한국산 무 (Raphanus sativus L.) anionic peroxidase를 이용한 당 정량법 연구

Glucose Determination by Using Korean Radish Anionic Peroxidase

한국산 무(Raphanus sativus L.)로부터 황산암모늄 분별침전과 CM-cellulose ion exchange chromatography를 사용하여 anionic peroxidase(POD)를 분리하였다. 분리된 한국산 무 anionic POD를 비색효소로, o-tolidine 혹은 4-aminoantipyrine/diethylaniline(4AA/DEA)을 비색기질로 사용하여 630nm에서의 흡광도를 측정함으로써 당 정량반응을 실시하였다. 한국산 무 anionic POD는 비색기질로 4AA/DEA을 사용한 경우 o-tolidine을 사용했을 때 보다 더 높은 비색 반응성을 나타내었다. Glutosr의 농도증가에 따른 검정곡선을 작성하였을 때 o-tolidine과 4AA/DEA을 사용한 경우 상관계수가 각각 r=0.9983과 r=0.9963로서 두 가지 방법의 검정곡선이 모두 좋은 직선성을 보여 주었다. 한국산 무 anionic POD와 horseradish POD의 기질산화에 대한 반응성을 비교하기 위하여 o-dianisidine과 guaiacol Km값을 조사한 결과, 한국산 무 anionic POD가 horseradish POD보다 o-dianisidine에 대해 약 40배, guaiacol 대하여 약 2배의 높은 기질 반응성을 나타내었다. 이러한 결과들은 한국산 무 anionic POD를 비색효소로 사용하여 검출감도가 높은 당 정량용 진단시약을 개발할 수 없음을 보여준다.

Anionic peroxidases (POD) were isolated from Korean radish (Raphanus sativus L.) root by using fractionation with $(NH_4)_2SO_4$ and CM-cellulose ion exchange chromatography and used as the colorimetric enzyme for glucose determination. The chromogen used in this work was o-tolidine or 4-aminoantipyrine/diethylaniline (4AA/DEA) and the colored products were measured at 630 nm. Korean radish anionic POD showed much better colorimetric reaction of glucose determination with 4AA/DEA than with o-tolidine. The r values of calibration curve for glucose determination by o-tolidine and 4AA/DEA were 0.9983 and 0.9963, respectively. In order to compare the reactivity for substrate oxidation by Korean radish POD and horseradish POD, the Km values against o-dianisidine and guaiacol were measured. Korean radish POD had about 40 fold higher affinity for o-dianisidine and 2 fold higher affinity for guaiacol as revealed by Km values. These results showed that Korean radish POD could be developed as the colorimetric diagnosis reagent for glucose determination with high sensitivity.