Electron Microscopic Study on the Role of Actin Filaments during the Formation of Bile Canaliculi in Isolated Rat Hepatocyte Culture System

흰쥐에서 분리 배양한 간세포의 담세관 형성에 있어서 액틴미세섬유의 역할에 관한 전자현미경적 연구

Bile canaliculi are the structure delivering bile secreted by hepatocytes into the bile passage. Bile secretion is mainly controlled by the cytoskeletal elements, mainly of actin in the microvilli, pericanalicular web. Most studies on the bile secretion have been done in viva situation, however, to control the various parameters in vitro culture system seem to be more useful. To set up an in vitro experimental system, the investigator isolated hepatocytes with an enzymatic method using a mixture of collagenase and hyaluronidase from normal Sprague-Dawley rat liver and cultured. Isolated hepatocytes were round and formed cords in culture. Microvilli covered the whole surface of hepatocytes. Bile canaliculi were formed between hepatocytes and were characterized by the presence of microvilli of various lengths and shapes mainly arising from small surface mounds. Actin filament core in the microvilli and pericanalicular actin web were incomplete. After cytochalasin D treatment, cultured hepatocytes were round but the surface were irregular with surfacen blebs, folds and grooves. Microvilli on the surface were scarce. Bile canaliculi were markedly dilated often with the detached junctional complexes. Bile canaliculi lacks microvilli almost completely and extended into the pericanalirular cytoplasm showing complex vacuolar and tubular structures by transmission electron mciroscopy. Pericanalicular actin web, intermediate filaments were hardly identified. Subsurface actin filaments were scattered scarcely under the cell membranes. These results suggest that hepatocytes isolated from rats can survive and form bile canaliculi in culture and the actin filaments are involved in the formation and/or maintenance of the bile canaliculi.

간세포의 기능적 연구를 위한 배양계를 확립하기 위하여 Sprague-Dawley계 흰쥐의 간장에서 collagenase와 hyaluronidase의 혼합액을 이용하여 간세포를 분리하고 배양하여, 배양중인 간세포의 구조적인 변화와 담세관의 형성 과정을 확인하고, cytochalasin D를 배양계에 첨가한 경우 발생되는 간세포 및 담세관의 구조적인 변화를 살펴보아 다음과 같은 결과를 얻었다. 분리 배양한 흰쥐의 간세포는 원형이었고, 표면에 미세융모를 가지고 있었으며. 배양중 서로 부착되어 세포띠를 형성하였다. Cytochalasin D처리후 간세포의 표면은 미세융모가 소실되어 편평하게 변화되었으며, 소포성 돌출물이 자주 관찰되었다. 담세관은 부착된 간세포의 사이에서 형성되었으며, 간세포 표면의 작은 융기에서 기시하는 다양한 길이 및 형태의 미세융모로 채워져 있었고, 양단에는 치밀결합 및 부착만 등으로 구성된 연접복합체가 존재하였다. Cytochalasin D 처리후 당세관의 내강은 팽창되었으며 미세융모는 소실되어 거의 존재하지 많았고, 양단에 존재하는 연접복합체는 파괴되어 간격이 벌어진 곳이 많았다. 담세관내에 존재하는 미세융모 속에 존재하는 액틴미세섬유심은 완전하게 형성되어 있는 경우, 불완전하게 적은 양만 존재하는 경우, 그리고 전혀 존재하지 않는 경우가 있었다. 담세관주변세포질에 존재하는 액틴미세섬유얼기의 형성은 불완전하여 부위에 따라 없는 곳도 있었다. Cytochalasin D처리후 담세관주변세포질의 액면미세섬유얼기는 존재하지 많았다. 이상의 결과로 흰쥐의 간장에서 분리한 간세포는 배양중 성장하면서 정상적인 담세관을 형성함을 알 수 있었으며, 담세관의 형성은 접착부위의 연접복합체의 형성 및 미세융모의 형성,담세관 내 액틴미세섬유심 및 담세관주변세포질내 액틴미세섬유얼기의 형성 등을 특정으로 하는 것으로 판단된다.