타나지 않았다. 이효소와 반응하는 기질 및 결합 단백질을 찾기 위해서 이들과 결합은 하지만 반응하지 않는 돌연변이 단백질 타이로신 포스파타아제 (PtpA(C9S))를 유전자 조작하여 방선균에서 과잉 발현시켰다 그 결과 표현형은 없었지만 인산 타이로신 단백질의 패턴변화를 알 수 있었고, 단백질 타이로신 포스파타아제에 의하여 인산화 조절되는 단백질 3개 찾을 수 있었다. 이들 세 단백질(p65, p90 그리고 p200)은 ptpA(C9S)가 발현된 방선균에서 보다 더 많은 인산화 패턴을 나타내었으며, 이들은 가능한 단백질 타이로신 포스파타아제의 표적이라고 생각되었다. 만약 이들의 구조가 밝혀진다면, 방선균의 타이로신 포스파타아제의 기능 및 신호전달 과정의 역할을 파악할 수 있으리라 생각된다.
The cloning and expression of Phosphotyrosine Protein Phosphatase into E. coli provides important tools of understanding of its functions and signal transduction mechanisms. The abundant soluble protein of the Phosphotyrosine Protein Phosphatase A (PtpA) and the active site mutant PtpA(C9S) were produced using the expression vector pET26 in E. coli and pIJ6021 with the thiostrepton in S. lividans. The enzyme activity of both proteins extracted by Ni-NTA column had same results from the expression vector pET26 and pIJ6021. The enzyme activity of phosphatase was found in the protein of PtpA, but not in that of C9S. The western blot detected by penta His-tag antibody resulted in the inducer, thiostrepton was not a good trigger to induce a large amount of PtpA protein. The overexpression of both proteins had no significantly different effect on the A factor cascade related to the secondary metabolite and mycelium formation between PtpA and C9S. However, overproduction of PtpA protein using pIJ6021 in S. lividans brought about a dramatic decrease in the amount of phosphotyrosine proteins (p200, p90, and p65), but no significantly phenotypic variation in S. lividans. This indicates that PtpA has an important proteome role in signal transduction mechanism of producing massive amount of phosphotyrosine protein in Streptomyces sp.
