Abstract
This study was to investigate whether the viability of Hanwoo IVM/IVF/IVC blastocysts was maintained after vitrification and thawing. In vitro produced Hanwoo blastocysts were vitrified by two-step method: equilibrated in EG20 for 3 min, and then exposed in EFS40 ［40% ethylene glycol (EG), 18% ficoll and 10.26% sucrose in mDPBS containing 10% FBS ］and vitrified in L$N_2$for 30 - 45 sec. After thawing, in vitro survival was assessed as the re-expanded and hatched rates at 24 hand 48 h, respectively. The results obtained in these experiments were summarized as follows: From the 12 replicates, 52.5% of Hanwoo blastocysts were produced in vitro at day 7 after IVF. When the effects of freezing solution to the embryo survival were examined, there is no significant toxicity in exposure (100.0, 73.8%) compared to that af control group (100.0, 87.0%). However, when embryos were vitrified, high survival (86.2, 55.4%) was obtained although it was significantly lower than those of exposure and control group (p＜0.05). When the in vitro survival of vitrified embryos according to developmental stage and culture day were examined, it showed that more advanced embryo stage exhibited a significantly higher survival rate irrespective of culture day (p＜0.05). Also, even in the same development stage, the in vitro survival of day 7 embryos (re-expanded: 75.0~87.5%, hatched: 21.4~66.7%) was higher than those of day 8 embryos(re-expanded: 58.6~78.3%, hatched: 10.3~52.2%). Therefore, these results suggested that in vitro produced Hanwoo blastocysts can be successfully cryopreserved by simple two-step vitrification method using EFS40 freezing solution, particularly at the expanded and early hatching blastocyst stage regardless of embryo culture duration (day 7 or day 8 after IVF).
본 실험은 체외 생산된 한우 배반포기배의 생존능이 초자화동결 융해 후에도 유지될 수 있는지를 조사하고자 실시하였다. 한우 배반포기배는 2 단계로 초자화동결되었는데, EG20에 3분간 평형 그리고 EFS40에 노출한 후 L$N_2$에 초자화되기까지 30~45 초간 처리하였다. 체외에서의 생존능은 융해 후 24시간째의 re-expanded 와 48시간째의 hatched 발달율로 조사하였다. 그 결과는 다음과 같다. 12번의 반복실험으로부터 체외 수정 후 체외 배양 7일째에 52.5% 의 배반포기배가 생산되었다. 배의 생존에 동결액이 미치는 영향을 조사하였던 바, 대조군 (100.0, 87.0%) 과 비교하였을 때 동결액 노출군 (100.0, 73.8%) 에서 유의한 독성은 확인되지 않았다. 그러나, 배반포기배가 초자화동결되었을 때, 높은 생존능(86.2, 55.4%) 은 확인되었지만 그 결과는 노출군과 대조군에 비교하여 볼 때 유의하게 낮은 것이었다.(p＜0.05). 배 발달단계와 배양날짜가 초자화동결된 난자의 생존에 미치는 영향을 조사하였던 바, 배양날짜와 상관없이 빠르게 발달한 난자군에서 유의하게 높은 생존능이 있음을 알 수 있었다 (p＜ 0.05). 또한, 같은 발달단계라 하더라도, 배양 7일째 배의 (re-expanded: 75.0~87.5%, hatched: 21.4~66.7%) 생존능이 배양 8일째 배의 (re-expanded: 58.6~78.3%, hatched: 10.3~52.2%) 생존능보다 높다는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과에서 볼 때 체외에서 생산된 한우 배반포기배는 EFS40 동결액을 사용하는 간편 2 단계 초자화방법으로 성공적으로 동결되어질 수 있으며 특히 배양 7일과 8일째의 expanded 배반포기배와 early hatching 배반포기배에서 더욱 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.