고농도 Heme-iron의 생산을 위한 Hemoglobin의 가수분해 및 분리 조건

Conditions of Hemoglobin Hydrolysis and Separation for the Production of Enriched Heme-iron

Hemoglobin(Hgb)의 효소 가수분해액으로부터 고농도 heme-iron의 분리에 영향을 주는 기질의 농도, 가수분해도 (DH, degree of hydrolysis) 및 분리 pH의 효과 등을 조사하였으며, pilot scale에서 고농도 heme-iron을 생산하였다. 최적 반응조건(pH 10.0, $50^{\circ}C$, 5 hr)에서의 Esperase에 의한 Hgb의 DH는 $24{\sim}25%$였다. Hgb의 농도는 heme-iron의 분리에 영향을 미쳐서 Hgb의 농도가 2.5%, 5.0%, 10.0%로 증가할수록 heme-iron/peptide(heme-iron의 분리도)는 각각 47.4%, 35.6%, 21.8%로 감소하였으며, 이에 따라 농축율도 감소하였다. Hgb의 가수분해액으로부터 고농도 heme-iron의 분리에 효율적인 pH 영역은 DH에 따라 달라졌으며, DH가 6.3%의 경우는 pH $5.0{\sim}6$에서 heme-iron/peptide의 비가 8.92%, DH가 14.5%인 경우는 pH $4.0{\sim}6.0$에서 $12.1{\sim}19.5%$였으며, DH가 24.3%인 경우는 pH $3.0{\sim}5.0$에서 $34.7{\sim}36.4%$로 가수분해도가 높을수록 고농도 heme-iron의 분리시 최적 PH 범위가 산성 영역으로 이동되었으며, 이 영역의 pH에서 peptide의 용해도 증가로 분리도가 증가되었다. 가수분해액으로부터 분리된 heme-iron의 분자량은 약 1 kDa정도로 hematin과 유사한 분리패턴을 보였다. Pilot scale로 제조한 고농도 heme-iron 제품에서의 heme-iron 함량은 27.1%, heme-iron/peptide 비는 38.7%, 생산수율은 9.3%이었다.

Effects of hemoglobin (Hgb) concentration and degree of hydrolysis (DH) of Hgb on the separation of heme-iron were examined to produce highly enriched heme-iron from Hgb hydrolysate. Separation efficiency of Hgb hydrolysate with different DH was studied at wide pH range (pH $1.0{\sim}11.0$). Separation efficiency expressed as heme-iron/peptide ratio increased with decreasing Hgb concentration. When 5% Hgb (pH 10.0) was hydrolyzed using commercially available Esperase for 5 h at $50^{\circ}C$, DH was 25%. The precipitation of heme-iron-enriched peptides were remarkably high at pH range $3{\sim}6$. Optimal pH range for heme-iron with high heme-iron/peptide ratio shifted to acidic pH with increasing DHs of Hgb. The enriched heme-iron fraction in the precipitates showed a single band through urea-SDS-PAGE, with a molecular mass of 1 kDa. In the dry heme-iron product produced in a pilot bioreactor, content of heme-iron and heme-iron/peptide ratio were 27.1 and 38.7%, respectively, and production yield was 9.3%.