Purification of Urokinase and Pro-urokinase and Comparison of their Characteristics

유로키나제와 프로유로키나제의 정제 및 특성 비교

Characteristics and enzyme activity comparison was made between urokinase isolated from urine and pro-urokinase separated from CHO(Chinese Hamster Ovary) cell culture broth. Both of purified urokinase and pro-urokinase resulted 54Kd single band in electrophoresis. Urokinase which was proved as a single molecule by gel filtration showed two separated 33Kd and 21Kd bands by 2-mercaptoethanol reduction. Isoelectric forcusing resulted same pl value of 8.6 for both of them. N-terminal amino acid sequence of urokinase after 159th Ile was Ile-Gly-Gly-Glu-Phe-Thr-Thr-Ile-Glu which was different from another N-terminal sequence of Ser-Asn-Glu-Leu-His-Gln-Val-Pro-Ser-Asn. Thrombolytic activities of both of them were propotional to the enzyme concentration. Urokinase showed thrombolytic activities in an short period of reaction time. Pro-urokinase, however, showed high thrombolytic activity for 2 hours or longer period of reaction time.

본 연구에서는 인뇨에서 분리 정제한 urokinase와 유전자 재조합 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 배양액으로부터 분리 정제한 pro-urokinase의 물리화학적 특성과 혈액 내에서의 효소활성을 비교 분석하였다. Two chain form인 urokinase와 single chain form인 pro-urokinase를 각각 순수 분리한 후, electrophoresis한 결과 모두 54 kd의 단일밴드를 나타냈다. 그러나 urokinase는 환원시켰을 때 33 kd과 21 kd으로 나누어짐을 확인하였으나 gel filtration결과 분자량이 54 kd 정도임을 확인되어 용액 내에서 단일분자로 존재함을 알 수 있었다. Urokinase와 pro-urokinase가 물리화학적으로 거의 동일한 구조를 가졌다는 사실은 isoelectro focusing에 의한 pI 값이 모두 8.6으로 동일하다는 점과, 아미노산 조성을 분석한 결과 동일하다는 사실로도 알 수 있었다. N-terminal 아미노산 서열을 분석한 결과, urokinase는 이중사슬구조이므로 N-terminal이 두개 존재하여 pro-urokinase의 서열(Ser-Asn-Glu-Leu-His-Gln-Val-Pro-Ser-Asn)이외에도, 159번째의 Ile다음부터 Ile-Gly-Gly-Glu-Phe-Thr-Thr-Ile-Glu가 같은 peak로 나타남을 확인하였다. 효소활성 조사결과 pro-urokinase와 urokinase는 모두 농도 의존적으로 혈전용해 활성을 보였으나, 특이하게도 짧은 반응시간동안에는 urokinase가 동일 농도 하에서 강한 활성을 보인 반면, 2시간이 지난 오랜 반응조건에서는 pro-urokinase가 혈전용해활성을 나타내었다. Fibrinogen에 대한 분해활성을 조사한 결과, urokinase는 혈장 내 fibrinogen을 상당히 손상시키지만, pro-urokinase는 거의 영향을 주지 않아 혈전선택성이 매우 좋음을 알 수 있었다.